綜合性蛋白質(zhì)的分離提取SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳及Westen印跡課件

1、綜合性蛋白質(zhì)的分離提取SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳及Westen印跡課件綜合性蛋白質(zhì)的分離提取SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳及Westen一、目的與要求 應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡分析技術(shù)，分析經(jīng)SDS電泳分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜上的細胞特定蛋白成分。一、目的與要求二、實驗原理經(jīng)SDS分離后的蛋白質(zhì)樣品，通過電轉(zhuǎn)移固定在固相支持物（如：硝酸纖維素薄膜）上，固相支持物以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)。以固相支持物上的蛋白質(zhì)作為抗原，與相應(yīng)的抗體，即第一抗體起免疫反應(yīng)，再與酶、同位素或其它標記物標記的以第一抗體為抗原的第二抗體起反應(yīng)，采用底物顯色或放射自顯影等方法即可觀察分析電泳分離的特異蛋白質(zhì)成分。 綜合性蛋白質(zhì)的分離提取

2、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳及Westen印跡課件標記的二抗一抗蛋白膜標記的二抗一抗蛋白膜免疫印跡實驗包括5個步驟：1、固定：蛋白質(zhì)進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS- PAGE），并從膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素（Nitrocellulose，簡稱NC）簿膜上。2、封閉：用牛血清白蛋白或脫脂奶粉封閉膜，主要目的是為了減少特異抗體對膜上其它部位的非特異性吸附。3、第一抗體結(jié)合：特異性識別和結(jié)合抗原蛋白質(zhì)。4、第二抗體結(jié)合：對于第一抗體是特異性的并作為指示物。5、被適當保溫后的酶標記蛋白質(zhì)條帶，產(chǎn)生可見的、不溶解狀態(tài)的顏色反應(yīng)。免疫印跡實驗包括5個步驟：Western blotWestern blot三、操作步

3、驟1. 按照SDS要求，對樣品蛋白質(zhì)進行電泳分離。（第一部分已完成）2. 轉(zhuǎn)膜：從玻璃板內(nèi)取出凝膠，將凝膠在電轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡一下（先把Whatman 3MM濾紙及硝酸纖維素薄膜在電轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡10分鐘），按照下圖所示夾心方法把Whatman 3MM濾紙、凝膠、硝酸纖維素薄膜、石墨板依順序放好，操作時注意驅(qū)趕氣泡。電轉(zhuǎn)移條件為常溫1Am/cm2 恒流約1.5 hr。15層濾紙凝膠15層濾紙NC膜石墨板石墨板三、操作步驟15層濾紙凝膠15層濾紙NC膜石墨板石墨板戴手套，避免用手接觸濾紙、凝膠和膜，防止手上的油脂阻斷轉(zhuǎn)印。濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致。以適量的轉(zhuǎn)移Buffer室溫平衡濾紙、凝膠和膜

4、1530min，如果是PVDF膜，必須先用甲醇激活后浸泡。方向正確：凝膠在陰極，膜在陽極。排去濾紙、膠和膜間的氣泡。電轉(zhuǎn)時間：100V 1-2h,可根據(jù)蛋白分子量的大小靈活選擇。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，凝膠用考馬氏亮蘭染色以確定轉(zhuǎn)移效率。膜用麗春紅染色觀察蛋白分子量標準的位置。已用預(yù)染標準蛋白質(zhì)marker省略。2. 轉(zhuǎn)膜步驟戴手套，避免用手接觸濾紙、凝膠和膜，防止手上的油脂阻斷綜合性蛋白質(zhì)的分離提取SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳及Westen印跡課件 3. 封閉用5脫脂奶粉或3BSA（含0.1Tween20 TBS或PBS配制）。時間：室溫2h或4C過夜。 3. 封閉用5脫脂奶粉或3BSA（含0.1Twee

5、4. 免疫學(xué)檢測將硝酸纖維素薄膜與用封閉緩沖液適當稀釋的第一抗體37反應(yīng)約0.5 hr或4 反應(yīng)過夜，其間不停地在搖床上晃動。將硝酸纖維素薄膜在清洗緩沖液中晃動清洗30分鐘，每5 min換一次清洗緩沖液。取出膜，將硝酸纖維素薄膜與用封閉緩沖液適當稀釋的酶標記第二抗體37反應(yīng)約0.5 hr，或RT 1-2hr, 其間不停地在搖床上晃動。用pH6.8 的50mM Tris-HCl 清洗3次。根據(jù)二抗的標記形式選擇相應(yīng)的顯色或顯影系統(tǒng)對膜上的蛋白質(zhì)進行顯色或顯影。保存硝酸纖維素薄膜或拍照作記錄。 4. 免疫學(xué)檢測將硝酸纖維素薄膜與用封閉緩沖液適當稀釋的 顯色或顯影 顯色 辣根過氧化物酶：底物為DAB

6、 堿性磷酸酶：底物為BCIP/NBT 化學(xué)發(fā)光顯影 最常用。辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶有不同的發(fā)光底物（商品化產(chǎn)品）注意：化學(xué)發(fā)光前將膜用不含Tween20的TBS或PBS洗滌一次曝光的時間和顯影的時間根據(jù)實際情況而定。 顯色或顯影 顯色化學(xué)發(fā)光后的硝酸纖維素膜用Stripping Buffer（洗滌Buffer: 62.5mm pH6.7 的Tris-HCI含2SDS和100mm的 2ME ）洗滌后，再次經(jīng)BSA或脫脂奶粉溶液進行封閉，再用不同的一抗進行雜交，檢測其它蛋白的表達情況。一張膜可以重復(fù)使用34次。堿性磷酸酶顯色的膜不能再進行雜交。 5 膜的再利用化學(xué)發(fā)光后的硝酸纖維素膜用Stri

7、pping Buff四、結(jié)果 如果所檢測特異性蛋白存在，則會在相應(yīng)的位置上出現(xiàn)相應(yīng)條帶。五、應(yīng)用意義 Western blotting是用于分離蛋白質(zhì)的一種成熟的方法，它廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)特征和結(jié)構(gòu)的研究。四、結(jié)果是非題：采用醋酸纖維素薄膜或NC膜進行轉(zhuǎn)膜時，轉(zhuǎn)膜液的配制是有區(qū)別的。 正確Western blot 轉(zhuǎn)膜時，膜在陰極，凝膠在陽極。 錯誤Western blot實驗結(jié)束后，使用的任何膜都是可以重復(fù)使用的。 錯誤單選題：Wester blot時，37孵育一抗雜交時，敏感性會提高，同時會增高的有： （A）特異性（B）非特異性（C)可靠性 （D）獨特性 答案 B2. WB實驗中，如果將要使用生物素