新編-第九章基因診斷-精品課件

1、第九章 基因診斷第一節(jié)基因診斷的概念及常用技術基因診斷利用分子生物學技術，從DNA/RNA水平檢測基因的存在,分析基因的結構變異和表達狀態(tài)，從而對疾病作出診斷。一、基本概念二、基因診斷常用方法核酸分子雜交PCRDNA序列測定 DNA芯片技術(一)核酸雜交基本原理-核酸變性和復性理論 即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開，而在條件恢復后又可依堿基配對規(guī)律形成雙鏈結構。因此應用已知堿基序列的單鏈核苷酸片段作為探針，就可檢測樣本中是否存在與其互補的同源核苷酸序列。probeprobe核酸雜交的關鍵要素probe DNAtarget DNAsignal detection核酸雜交方法分類按作用

2、環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類型。固相雜交是將參加反應的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應核酸游離在溶液中。液相雜交所參加反應的兩條核酸鏈都游離在溶液中。固相雜交分類Southern 印記雜交Northern 印記雜交斑點雜交原位雜交Southern blot是最經典的基因分析方法，不但能檢出特異的DNA片段，而且能進行定量和測定分子量，可用于基因的酶切圖譜分析、基因突變分析等。Northern雜交用于RNA的檢測，能對組織細胞中總RNA或mRNA進行定性和定量分析。斑點雜交（Dot blot） 可用基因組中特定基因及其表達的定性及定量分析，方法簡單、快速靈敏、樣品用量少；其缺點是

3、不能鑒定所測基因的分子量，特異性不高，有一定比例的假陽性。原位雜交（Colony in situ hybridization） 可查明染色體中特定基因的位置，用于染色體疾病的診斷；原位雜交的結果是顯示有關核酸序列的空間位置情況，因此可檢出含核酸序列的具體細胞，細胞的具體定位，數(shù)目和類型，可檢出基因和基因產物的亞細胞定位。（二）利用PCR及結合其他技術進行基因診斷直接采用PCR進行基因診斷采用PCR產物的限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLPs）進行基因診斷采用PCR結合等位基因特異性寡核苷酸探針（ASO）斑點雜交進行基因診斷 *通過PCR產物的反相點雜交(RBD)進行基因診斷采用PCR產物

4、的單鏈構象多態(tài)性(SSCP)分析進行基因診斷采用PCR技術對靶核酸進行定量分析寡核苷酸雜交分析SNP和等位基因特異寡核苷酸雜交 （ASO）#（三） DNA序列測定 DNA序列測定是進行基因突變檢測的最直接、最準確的方法，可以確定突變的部位，突變的性質。（四 ） DNA芯片技術 應用DNA芯片，可以檢測基因的結構及其突變多態(tài)性，對基因表達的情況進行分析。二 基因診斷的特點高特異性高靈敏度獲得穩(wěn)定的結果早期快速適用性強，應用范圍廣第二節(jié) 遺傳病的基因診斷一、概述 人類的遺傳病達數(shù)千種地中海貧血在意大利等國家發(fā)病率達10鐮狀細胞貧血在美國黑人中發(fā)病率達14我國常見的遺傳性疾病有地中海貧血、異常血紅蛋

5、白病和血友病。有效治療難；通過基因診斷進行攜帶者篩查，產前早期診斷，降低發(fā)病率。二、鐮狀細胞貧血血紅蛋白?。ó惓Ｑt蛋白?。┘t細胞呈鐮刀狀，壽命短，引起溶血性貧血?；颊叨嘣诔赡暌郧八劳鯩st酶切位點(CCTNAGG)53正常基因53突變基因1.15kb1.35kb（一）鐮狀紅細胞貧血分子機制5 67-Pro GluGlu-CCT GAG GAG-5 67-Pro AlaGlu-CCT GTG GAG-（二）鐮狀細胞貧血的基因診斷方法限制性內切酶/Southern blot采集制備血液DNA內切酶Mst消化電泳轉膜32P標記的珠蛋白cDNA雜交放射自顯影+0.2kb1.15kb1.35kb正常人

6、突變攜帶著患者鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析PCR/限制性內切酶設計引物PCR擴增產物進行限制性內切酶酶切電泳EB染色直接觀察例：引物1：5-GGG CTG GGC ATA AAA GTCA-3引物2：5-AAT AGA CCA ATA GGC AGAG-3擴增產物294bp鐮狀細胞貧血的基因診斷方法引物1CCT GAG GAGCCT GTG GAG引物1引物2引物2294bp103bp191bpMst酶切位點(CCTNAGG)+103bp191bp294bp正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細胞貧血患者PCR產物的限制性酶切分析RT-PCR/序列分析采集制備血液RNART-PCR產物測序推

7、測氨基酸序列進行診斷鐮狀細胞貧血的基因診斷方法二、地中海貧血(Thalassaemia,簡寫thal或T)珠蛋白基因突變導致該多肽鏈的合成大為減少（）或完全缺失（0）珠蛋白合成速率降低，導致鏈和鏈合成的不平衡多余的珠蛋白鏈沉積在紅細胞膜上改變了膜的通透性和硬度導致溶血性貧血。高危人群地中海人、中東人、印度人、中國人；中國人群中又一廣東、廣西、四川、貴州等省發(fā)病率最高。缺乏有效治療措施。（一） 地貧病的分子基礎珠蛋白基因全長2053bp，含2個內含子（IVSI和IVS-II），3個外顯子。目前發(fā)現(xiàn)突變有百余種，中國人群發(fā)現(xiàn)約20種；一般對特定種族來說，90%的地貧基因僅由46種突變組成。（二）

8、地中海貧血的基因診斷PCR/ASO斑點雜交法合成2對PCR引物（擴增區(qū)段700bp和580bp，分別包含14種和1種可能突變）合成等位特異寡核苷酸(ASO)探針（46對，分別標記）制備DNA樣品PCR擴增斑點印跡雜交RFLP分析法三地中海貧血的基因診斷ac左側缺失4.2kb右側缺失3.7kbbbba2112N端1C端正常基因序列PCR擴增法定性分析左側缺失型基因序列右側缺失型基因序列ac擴增0.4kbab無擴增片段ab擴增1.2kb+0.4kb1.2kb正常人右側缺失患者地中海貧血患者基因組的PCR分析左側缺失患者四、杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD） 1. DMD是常見的性連鎖隱性遺傳病， 2. 主

9、要特征是進行性肌萎縮和腸肌假性肥大，XP21.2121.3區(qū)抗肌萎縮蛋白基因突變形式不同。DMD多在5歲發(fā)病，10歲左右癱瘓，在20歲左右由于心力和呼吸衰竭而死亡，其發(fā)病率為活產男嬰的1/3500。 （一）DMD分子基礎： 抗肌萎縮蛋白基因長約2900kb，含79個外顯子。抗肌萎縮蛋白基因突變分為基因缺失型和非基因缺失型。（1）DNA片段缺失（60%的病例導致閱讀框移碼移碼實變致DMD，整碼缺失BMD）。缺失的2個熱點區(qū)該基因5端處4555外顯子范圍內。（2）非基因缺失型部分重復（病例的5%）（1）基因組探針法 用XP21區(qū)分離得到的不同探針如（P20）來進行相應內切酶酶譜分析、檢出率取決于探

10、針數(shù)和酶切位點數(shù)目。（2）cDNA探針法抗肌萎縮蛋白基因系列cDNA探針分析患者基因缺失、外顯子拼接改變和基因內部分重復。（3）多重PCR法如有人設計多對引物進行多重PCR擴增該基因的9個易發(fā)缺失“熱點區(qū)”DNA片段，可檢出80%有基因缺失的DMD患者。（4）多態(tài)性分析法基因內及其旁側探針進行RFLP連鎖分析。（5）RTPCR擴增該基因外顯子（全長2.4MB、外顯子起來全長c14kb、用多對引物）可檢出：外顯子拼接異常。聯(lián)用測序：可定位基因缺失的起始和終止。1、苯丙酮尿癥是一種常見的隱性遺傳性氨基酸代謝病。2、主要特征：（1）苯丙氨酸 酪氨酸多巴兒茶酚胺 苯丙酮酸 酪胺 黑色素 （2）患兒出生

11、后須及早得到低phe飲食治療，否則發(fā)生不可逆大腦損害和嚴重智力發(fā)育障礙。 苯丙氨酸羥化酶（肝）五、苯丙酮尿癥（PKU）（一 ） PKU分子基礎（1）迄今約3/4的導致中國人PKU的突變基因已被查清 ，它們分屬11種PAH基因點突變。體外研究表明，這些突變導致PAH活力或喪失。（2）PAH第11外顯子的第399密碼GTA（val）GTT（val）中性突變：不改變任何限制酶識別位點，故又稱“序列多態(tài)性”。這一“序列多態(tài)性”在PKU患者和正常人中存在著連鎖不平衡性， 故可作為一種“遺傳標記”應用于產前診斷。PCR/ASO探針法和PCR-RFLP連鎖分析法。PCR/SSCP直接測序法若待診斷的PKU家

12、系的基因突變類型尚屬“未知”或無RFLP信息。（二）PKU的DNA診斷先合成ASO如：正常探針：TCCATTAACAGTAAGAATTT突變探針： TCCATTAACAATAAGAATTT利用PCR/ASO探針法診斷苯丙酮尿癥利用PCR/ASO探針法診斷苯丙酮尿癥 健康男性 男性攜帶者男性患者 健康女性 女性攜帶者女性患者正常探針突變探針第三節(jié) 腫瘤的基因診斷1通過檢測腫瘤染色體易位及融合基因診斷腫瘤慢粒：（染色體易位）費城染色體PCR檢測融合基因2檢測腫瘤相關基因癌基因（ras）、抑癌基因（ p53）、腫瘤轉移基因3檢測腫瘤相關病毒基因HBV HCV肝癌EB鼻咽癌4檢測腫瘤標志物基因或mRN

13、A 肝癌甲胎蛋白（AFP）結腸癌癌胚抗原（CEA）腫瘤基因診斷的策略腫瘤標記物基因的檢測著絲粒 染色體 22 bcr genec- abl gene 染色體 9 bcr-mRNA bcr-abl mRNA 染色體 9, 22 bcr-abl 融合蛋白（具PTK活性） 慢性骨髓白血病 引物A 引物 B2癌基因和抑癌基因的檢測ras癌基因的檢測ras基因中最常見的點突變是第12，13或61密碼子突變檢測方法：PCR/ASOPCR-SSCP p53的檢測p53基因突變主要為點突變，熱點區(qū)域位于密碼子130290，以175、273、284最多見檢測方法：PCRSSCPPCR測序PCRRFLP 其它基因

14、的 檢測PCR結合其它技術基因芯片4、腫瘤標志物檢測或mRNA診斷腫瘤標志物是由腫瘤組織細胞產生的、與腫瘤形成和發(fā)展相關的物質，包括腫瘤抗原、激素、酶、同工酶等?；驑酥竞突虮硇蜆酥荆ㄅ咛バ钥乖z測方法：PCRASOPCR測序PCRRFLPPCRSSCP第四節(jié) 感染性疾病的基因診斷一、感染性疾病基因診斷的策略針對病原體特異的核酸序列設計探針進行雜交應用PCR技術擴增病原體基因保守序列核酸雜交技術與PCR技術聯(lián)合應用特點簡便、特異、快捷能檢測出潛在的病原體可對病原體進行分類、分型鑒定不能得知病原體進入體內后機體的反應二、基因診斷的感染性疾?。ㄒ唬?、病毒特點：分離培養(yǎng)周期長，操作繁雜，制約因素

15、多電鏡觀察直觀快速，但昂貴免疫學診斷簡便快速，但存在問題：不易檢出潛伏期的病毒有些病毒亞型多，抗原變異性大整合進入人基因組的病毒病毒核酸分析技術HBV包含4個開放閱讀框，S、C、P、XPCRPCR/限制性內切酶譜分析PCR/點雜交,PCR/Southern blot基因芯片目的基因引物序列擴增片段C5ACTGTTCAAGCCTCCAAGCT3425 bp5AGTGCGAATCCACACTC3 調節(jié)和啟動轉錄 LTR gag pol env tat，rev LTR 長末端重復序列調節(jié)蛋白基因正常的病毒基因產生病毒核心蛋白產生逆轉錄酶和整合酶 產生病毒 外膜蛋白附加基因*HIV病毒基因組結構目的基

16、因引物序列擴增片段env5ACAATTATTGTCTGGTATAG3135 bp5AGGTATCTTTCCACAGCCAG3HIV-1Probe TGAGTTGCAACAGATGCTGTTGCGCCTCAATAGCCCTCAGPCR/核酸雜交診斷艾滋病SARSRTPCR 多重PCR 熒光定量PCR（二）、細菌細菌性痢疾志賀菌，侵襲性大腸桿菌，大質粒；PCR結核病PCR （三）、寄生蟲 重復序列探針法、寡核苷酸探針法、基因組探針法、PCR第五節(jié) 基因診斷策略（一）檢測致病基因突變基因變異致病的類型：內源基因的變異基因結構的突變點突變、插入、缺失、重排、異位基因表達異常mRNA剪接異常外源基因的插入點突變的診斷診斷已知的點突變 （PCR） 一對探針突變堿基置探針中央控制雜交條件結果分析：反向雜交技術診斷未知的突變 PCR/測序DNA芯片技術分析與疾病連鎖的遺傳標志 對于還不清楚基因的多數(shù)基因病，可通過檢測與特定染色體位點連鎖的遺傳標記來進行基因診斷。 基本方法：PCR產物酶切產物電泳分析。基因連鎖分析（PCR/RFLP連鎖分析法）（三）建立多基因疾病表型克隆一些多基因、多因素疾病，不僅涉及多個基因還涉及一些環(huán)境因素及其與基因的相互作用。表型克隆從分析正常與異常基因組的相同或差異，找到正常人與疾病患者之