基因定點精準(zhǔn)靶向修飾

基因定點精準(zhǔn)靶向修飾第1頁/共33頁1CRISPR-Cas概述1987年，日本大阪大學(xué)（OsakaUniversity）在對一種細(xì)菌編碼的堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）基因進(jìn)行研究時，發(fā)現(xiàn)在這個基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段，這些片段是由簡單的重復(fù)序列組成的，而且在片段的兩端還存在一段不太長的特有的序列。2013以后，研究者們在包括《science》和《naturebiotechnology》等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹CRISPR-Cas系統(tǒng)，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實現(xiàn)精確的基因修飾。第2頁/共33頁1CRISPR-Cas概述CRISPR-Cas：一種來源是細(xì)菌獲得性免疫的由RNA指導(dǎo)Cas蛋白對靶向基因進(jìn)行修飾的技術(shù)。第3頁/共33頁CRISPR-Cas主要由兩部分組成：識別切割1CRISPR-Cas概述第4頁/共33頁1.1CRISPR結(jié)構(gòu)CRISPR：（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）

CRISPR是一個特殊的DNA重復(fù)序列家族,廣泛分布于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中。CRISPR位點通常由短的高度保守的重復(fù)序列(repeats)組成,重復(fù)序列的長度通常21~48bp,重復(fù)序列之間被26~72bp間隔序列(spacer)隔開。CRISPR就是通過這些間隔序列（space）與靶基因進(jìn)行識別。第5頁/共33頁1.1CRISPR結(jié)構(gòu)第6頁/共33頁1.2Cas家族Cas（CRISPRassociated）：

存在于CRISPR位點附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在guideRNA引導(dǎo)下對靶位點進(jìn)行切割。它與folk酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。第7頁/共33頁2CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas是很多細(xì)菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)，通過對入侵的病毒和核酸進(jìn)行特異性的識別，利用Cas蛋白進(jìn)行切割，從而達(dá)到對自身的免疫。第8頁/共33頁2CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)第9頁/共33頁2CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)第10頁/共33頁2CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas系統(tǒng)賦予原核細(xì)胞針對外源DNA特異性免疫,而這種特異性是由間隔序列（spacer）決定的。在宿主防御噬菌體攻擊中，針對自然界中龐大的噬菌體種群，細(xì)菌進(jìn)化了CRISPR介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫。這種免疫功能的發(fā)揮是由CRISPR間隔序列的動態(tài)性變化，即通過增加或刪除間隔序列（spacer）來實現(xiàn)的。第11頁/共33頁2CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求最主要的要求：PAM（protospacer-adjacentmotif）為NGG。第12頁/共33頁2CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求在人類基因組中，平均每8bp就出現(xiàn)一個NGGPAM。第13頁/共33頁2CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求第14頁/共33頁3CRISPR-Cas系統(tǒng)介導(dǎo)基因修飾第15頁/共33頁3.1dual-RNA：Cas介導(dǎo)編輯模板替換2013年1月29日在《nature

biotechnology》上發(fā)表的《RNA-guidededitingofbacterialgenomesusingCRISPR-Cassystems》一文中，作者利用CRISPR-Cas系統(tǒng)用設(shè)計好的DNA模板替換的相應(yīng)基因來達(dá)到基因的定向修飾。第16頁/共33頁3.1dual-RNA：Cas介導(dǎo)編輯模板替換第17頁/共33頁3.2sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾2013年1月29日在《nature

biotechnology》上發(fā)表的《efficientgenomeeditinginzebrafishusingaCRISPR-Cassystem》一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指導(dǎo)Cas9內(nèi)源性核酸酶對斑馬魚胚胎基因進(jìn)行修飾。第18頁/共33頁3.2sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾第19頁/共33頁3.2sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾第20頁/共33頁3.2sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾Cas9sg-RNA第21頁/共33頁2013年2月15日在《science》上發(fā)表的《MultiplexGenomeEngineeringUsingCRISPR/CasSystems》一文中，作者利用一個包含兩個靶向不同基因的spacers的crRNA實現(xiàn)了同時對兩個基因進(jìn)行編輯。3.3cr-RNA：Cas介導(dǎo)雙基因修飾

第22頁/共33頁3.3cr-RNA：Cas介導(dǎo)雙基因修飾

第23頁/共33頁4CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析這是一項靶向基因修飾的革新技術(shù)，一項極具有可能獲得諾貝爾獎技術(shù)。第24頁/共33頁4CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析2013年4月12日在《cellstemcell》上發(fā)表的《EnhancedEfficiencyofHumanPluripotentStemCellGenomeEditingthroughReplacingTALENswithCRISPRs》一文中，作者利用TALENs和CRISPRs對同一基因進(jìn)行修飾，效率分別為0%-34%和51%-79%。第25頁/共33頁4CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析而且從實際應(yīng)用的角度來說，CRISPRs比TALENs更容易操作，因為每一對TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替換20個核苷酸就行。第26頁/共33頁4CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析只需合成一個sgRNA就能實現(xiàn)對基因的特異性修飾，Cas蛋白不具特異性。編碼sgRNA的序列不超過100bp，因此比構(gòu)建TALENs和ZFNs更簡單方便。較短的sgRNA序列也避免了超長、高度重復(fù)的TALENs編碼載體帶來的并發(fā)癥。技術(shù)優(yōu)勢第27頁/共33頁1987年，當(dāng)時有一個科研小組觀察到，在細(xì)菌編碼的一個基因末端有一段非常奇怪的重復(fù)序列。越來越多的生物學(xué)家們開始從事微生物基因組的解析工作，這時他們也都發(fā)現(xiàn)了這種奇怪的現(xiàn)象在大約40%的細(xì)菌和90%的古細(xì)菌（archaea）中都能夠觀察到這種現(xiàn)象，于是科學(xué)家們給這種序列取了一個名字，叫作CRISPR，即成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）。在2005年，有3個生物信息學(xué)課題組報道稱，這些CRISPR序列里的空格DNA總是能夠與噬菌體的DNA序列互補(bǔ)、匹配美國馬里蘭州美國國家癌癥生物技術(shù)信息中心的EugeneKoonin等人提出了一個新想法，即細(xì)菌和古細(xì)菌能夠吸收噬菌體的DNA，然后將其留作己用，并轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的RNA，與入侵的外源DNA結(jié)合，這有點類似于真核生物采用的RNA干擾（RNAinterference,RNAi）機(jī)制。Danisco公司的研究人員RodolpheBarrangou、PhilippeHorvath等人在2007年發(fā)現(xiàn)，他們只要對嗜熱鏈球菌進(jìn)行一番遺傳學(xué)改造，插入或者去掉幾個與噬菌體序列互補(bǔ)的空格DNA片段，就可以改變細(xì)菌對噬菌體的免疫力。發(fā)現(xiàn)歷史第28頁/共33頁Doudna和EmmanuelleCharpentier則分別把工作往前推進(jìn)了一步,依賴Cas9蛋白的CRISPR系統(tǒng)要比其它CRISPR系統(tǒng)更簡單。Doudna和Charpentier的課題組都必須證明，他們能夠非常精確地控制Cas9蛋白的切割位點，確保不會發(fā)生脫靶的情況。Doudna的博士后MartinJinek提出了將tracrRNA和空格RNA組合起來，形成一個所謂的“向?qū)NA分子（single-guideRNA）”的想法，并且他們課題組已經(jīng)在去年成功地構(gòu)建出了好幾個這種向?qū)NA，而且將其與Cas9蛋白混合在一起，成功地對特定的DNA位點進(jìn)行了切割（Science,17August2012,p.816）。第29頁/共33頁十年前，科學(xué)家們開發(fā)出了鋅指核酸酶（zincfingernucleases），該蛋白擁有兩個人工組合在一起的結(jié)構(gòu)域，它可以依靠其中的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-bindingdomains）結(jié)合到基因組中特定的位點上，然后再依靠其中的酶切結(jié)構(gòu)域?qū)⒃撐稽c的DNA鏈切斷。該技術(shù)誕生之后也掀起了一股熱潮，甚至有人成立了公司，專門以該技術(shù)為平臺開發(fā)艾滋病治療手段（Science,23December2005，p.1894）。鋅指核酸酶第30頁/共33頁最近又出現(xiàn)了另外一種基因組改造工具，那就是TALEN人工核酸酶，這是一種比鋅指核酸酶更方便的基因組定向改造工具，并且有可能會徹底取代鋅指核酸酶（Science,14December2012,p.1408