水中微生物檢測

水中微生物檢測水中微生物檢測（新國標(biāo)方法）總大腸菌群/大腸埃希氏菌，耐熱大腸菌群固定底物技術(shù)酶底物法介紹

總大腸菌群/大腸埃希氏菌

及耐熱(糞)大腸菌群

固定底物技術(shù)酶底物法微生物檢測的重要性地震等自然災(zāi)害過后水體中會被大量微生物所污染，特別是糞便污染，如水體中含有腸道病原菌株，并被人飲用則會爆發(fā)嚴重疾病如泌尿系感染、菌血癥和腦膜炎，少數(shù)腸道病原菌株可引起急性腹瀉。通常人們用投放含氯消毒劑進行消毒，但消毒效果如何還需要通過檢測水體中是否含有總大腸菌群和大腸埃希氏菌來判斷。指示菌的方法學(xué)定義總大腸菌群（TotalColiforms)

大腸菌群系指一群在37℃培養(yǎng)24h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌群主要來源于人畜糞便，具有指標(biāo)菌的一般特征故以此作為糞便污染指標(biāo)評價飲水的衛(wèi)生質(zhì)量。耐熱大腸菌群(ThermotolerantColiforms)，原名：糞大腸菌群（FecalColiforms)

用提高培養(yǎng)溫度的方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群區(qū)分開，在44.5℃仍能生長的大腸菌群，稱為糞大腸菌群。是水體受人畜糞便污染的比較直接指標(biāo)。大腸埃希氏菌（大腸桿菌，E.Coli.)

大腸埃希氏菌是指能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）分解ONPG（Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside）使培養(yǎng)液呈黃色，能產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）分解MUG（4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide）使培養(yǎng)液在波長366nm紫外光下產(chǎn)生熒光的細菌。大腸埃希氏菌是糞大腸菌群的組成部分，是水體受人畜糞便污染的最直接指標(biāo)，水中含有大腸埃希氏菌提示有糞便污染。

背景知識大腸菌群，耐熱大腸菌群，大腸埃希氏菌

耐熱大腸菌群大腸埃希氏菌大腸菌群目前的糞大腸菌群檢測方法是實際上是檢測耐熱大腸菌群而不是大腸埃希氏菌。

有關(guān)文獻報道的試驗結(jié)果表明,有15%的陽性耐熱糞大腸菌群實際上屬于總大腸菌群而不是大腸埃希氏菌。這種情況的發(fā)生多數(shù)是由于耐熱的克雷伯氏菌普遍存在于自然環(huán)境中，而非來源于人畜糞便，因此與人類疾病的產(chǎn)生也沒有絕對的關(guān)聯(lián)。

同時，（用上述方法檢測）會有10%的假陰性結(jié)果，是因為大腸埃希氏菌屬有10％不會產(chǎn)氣（注1）。

注1：目前的糞大腸菌群檢測方法，產(chǎn)酸產(chǎn)氣是預(yù)試驗的陽性判斷指標(biāo)。糞便污染指示菌比較

總大腸菌群耐熱(糞)大腸菌群大腸埃希氏菌腸球菌亞硫酸鹽還原菌包含菌屬埃希氏菌屬、檸檬酸菌屬、克雷伯菌屬、腸桿菌屬（也包括沙雷菌屬和哈夫尼亞菌屬）主要是埃希氏菌屬和耐熱克雷伯菌屬大腸埃希氏菌糞腸球菌、屎腸球菌、耐久腸球菌和海氏腸球菌等亞硫酸鹽還原菌來源可來自人畜糞便，環(huán)境中自然存在主要來自于溫血動物糞便，也可來自環(huán)境主要來自溫血動物和人的糞便主要來自溫血動物和人的糞便主要來自溫血動物和人的糞便作為糞便污染指示菌的意義水處理的指示菌,不能作為消毒效果的指示菌比較直接的指示菌指示糞便污染的最理想指標(biāo)、作為消毒效果的指示菌用于輸配水系統(tǒng)維修后或新輸配水管線鋪設(shè)后水質(zhì)的檢測、用于飲用水中大腸桿菌檢測有爭議的糞致病菌指標(biāo)為間歇性糞便污染的指標(biāo)、過濾效果評價的指標(biāo)我國水質(zhì)微生物指標(biāo)(細菌)

標(biāo)準指標(biāo)菌檢測量GB5749-2006,生活飲用水標(biāo)準菌落總數(shù),總大腸菌群,大腸埃希氏或菌耐熱大腸菌菌落總數(shù):1ml;大腸菌100mlCJ/T206—2005城市供水水質(zhì)標(biāo)準細菌總數(shù),總大腸菌群、耐熱大腸菌細菌總數(shù)1ml,總大腸菌群/耐熱大腸菌群:100mlGB3838-2002,地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準糞(耐熱)大腸菌群1LGB/T14848-93地下水質(zhì)量標(biāo)準

GB9667-1996,游泳場所衛(wèi)生標(biāo)準細菌總數(shù)、總大腸菌群細菌總數(shù)1ml;總大腸菌群1L檢測方法多管發(fā)酵法（MultipleTubeFermentation,MTF)濾膜法（MembraneFiltration,MF)固定底物技術(shù)酶底物法(DefinedSubstrateTechnology,DST)酶底物法(EnzymeSubstrateTest,EST)

檢測方法多管發(fā)酵法（MTF）–共需3-5天時間以100mL水樣中大腸菌最可能數(shù)(mostprobablenumber,MPN)表示

培養(yǎng)基制備>試管培養(yǎng)（22－26小時）陰性結(jié)果（無產(chǎn)酸，產(chǎn)氣）產(chǎn)酸，產(chǎn)氣平板培養(yǎng)18－24小時革蘭氏染色，鏡檢觀察菌落形態(tài)，挑取特征菌落

證實試驗（培養(yǎng)24±2h，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，即證實有總大腸菌群存在）檢測方法濾膜法（membranefiltration,MF)—共需2-3天時間用孔徑為0.45μｍ的微孔濾膜過濾水樣，細菌被截留在濾膜上，將濾膜貼在選擇性培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后，計數(shù)生長在濾膜上的典型大腸菌群菌落數(shù),計數(shù)單位為菌落形成單位CFU(colonyformingunit)儲備培養(yǎng)基的制備>過濾（需器械滅菌等）>培養(yǎng)（22-24H）

陰性結(jié)果(無典型菌落）

革蘭氏染色鏡檢

觀察菌落形態(tài),挑取特征菌落

證實試驗（培養(yǎng)24±2h，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，即證實有總大腸菌群存在）

酶底物法總大腸菌群

陽性反應(yīng)原理β-半乳糖醛苷β-半乳糖苷酶酶底物法大腸埃希氏菌陽性反應(yīng)原理

β-葡萄糖醛酸酶4-甲基-傘形葡萄糖苷酸1,方法本標(biāo)準方法采用固定底物技術(shù)酶底物法DefinedSubstrateTechnology,DST2，培養(yǎng)基：采用MinimalMediumONPG-MUG，簡稱MMO-MUG培養(yǎng)基3,優(yōu)點假陽性,假陰性底操作簡單,快速定性,定量（51孔/97孔定量盤法）50多個國家和組織認證世界衛(wèi)生組織WHO,美國EPA,水與廢水標(biāo)準檢驗法…….《生活飲用水標(biāo)準檢驗方法》對酶底物法定義科立得

應(yīng)用飲用水

源水

瓶裝水

再生水

廢水

食品水畜牧用水

醫(yī)療用水

收錄于“標(biāo)準測試法”內(nèi)

–

APHA(美國公共衛(wèi)生協(xié)會),

USEPA,AOAC,USNCIMS,UKDWI,IBWA,WHO……

假陽性比較：

vs濾膜法假陽性比較：vs濾膜法*Jacobsetal,AEM,1986.**Frickeretal,WaterRes.,1997報告者：英國泰晤士水務(wù)樣品來源：泰晤士河，樣品數(shù)450個假陽性比較vs濾膜法*Jacobsetal,AEM,1986.**Frickeretal,WaterRes.,1997

產(chǎn)生的原因傳統(tǒng)方法培養(yǎng)基非選擇性,會產(chǎn)生相似結(jié)果引起假陽性反應(yīng)培養(yǎng)基污染樣品交叉污染操作誤差

結(jié)論試驗證明可以用Colilert取代濾膜法進行大腸菌群和大腸埃希氏菌，還證明了Colilert—DST酶底物法是不受化學(xué)、外力等外界因素變化而變化的。假陰性比較：

vs濾膜法及多管法*Jacobsetal,AEM,1986.**Frickeretal,WaterRes.,1997假陰性率產(chǎn)生的原因由于是非特異培養(yǎng)基所以會有雜菌干擾清潔劑、鹽、抗生素、毒素、溫度等原因會造成抑制反應(yīng)非發(fā)酵大腸菌膜過濾法的問題–過濾膜的損壞m-endoMF*MTF*MLSBMF**Colilert**0%5%10%15%20%25%30%35%40%*Jacobsetal,AEM,1986.**Frickeretal,WaterRes.,1997實驗步驟：Colilert對比濾膜法濾膜法72步科立得:5步實驗步驟：97孔定量盤法vs多管發(fā)酵測試時間比較表經(jīng)濟成本分析傳統(tǒng)方法科立得固定設(shè)備無菌室、顯微鏡、抽濾設(shè)備等封口機、紫外燈耗材濾膜、平皿、試管、總大腸菌群的培養(yǎng)基、大腸埃希氏菌培養(yǎng)基科立得、定量盤效率和人力2-3人，3-5天1人，1天定性檢測操作示范

－2步法加入科立得試劑，搖晃至溶解

36C培養(yǎng)24小時，判斷結(jié)果:1,無顏色變化－陰性2,黃色－總大腸菌群陽性3，黃色且熒光－大腸埃希氏菌陽性44.5℃培養(yǎng)24小時,判斷結(jié)果：1、無顏色變化－陰性2、黃色－糞大腸菌群陽性定量檢測（51孔定量盤）－5步法加入科立得試劑后，搖晃至溶解

將Colilert溶液倒入51孔（或97孔）定量盤Quanti-Tray?內(nèi)將定量盤Quanti-Tray?放入程控定量封口機Sealer封口36℃或44.5℃培養(yǎng)24后，計算呈陽性反應(yīng)的格子，然后對照MPN表計數(shù)定量檢測（51孔定量盤）－5步法固定底物技術(shù)酶底物法科立得－所需試劑及設(shè)備定性

科立得試劑取樣瓶（可用玻璃瓶替代）定量

科立得試劑取樣瓶（可用玻璃瓶替代）51孔/97孔定量盤程控定量封口機Colilert使用總結(jié)檢測指標(biāo)培養(yǎng)溫度(℃)定性檢測定量檢測(100ml)總大腸菌群和大腸埃希氏菌(同時)36±1黃色:總大腸菌群陽性黃色+熒光:大腸埃希氏菌51孔:1-200MPN97孔:1-2419MPN糞(耐熱)大腸桿菌44.5黃色:糞(耐熱)大腸菌群陽性51孔:1-200MPN97孔:1-2419MPN科立得市場占有率美國的市場占有率為95%歐洲的市場占有率為90%全國有20余家環(huán)境監(jiān)測站（如北京、上海、四川、廈門、鄭州、沈陽等）、40余家自來水公司、35家省市級疾病預(yù)防控制中心及水文站應(yīng)用案例2004年非典—愛德士捐贈科立得試劑給中國CDC及上海CDC抗拒非典2008年汶川地震—愛德士公司捐贈1000套科立得試劑到四川省CDC及環(huán)境監(jiān)測站2008年奧運會—協(xié)助北京自來水及北京CDC完成奧運安全供水任務(wù)與中國環(huán)境監(jiān)測站、上海環(huán)境監(jiān)測站及廈門環(huán)境監(jiān)測站做了對比實驗案例分析2004年非典—愛德士捐贈科立得試劑給中國疾病預(yù)防控制中心及上海中國疾病預(yù)防控制中心抗拒非典困難解決時間緊24小時出結(jié)果任務(wù)重操作簡便，無需判斷典型菌落，對實驗員專業(yè)水平