金霉素小球藻實(shí)驗(yàn)方法

測(cè)量指標(biāo)：光密度與藻類生長(zhǎng)量的對(duì)應(yīng)關(guān)系藻類生長(zhǎng)濃度測(cè)定將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的蛋白核小球藻和斜生柵藻接種到100mL錐形瓶中，試驗(yàn)初始藻細(xì)胞密度約？個(gè)?mL-1,總體積100mL,抗生素濃度設(shè)置分別為0、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160mg?L-1,各濃度均設(shè)3個(gè)平行.于抗生素中暴露0h,24h,48h，96h，后分光光度法計(jì)量細(xì)胞數(shù)量藻類葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定藻類在抗生素在暴露接觸96小時(shí),通過便攜式葉綠素?zé)晒鈨x進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定前避光15分鐘。超氧化物歧化酶測(cè)定超氧化物歧化酶Orgotein(SuperoxideDismutase,SOD),別名肝蛋白、簡(jiǎn)稱：SOD。SOD是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。對(duì)人體不斷地補(bǔ)充SOD具有抗衰老的特殊效果。有測(cè)定超氧化物歧化酶的試劑盒超氧化物歧化酶測(cè)定前處理：藻類在抗生素在暴露接觸96小時(shí)，進(jìn)行測(cè)定超氧化物歧化酶前，先要進(jìn)行藻類的收集，本研究采取的方法是告訴離心收集法：吸取25ml的藻液，溫度4°C,轉(zhuǎn)速10000R\min，離心10min,倒掉上清液，加入0.05M磷酸緩沖液5mL(pH7.8)0.05mol/LNaHPO溶液：稱取NaHPO.12HO17.9g溶于1L水中TOC\o"1-5"\h\z242420.05mol/LNaHPO溶液：稱取NaHPO.2HO7.8g溶于1L水中24242pH7.8的0.05M磷酸緩沖液：0.05mol/LNaHPO溶液8.5mL+0.05mol/LNaHPO溶2424液91.5mL利用快速混勻器將藻重新懸浮于磷酸緩沖液中，利用快速冷凍解凍法(放在-80C冰箱中10mim，常溫自來水沖洗？)破壞藻類細(xì)胞，該過程重復(fù)三次，然后再溫度為4攝氏度，轉(zhuǎn)速10000R\min，離心8分鐘收集上清液用于超氧化物歧化酶的測(cè)定。測(cè)定步驟分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至560nm，蒸餾水調(diào)零測(cè)定前將試劑1，試劑2和試劑4在25C水浴5min以上在EP管中加入下列試劑注意：應(yīng)該注意的是試劑2為懸濁液，注意混勻后加入試劑3為酶，不可冷凍，使用時(shí)在冰上放置，必須最后加入每個(gè)樣品有個(gè)對(duì)照管，空白1和空白2各需要做1或2管充分混勻，室溫靜置30min后加入1mL玻璃比色皿，在560nm測(cè)定各管的吸光值試劑名稱測(cè)定管對(duì)照管空白管1空白管2試劑1（口）240240240240試劑2（口）510510510510試劑4（口）180180180180樣品（山9090蒸餾水（口）69096?試劑3（山63.SOD活性計(jì)算按照細(xì)菌或者細(xì)胞個(gè)數(shù)計(jì)算SOD活力（U/104cell）二［抑制百分率/（1-抑制百分率）*V反總］/（500*V樣/V總樣）*樣本稀釋倍數(shù)=0.0228*抑制百分率/（1-抑制百分率）*抑制百分率抑制百分率抑制百分率二（小-△A）/△A*100%盡量使抑制百分率在空白測(cè)定空白30%-70%范圍內(nèi)，越靠近50%約準(zhǔn)確，否則需要調(diào)整加樣量后重新測(cè)定。丙二醛（MDA）生物體內(nèi)，自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為丙二醛，會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性。MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷因此在植物衰老生理和抗性生理研究中MDA含量是一個(gè)常用指標(biāo)，可通過MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測(cè)定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性。測(cè)定原理：丙二醛在高溫及酸性條件下可與2-流代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)產(chǎn)生紅棕色的產(chǎn)物三甲川，該物質(zhì)在523mm處有一吸收高峰，并在660mm處有較小的吸收。根據(jù)532nm的消光值可以計(jì)算出溶液中丙二醛的含量，醛和可溶性糖對(duì)此反應(yīng)有干擾，在450nm處有一吸收峰，可用雙組分光光度法加以排除需要的試劑有：5%三氯醋酸（TCA）0.5%流代巴比妥酸（用三氯醋酸溶解定容）0.05mol/L磷酸緩沖溶液pH7.8檢測(cè)過程：在提取液中加入5mL的5%的流代巴比妥酸，搖勻；將試管放入沸水中水浴10min（自試管內(nèi)溶液中出現(xiàn)小氣泡開始計(jì)時(shí)）到時(shí)間后，立即將試管取出并放在冷水中水??；待試管內(nèi)溶液冷卻后。3000r離心15min，取上清液并量其體積，以5%流代巴比妥酸溶液為空白測(cè)523nm,600nm,450nm處的消光值公式：MDA（mmol/gFW）二[6.452*（D-D）-0.559*D]*V/V*W523600450ts式中vt：提取液總體積（mL）Vs：測(cè)定用提取液體積（mL）FW：樣品鮮重（是液體的怎么計(jì)算）前處理：藻類在抗生素在暴露接觸96小時(shí)，進(jìn)行測(cè)定超氧化物歧化酶，丙二醛，測(cè)定超氧化物歧化酶丙二醛前，先要進(jìn)行藻類的收集，本研究采取的方法是告訴離心收集法：吸取25ml的藻液，溫度4°C,轉(zhuǎn)速10000R\min，離心10min,倒掉上清液，加入0.05M磷酸緩