肝微粒體的提取及其含量測定

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上人肝微粒體的提取及其含量測定第一部分：人肝微粒體的提取一、儀器及試劑：儀器：內(nèi)切式勻漿機，高速離心機，超速離心機，表面皿數(shù)個，冰袋數(shù)個，碎冰，裝碎冰燒杯，勻漿用玻璃管，不銹鋼剪刀試劑：含0.15M KCl的100mM磷酸鉀緩沖液（PH7.4）,100mM磷酸鉀緩沖液材料：8號人肝（稱取重量29.95g）二、實驗流程：組織（記錄死亡時間、儲運條件）Ü37度水浴解凍Ü含0.15 M KCl 的100 mM磷酸鉀緩沖液（pH 7.4）漂洗，除去表面血跡及組織液（緩沖液事先已置于冰箱中冷藏）Ü將組織置于下墊冰塊的表面皿中，用剪刀手動剪碎Ü

2、;內(nèi)切式均漿機勻漿（過程中注意將組織置于冰塊包圍住，保持低溫環(huán)境）Ü9000 ×g離心20 min，取上清，即得S9Ü超速離心機105,000 × g 超速離心60 minÜ取沉淀（過程中防止上清表面的油膜粘附到沉淀表面，應用吸管將油膜慢慢吸出，而不能傾倒）Ü重懸于100 mM磷酸鉀緩沖液（pH 7.4）中（重懸過程中應注意不要產(chǎn)生氣泡）Ü105,000 × g 超速離心60 minÜ取沉淀，用100mM磷酸鉀緩沖液（pH7.4）重懸得微粒體（此次重懸時應使用盡量少的緩沖鹽體積，以防止微粒體濃度被過于稀釋

3、，重懸過程同樣注意油膜與氣泡）Ü磷酸鹽緩沖液中，分裝塑料小管中，-80°C貯存三、實驗結(jié)果：一共稱取8號人肝組織29.95g，提取出肝微粒體23mL，經(jīng)蛋白含量測定，微粒體二次重懸液蛋白含量以牛血清白蛋白計為37.4mg/mL，加入100mM磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）稀釋至86mL，得10mg/mL的微粒體儲備液，分裝保存于-80度待用。第二部分 微粒體中蛋白含量測定一、儀器和材料：0.1 N NaOH(2g NaOH溶于500mL水), 1%酒石酸鉀（1.342g四水合酒石酸鉀溶于100mL水），2 %無水碳酸鈉（溶劑為0.1 N NaOH），0.5 %硫酸酮（溶劑為1

4、%酒石酸鉀），甲液（2 %無水碳酸鈉50 ml，加0.5 %硫酸酮1 ml，混勻，臨用時現(xiàn)配），牛血清蛋白標準液500 g / ml(溶劑為0.1 N NaOH)Folin酚(福林試劑)試劑：1份Folin酚原液用蒸餾水稀釋3倍得工作液，F(xiàn)olin酚試劑原液配制方法如下： 1000mL磨口回流裝置內(nèi),加入鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O) 50 g鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O) 12.5 g蒸餾水350 mL85%磷酸25 mL濃鹽酸50 mL文火回流10h。取去冷凝器,加入硫酸鋰(Li2SO4)25 g蒸餾水50 mL混勻,加入幾滴液體溴,再煮沸15min,以驅(qū)逐殘溴及

5、除去顏色,溶液應呈黃色而非綠色。若溶液仍有綠色,需要再加幾滴溴液,再煮沸除去之。冷卻后,定容至500mL, 混合均勻過濾。試劑呈金黃色貯于棕色試劑瓶內(nèi)。二、實驗方法：1、測定原理：利用Folin酚試劑與蛋白質(zhì)的酪氨酸與色氨酸殘基反應在680nm處產(chǎn)生吸收2、實驗過程：1）樣品測定：試劑母液濃度體系濃度加入體積H2O1mLHLM10L/5L甲液3mL混勻，放置10minFolin酚試劑0.8mL混勻，50oC水浴10min或者室溫30min冷水中終止反應另制備空白一份，不加HLM，按照樣品操作程序制作即得2）標準曲線：試劑母液濃度體系濃度加入體積H2O(1.00-X)mLBSA500g/mLXm

6、L甲液3mL混勻，放置10minFolin酚試劑0.8mL混勻，50oC水浴10min或者室溫30min冷水中終止反應X代表各濃度的標準樣品加入的BSA體積，從小至大分別為0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.63）樣品檢測：反應完成后，置于680nm處用分光光度計測量吸光度值。三、實驗結(jié)果：1）標準曲線：Level加入BSA母液體積mL蛋白量ug吸光度值B000.07870.080500.082310.1500.28230.28390.20340.285520.21000.43610.435050.354550.43430.31500.59930.58570.50520.57

7、2140.42000.7430.752050.671550.761150.52500.85380.86710.78660.880460.63000.95390.99930.91881.0447Figure 1 BSA標準曲線2）樣品測定：樣品編號加入微粒體uL吸光度值蛋白量ug蛋白含量mg/mLSa1101.09131.11711.0366335.33.Sa1101.1429Sa250.66880.68920.6087187.37.Sa250.7096B00.07870.0805000B00.0823四、備注：本實驗準備試劑時，要注意一些水合物的稱量值，應按照其不含水的量計算微粒體二次重懸液的

8、蛋白含量為37.4mg/mL，共23mL，將其稀釋至86mL，得到10mg/mL的微粒體儲備液，分裝后置零下80度冰箱冷凍保存待用。第三部分 人肝微粒體中的P450含量測定一、實驗材料：儀器：雙光束紫外分光光度計，比色杯材料：100mM磷酸鹽緩沖液（pH=7.4），連二亞硫酸鈉（固體），CO二、實驗方法：1、實驗過程：微粒體懸液Ü0.1M 磷酸緩沖液（PH 7.4）中稀釋至0.5 mg pro/ml。Ü各取3 ml，加入兩比色杯中 Ü (雙光束)紫外分光光度計500-400 nm掃描，劃基線Ü各杯中加入連二亞硫酸鈉2mg或連二亞硫酸鈉溶液(0.1 g/ml)20 l。Ü迅速向測定管內(nèi)充CO 30-60 秒，充的速度要慢，防止起泡沫。穩(wěn)定5 min Ü 再次500-400 nm掃描Ü得到還原型細胞色素P450在450nm與490nm處的OD（吸收）值2、結(jié)果計算三、實驗結(jié)果：1）實驗數(shù)據(jù)樣品450nm490nmAP450含量（nmol/mg pr）10.14020.120340.019860.20.13580.116360.019440.2）相關(guān)圖譜：Figure 2 BaselineFigure 3 P450 酶紫外吸收圖3）原始數(shù)據(jù)及說明：原始數(shù)據(jù)存于大連化