BCA蛋白濃度測定試劑盒完整版

1、BCA蛋白濃度測定試劑盒說明23225蛋白質(zhì)化驗試劑盒：為500試管或5000微孔板得檢測提供充足得試劑23227蛋白質(zhì)化驗試劑盒：為250試管或2500微孔板得檢測提供充足得試劑試劑盒組分：BCA試齊1JA,1000mL（No、23225產(chǎn)品中）或500mL（No、23227產(chǎn)品中），碳酸鈉，碳酸氫鈉，二唾咻甲酸，酒石酸鈉溶于0、1M氫氧化鈉中。BCA試齊,25mL,包才4%硫酸銅一次性標準白蛋白，2mg/mL,10x1mL安甑，包含2mg/mL牛血清白蛋白（BSA）存在于0、9%鹽與0、05%疊氮化鈉中。儲存：以上試劑保持在室溫下儲存與裝運注意：如果試劑A或試劑B在低溫下運輸或長期儲存時出

2、現(xiàn)沉淀現(xiàn)象，可以通過緩慢加溫或輕輕攪拌溶液使沉淀物溶解。當(dāng)試劑變色或確定微生物污染時請丟球試劑盒。目錄介紹、1準備標準試劑與工作試劑、2準備試管、3準備微型版、3故障檢修、4有關(guān)美國熱電其她產(chǎn)品、5附加信息、5參考文獻、6介紹美國熱電（Thermo）公司得BCA蛋白濃度測定試劑盒就是基于二唾咻甲酸（BCA）通過比色檢測與定量測定總蛋白得洗滌劑兼容配方。該方法通過堿性介質(zhì)中彳#一種蛋白結(jié)合了Cu2使其顯著減少轉(zhuǎn)變?yōu)镃u1（縮二月尿反應(yīng)）。用一種含二奎琳甲酸得試劑選擇性得比色法高敏感得比色杯中得Cu1、這種測定方法得紫色色反應(yīng)產(chǎn)物就是通過BCA得兩個分子與亞銅離子螯合作用形成得。這種水溶性復(fù)合物在

3、562nm處有強吸收峰。在大得活性范圍內(nèi)（20-2000g/mL）幾乎同蛋白濃度增加呈線性關(guān)系。BCA法不就是真正得終點得方法；也就就是說，最終顏色繼續(xù)發(fā)展。孵化之后，繼續(xù)得顏色發(fā)展速度就是足夠慢以允許一起進行測定大量樣本。大分子結(jié)構(gòu)得蛋白質(zhì)，肽鍵得數(shù)量與存在得四個特定氨基酸（半胱氨酸，胱氨酸，色氨酸與酪氨酸）據(jù)說就是與BCA形成顏色產(chǎn)物得原因.因此，蛋白濃度得測量通常要參照標準得一個常見得蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白.一系列已知濃度得蛋白質(zhì)稀釋液就是為與之相近得未知蛋白質(zhì)濃度測定準備得.因為每一個未知濃度得測定都需要基于標準曲線。如果需要將一個未知蛋白精確定量，選擇一個與未知蛋白特性相似得標準蛋白就

4、是可取得。例如，當(dāng)測定免疫球蛋白時牛血清丙種球蛋白可以被當(dāng)做標準蛋白.以下給出了兩種檢測過程：其中試管程序需要一個較大得體積（0、1毫升）得蛋白質(zhì)樣品。然而，因為它使用了一個樣品比例為1:20得工作試劑（v/v）,所以將干擾物質(zhì)得影響降到最小。在酶處理程序提供了一樣品處理酶，需要體積較?。?0-25山）得蛋白質(zhì)樣品。然而，由于使用了樣品比例為1:8得工作試劑（v/v）,所以在克服干擾物質(zhì)濃度時靈活性降低，從而獲得得檢測水平較低.標準試劑與工作試劑得準備（試驗程序需要得兩個）A.雅備稀釋得BSA標準液表1為導(dǎo)向，準備一套蛋白質(zhì)標準。稀釋標準彳#內(nèi)容為，將一個盛在安甑管中得標準BSA稀釋到幾個潔凈

5、得瓶子中，最好使用與樣本（s）相同量得稀釋劑。根據(jù)表1得建議：每1毫升得安甑管中加入2毫克/毫升得BSA標準液對于準備一系列得標準稀釋液就是足夠得。每個稀釋標準重復(fù)三次也就是足夠量得。表一：準備稀釋得BSA標準液標準試管協(xié)議與微型版程序彳#稀釋方案（活性范圍=20-2000閔/mL）二呂勺稀釋液體積（科L）BSA來源及體積（L）BSA終濃度（應(yīng)/mL）A0300得原液2000B125375得原液1500C325325得原液1000D175175得B管稀釋液750E325325得C管稀釋液500F325325得E管稀釋液250G325325得F管稀釋液125H400100得G管稀釋液25I400

6、00=空白加強試管協(xié)議得稀釋方案（活性范圍=52500mL）二呂勺稀釋液體積（L）BSA來源及體積（WDBSA終濃度（迎/mL）A700100得原液250B400400得A管稀釋液125C450300得B管稀釋液50D400400得C管稀釋液25E400100得D管稀釋液5F40000=空白B:準備BCA得工作試劑（WR1、總共需要得WR得體積可以通過以下公式計算出來：（標準液+未知液）X（平行數(shù)目）X（每個樣品中加入得WR體積）=總共所需得WR體積例如：標準得試管程序有三個未知液，每個樣品做兩組重復(fù)：（標準液9mL+未知液3mL）X（平行數(shù)目2）X（2mL）=總共所需得WR體積48mL注意:

7、試管程序中每個樣品管加2、0mlWR微型版程序中每個樣品中只需要加200ulWR2、WR得制備：（BCA試劑A:B=50:1），對上述樣品，將50mL試齊【JA與1mL試劑B混合。注意：當(dāng)試劑B加入到試劑A得開始，濁度觀察表明：混合后迅速消失變成澄清得綠色得WR.準備充足得WR就是基于所測樣品數(shù)量上得。如果將WR儲存在處于室溫（RT）得密閉容器中，那么幾天之內(nèi)WR就是穩(wěn)定得。簡要步驟（試管程序，標準方案）試管程序（樣品：WR=1：20）1、用移液管移取每個標準品與所測樣品得重復(fù)0、1ml到有標簽得對應(yīng)試管中。2、紙每個管中加2、0m1得WR,混勻。3、俎口，然后溫育試管（選擇時間與溫度）1）標

8、準方案：37C30min（workingrange=20-2000ug/ml）2）RT方案：RT2h（workingrangc=202000ug/m1）3、 EnhancedProtoco1（加強方案）:60c30min（workingrange=5-250ug/m1）注意:每個實驗中都增加培育時間與溫度，增加562nm得凈吸光度，降低試劑得最低檢測水平與方案得工作范圍；使用水浴加熱管要么就是標準（37。C培養(yǎng)）或就是增強（60。C培養(yǎng)）協(xié)議。使用強制得培養(yǎng)可能會因為熱傳遞不均勻使其在顏色變化上引進明顯得誤差4、 使所有管子冷卻至室溫5、 分光光度計設(shè)定在562nm，當(dāng)比色皿中裝得就是水時給儀

9、器校零。隨后，確保在10min內(nèi)測完所有樣品得吸光度。注意：因為BCA測定不就是真正得終點，即使冷卻到室溫顏色還會繼續(xù)變化。然而，由于在室溫下顏色變化速度比較慢，所以如果在10min內(nèi)測完所有試管得吸光度就不會引進明顯得誤差。6、所有得單個標準品與所測得樣品重復(fù)在562nm測得得吸光度都要減去在562nm測得得所有空白標準品得吸光度平均值。微型板程序（樣品：WR=1:8）1、用移液管移取25ul得WR到每一個標準品與未知樣品所在得微型板中（workingange=202000ug/m1）注意:如果樣品大小被限制為：每個未知樣品與標準品只能使用10ul（sampletoWRratio=1:20）

10、、然而，被測量得workingrange在這種情況下將被限制為1252000ug/ml。2、每個孔中加200ul得WR，用plateshaker混30s,使其徹底混勻3、甜口，溫育37C30min4、 冷卻到室溫5、用酶標儀測量在562nm或接近562nm得讀數(shù)注意：1）這種方法中波長在540-590nm得范圍內(nèi)都能被成功得測量2 ）因為讀板器使用得光線長度比分光光度計得比色皿要短，所以微型板程序需要使用樣品比例比較大得工作試劑去獲得與標準試管程序相同得靈敏度.如果需要高于562nm得測量，要將培養(yǎng)時間增加到2h、3 ）增加培養(yǎng)時間或樣品工作試劑得體積比率，增加每個we11在562nm得凈測量

11、值，降低實際得最低測量水平與測量得workingrange。只要每個標準樣與未知樣都被同等對待，這樣得修改也就是有益得.6、所有得單個標準品與所測得樣品重復(fù)在562nm測得得吸光度都要減去在562nm測得得所有空白標準品得吸光度平均值.7、準備一個標準曲線通過繪制每一個標準BSA在562nm測量得相對于空白對照得吸光度平均值.它ug/ml得濃度。使用標曲去測量每一個未知樣品得蛋白質(zhì)濃度注意:如果聯(lián)系微型板讀數(shù)器使用擬合得曲線算法，一個有四個參數(shù)得或最合適得曲線將提供比純線性狀態(tài)更精確得結(jié)果。如果用手繪制這個結(jié)果，一個點-分曲線將比線性更加適合標準點。故障檢修問題可能原因解決方案在任何管中都無顏

12、色樣品包含銅螯合劑透析，脫鹽，或稀釋樣品。增加工作試劑中銅濃度（例如，使用，試劑A:B50:2）使用得產(chǎn)品23215從樣品去除干擾物質(zhì)空白吸收就是可以得，但就是標準與樣本比預(yù)期得顯不更少顏色強酸性或堿性緩沖液改變了工作試劑得pH透析,脫鹽，或稀釋樣品。顏色在錯誤波長下被測量確定在562nm波長下測吸光度樣品得顏色比預(yù)期得深蛋白濃度太高稀釋樣品樣品包含脂質(zhì)或脂蛋白添加以減少脂質(zhì)干擾使用得產(chǎn)品23215從樣品去除干擾物質(zhì)所有試管（包括空白）都就是暗紫色緩沖液中含有還原劑透析或稀釋樣品。使用得產(chǎn)品23215從樣品去除干擾物質(zhì)緩沖液中含有航基緩沖含有生物胺（兒茶酚胺）需要在不同波長下測量顏色分光光度計

13、或酶標儀沒有562nm從540nm到590nm顏色可以在任何波長下被測量，雖然標準曲線得斜率與整體測濾光器量得靈敏度將減少A：干擾物質(zhì)某些物質(zhì)干擾BCA檢測就是已知得，包括潛在彳#還原劑，螯合劑，強酸或強堿。因為她們可以干擾估算蛋白質(zhì)每分鐘濃度，作為樣品緩沖液得組份應(yīng)避免下列物質(zhì)：抗壞血酸EGTA鐵不純得蔗糖兒茶酚胺不純得甘油脂質(zhì)色氨酸肌酸酎過氧化氫蜜二糖酪氨酸半胱氨酸酰腫類苯酚磺儆尿酸其她物質(zhì)對BCA法檢測蛋白量有較少程度得干擾.并且這些在原來得樣本中彳宜一定濃度只有很小得影響（可以容忍）.許多物質(zhì)得最大兼容得濃度在標準測試管協(xié)議中被列出。表2（見說明得最后一頁）。物質(zhì)就是兼容與標準測試管協(xié)

14、議中指定得濃度，如果蛋白濃度得估計得誤差就是由物質(zhì)得存在所造成將會小于或等于10%。在每一個實驗之前，這些物質(zhì)都會用現(xiàn)配得WR進行測試.空白校正得宰562nm得吸光度測量值（1000的/mL白蛋白標準品+物質(zhì)）將會同0、9%生理鹽水中精確配制得標準品在562nm出得凈吸光度進行比較。樣品:WR為1:8（v/v）得微孔板過程中最大兼容濃度將比較低。B、消除或減少干擾物質(zhì)影響得，策略BCA蛋白含量測定中干擾物得影響可以用以下幾個方法消除或克服。通過透析或凝膠過濾去除干擾物質(zhì)。稀釋中品，直到不再有干擾。這種策略只在起始蛋白質(zhì)濃度足夠多余稀釋后仍在檢測活性范圍之內(nèi)就是有效得.用丙酮酸或三氯乙酸（TCA

15、）沉淀樣品中蛋白質(zhì)。液體包含干擾物質(zhì)將被丟棄，蛋白沉淀很容易在超純水中溶解或直接用堿性BCAWR溶解。這一方案得詳細流程可從我們網(wǎng)站獲得.另外，23215號產(chǎn)品將被使用（見相關(guān)Pierce產(chǎn)品）。適當(dāng)?shù)迷黾覹R中銅得量（準備WR試劑A:B為50:2或50:3、）,這將減少銅螯合劑得干擾注意：為了最大限度得精確度，蛋白質(zhì)標準品必須與樣品（s）同樣處理。有關(guān)美國熱電其她產(chǎn)品1504196孔板100/pkg15075試劑水庫200/pkg、1503696孔板密封帶100/pkg、23209標準白蛋白安甑2mg/mL10X1毫升安甑，包含牛血清白蛋白23208預(yù)稀釋得蛋白質(zhì)檢測標準品：牛血清白蛋白集合

16、,7>3、5mL23212牛伽瑪球蛋白標準品2mg/mL,10X1mL安甑23235微型BCA蛋白檢測試劑盒工作范圍為0、520聞/mL23236考馬斯亮藍檢測試劑盒，工作范圍得1-1500闖/mL23215patAble?蛋白檢測試劑組23250BCA蛋白檢測試劑盒-兼容還原劑附加信息Ao請訪問我們得網(wǎng)站了解更多得信息，包括下列事項：常見問答技術(shù)指導(dǎo)：消除樣品中干擾物質(zhì)對蛋白質(zhì)檢測得影響B(tài)、替代總蛋白檢測試劑如果不能克服樣品中還原物或金屬螯合物得干擾。由一個減少物質(zhì)或metalchelating物質(zhì)包含在，試試美國熱電公司得23236號考馬斯亮藍檢測試劑盒，它對這些物質(zhì)較不敏C、玻璃器皿得清潔與重利用小心謹慎使用玻璃器皿.所有得玻璃器皿必須清洗與最后得超純水沖洗。D、不同得蛋白質(zhì)得反應(yīng)特征常用得總蛋白含量測定方法某種程度上顯示了不同蛋白得不同反