第四章二維電泳與細(xì)胞蛋白質(zhì)的分離

1、第四章二維電泳與細(xì)胞蛋白質(zhì)的分離第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 NH CH2=CHCONH2 + CH2=CHC CH2=CHC CH2CHCH2CHxCH2 CH2CHCH2CHxCH2CONH2 C=O CH2 NH NH O O CONH2C=ONHCH2NH 標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量未未知知蛋蛋白白在一定的凝膠濃度下，多肽在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對(duì)數(shù)與多肽鏈的鏈分子量的對(duì)數(shù)與多肽鏈的相對(duì)遷移率成線(xiàn)性關(guān)系，所相對(duì)遷移率成線(xiàn)性關(guān)系，所以可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求未知以可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求未知多肽鏈分子量多肽鏈分子量 相對(duì)遷移率相對(duì)遷移率1D-SDS-PAGE1D-SDS-PAGE分離局限性分離

2、局限性o分離度相當(dāng)有限分離度相當(dāng)有限n顯示含有單一蛋白質(zhì)的條帶實(shí)際可能含有多種顯示含有單一蛋白質(zhì)的條帶實(shí)際可能含有多種蛋白質(zhì)分子蛋白質(zhì)分子n一個(gè)純化的蛋白質(zhì)可能含有多種蛋白質(zhì)形式一個(gè)純化的蛋白質(zhì)可能含有多種蛋白質(zhì)形式n1D-SDS-PAGE1D-SDS-PAGE分析看上去純凈的單一條帶，相分析看上去純凈的單一條帶，相同樣品的同樣品的2D-SDS-PAGE2D-SDS-PAGE可將相同分子質(zhì)量條帶可將相同分子質(zhì)量條帶分解成具有不同等電點(diǎn)的多點(diǎn)分解成具有不同等電點(diǎn)的多點(diǎn)o反應(yīng)了蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，化學(xué)修飾幾乎不影響反應(yīng)了蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，化學(xué)修飾幾乎不影響SDSSDS結(jié)結(jié)合或在合或在PAGEPA

3、GE上的遷移上的遷移二維電泳技術(shù)二維電泳技術(shù)oSmithiesSmithies和和PoulikPoulik（19561956年）最早引入二維電泳技術(shù)：年）最早引入二維電泳技術(shù)：將紙電泳和淀粉凝膠電泳結(jié)合分離血清蛋白質(zhì)將紙電泳和淀粉凝膠電泳結(jié)合分離血清蛋白質(zhì)oOFarrellOFarrell發(fā)明的二維電泳體系發(fā)明的二維電泳體系n根據(jù)蛋白質(zhì)的兩個(gè)一級(jí)屬性：等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量根據(jù)蛋白質(zhì)的兩個(gè)一級(jí)屬性：等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量的特異性將蛋白質(zhì)混合物在第一個(gè)方向上按照等電點(diǎn)的特異性將蛋白質(zhì)混合物在第一個(gè)方向上按照等電點(diǎn)高低進(jìn)行分離（等電聚焦），在第二個(gè)方向上按照相高低進(jìn)行分離（等電聚焦），在第二個(gè)方向上按

4、照相對(duì)分子質(zhì)量大小進(jìn)行分離（對(duì)分子質(zhì)量大小進(jìn)行分離（SDS-PAGESDS-PAGE）二維電泳技術(shù)二維電泳技術(shù)o二維電泳分離后的蛋白質(zhì)經(jīng)顯色方法（考馬斯亮二維電泳分離后的蛋白質(zhì)經(jīng)顯色方法（考馬斯亮藍(lán)染色、酸性銀染、堿性銀染、負(fù)性染色、熒光藍(lán)染色、酸性銀染、堿性銀染、負(fù)性染色、熒光染色、放射性標(biāo)記）處理后，通過(guò)圖像掃描存檔，染色、放射性標(biāo)記）處理后，通過(guò)圖像掃描存檔，最后呈現(xiàn)出來(lái)的是在二維方向排列的呈最后呈現(xiàn)出來(lái)的是在二維方向排列的呈“滿(mǎn)天星滿(mǎn)天星”狀排列的小圓的，其中每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)蛋白質(zhì)狀排列的小圓的，其中每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)蛋白質(zhì)第二節(jié)第二節(jié) 一維等電聚焦電泳一維等電聚焦電泳一、一、IEFIE

5、F凝膠制備凝膠制備o一維等電聚焦的基本原理：一維等電聚焦的基本原理： 把蛋白質(zhì)加入到含有把蛋白質(zhì)加入到含有pHpH梯度的載體時(shí)，如果蛋白質(zhì)所在梯度的載體時(shí)，如果蛋白質(zhì)所在的點(diǎn)的的點(diǎn)的pHpH值與其等電點(diǎn)不符，則該蛋白質(zhì)會(huì)帶一定量的正電值與其等電點(diǎn)不符，則該蛋白質(zhì)會(huì)帶一定量的正電荷或負(fù)電荷。在高于其等電點(diǎn)的位置，蛋白質(zhì)帶負(fù)電，反之荷或負(fù)電荷。在高于其等電點(diǎn)的位置，蛋白質(zhì)帶負(fù)電，反之帶正電。此時(shí)，如果加以強(qiáng)電場(chǎng)，蛋白分子會(huì)在電場(chǎng)作用下帶正電。此時(shí)，如果加以強(qiáng)電場(chǎng)，蛋白分子會(huì)在電場(chǎng)作用下分別向正極或負(fù)極漂移。當(dāng)達(dá)到其等電點(diǎn)位置時(shí)，蛋白質(zhì)不分別向正極或負(fù)極漂移。當(dāng)達(dá)到其等電點(diǎn)位置時(shí)，蛋白質(zhì)不帶電，就不

6、再漂移，被濃縮成狹窄的區(qū)帶。帶電，就不再漂移，被濃縮成狹窄的區(qū)帶。一、一、IEFIEF凝膠的制備凝膠的制備o早期的等電聚焦以低濃度的聚丙烯酰胺凝膠為介質(zhì)，在外加早期的等電聚焦以低濃度的聚丙烯酰胺凝膠為介質(zhì)，在外加電場(chǎng)的該介質(zhì)中，連續(xù)排列著從正極到負(fù)極電場(chǎng)的該介質(zhì)中，連續(xù)排列著從正極到負(fù)極pIpI值逐漸增加的值逐漸增加的合成載體兩性電解質(zhì)合成載體兩性電解質(zhì)(sythetic(sythetic carriercarrier ampholyteampholyte，SCA)SCA)o當(dāng)電壓加在當(dāng)電壓加在SCASCA混合物間，最高混合物間，最高pIpI值的分子（帶最多值的分子（帶最多正電荷）移向負(fù)極，最

7、低正電荷）移向負(fù)極，最低pIpI值（帶最多負(fù)電荷）的分值（帶最多負(fù)電荷）的分子移向正極，其余分子將根據(jù)其子移向正極，其余分子將根據(jù)其pIpI值在兩個(gè)極值之間值在兩個(gè)極值之間分散，從而形成一個(gè)連續(xù)的分散，從而形成一個(gè)連續(xù)的pHpH梯度梯度等電聚焦電泳等電聚焦電泳o合成載體兩性電解質(zhì)合成載體兩性電解質(zhì)(1)(1)易溶于水，在易溶于水，在pIpI處應(yīng)有足夠的緩沖能力，形成穩(wěn)定的處應(yīng)有足夠的緩沖能力，形成穩(wěn)定的pHpH梯度，不致被蛋白質(zhì)或其它兩性電解質(zhì)改變梯度，不致被蛋白質(zhì)或其它兩性電解質(zhì)改變pHpH梯度；梯度；(2)(2)在在pIpI處應(yīng)有良好的電導(dǎo)及相同的電導(dǎo)系數(shù)，以保持均勻的處應(yīng)有良好的電導(dǎo)及相

8、同的電導(dǎo)系數(shù)，以保持均勻的電場(chǎng)；電場(chǎng)；(3)(3)分子量小，可通過(guò)透析或分子篩法除去，便于與生分子量小，可通過(guò)透析或分子篩法除去，便于與生物大分子分開(kāi)；物大分子分開(kāi)；(4)(4)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，也無(wú)變化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，也無(wú)變性作用，其化學(xué)組成不同于蛋白質(zhì)。性作用，其化學(xué)組成不同于蛋白質(zhì)。oSCASCA的缺陷：的缺陷：nSCASCA本身就是通過(guò)復(fù)雜的合成過(guò)程得到的，其重本身就是通過(guò)復(fù)雜的合成過(guò)程得到的，其重復(fù)性很難控制，這樣從一開(kāi)始就限制了復(fù)性很難控制，這樣從一開(kāi)始就限制了2-DE2-DE分分離的重復(fù)性；離的重復(fù)性；nSCASCA分子相對(duì)較小，難以在分子

9、相對(duì)較小，難以在IEFIEF膠內(nèi)固定，在膠內(nèi)固定，在IEFIEF過(guò)程中由水合正離子引起的電滲流將致使過(guò)程中由水合正離子引起的電滲流將致使SCASCA分分子向負(fù)極遷移（負(fù)極漂移），導(dǎo)致子向負(fù)極遷移（負(fù)極漂移），導(dǎo)致pHpH值不穩(wěn)定值不穩(wěn)定性增加。當(dāng)利用管狀性增加。當(dāng)利用管狀I(lǐng)EFIEF膠時(shí)，由于玻璃毛細(xì)管膠時(shí)，由于玻璃毛細(xì)管壁的硅羥基帶負(fù)電，與這些負(fù)電荷基團(tuán)對(duì)應(yīng)，壁的硅羥基帶負(fù)電，與這些負(fù)電荷基團(tuán)對(duì)應(yīng)，將在管膠表面聚集一層正電荷形成雙電層，這將在管膠表面聚集一層正電荷形成雙電層，這種作用加劇了負(fù)極漂移；種作用加劇了負(fù)極漂移；oSCASCA的缺陷：的缺陷：n負(fù)極漂移作用對(duì)堿性區(qū)蛋白質(zhì)的影響尤其嚴(yán)重

10、，負(fù)極漂移作用對(duì)堿性區(qū)蛋白質(zhì)的影響尤其嚴(yán)重，結(jié)果常導(dǎo)致堿性區(qū)蛋白質(zhì)難以成功聚焦甚至導(dǎo)結(jié)果常導(dǎo)致堿性區(qū)蛋白質(zhì)難以成功聚焦甚至導(dǎo)致區(qū)蛋白質(zhì)的丟失致區(qū)蛋白質(zhì)的丟失n每一次灌制每一次灌制SCASCA凝膠的重復(fù)性難以控制，凝膠的凝膠的重復(fù)性難以控制，凝膠的機(jī)械穩(wěn)定性差，易拉伸變形或斷裂，導(dǎo)致重復(fù)機(jī)械穩(wěn)定性差，易拉伸變形或斷裂，導(dǎo)致重復(fù)性的減低性的減低固相固相pHpH梯度（梯度（IPGIPG）技術(shù)）技術(shù)oIPGIPG通過(guò)通過(guò)immobilineimmobiline共價(jià)偶聯(lián)于共價(jià)偶聯(lián)于丙烯酰胺產(chǎn)生固定的丙烯酰胺產(chǎn)生固定的pHpH梯度，梯度，克服了克服了IEFIEF的缺點(diǎn)，從而達(dá)到高的缺點(diǎn)，從而達(dá)到高度的重復(fù)

11、性度的重復(fù)性 oIPGIPG膠條分為線(xiàn)性和非線(xiàn)性膠條分為線(xiàn)性和非線(xiàn)性n線(xiàn)性是指膠條的線(xiàn)性是指膠條的pHpH均勻分布均勻分布n非線(xiàn)性是指為了突出某一非線(xiàn)性是指為了突出某一pHpH范圍范圍的結(jié)果，該的結(jié)果，該pHpH值范圍的膠條長(zhǎng)度值范圍的膠條長(zhǎng)度有所增加有所增加商品化的商品化的IPGIPG膠條膠條oIPGIPG膠條的膠條的pHpH值范圍的選擇一般遵循以下原則值范圍的選擇一般遵循以下原則： pH 310pH 310線(xiàn)性梯度膠適于了解樣本中所有蛋白質(zhì)的分線(xiàn)性梯度膠適于了解樣本中所有蛋白質(zhì)的分布情況布情況 pH 310pH 310非線(xiàn)性梯度膠能提高非線(xiàn)性梯度膠能提高pH 57pH 57之間的樣本蛋白之

12、間的樣本蛋白質(zhì)解析度質(zhì)解析度 聯(lián)合使用聯(lián)合使用pH 47pH 47和和pH 611pH 611梯度膠可獲得相關(guān)梯度膠可獲得相關(guān)pHpH范圍的范圍的更清晰的蛋白質(zhì)分布情況更清晰的蛋白質(zhì)分布情況 小小pHpH范圍梯度膠范圍梯度膠(pH 3.54.5(pH 3.54.5，pH 4.55.5pH 4.55.5，pH 56pH 56等等) )可提供高分辨率的蛋白質(zhì)分布圖譜可提供高分辨率的蛋白質(zhì)分布圖譜 二、加樣二、加樣o在高質(zhì)量的凝膠基礎(chǔ)上進(jìn)行加樣，有兩種方案在高質(zhì)量的凝膠基礎(chǔ)上進(jìn)行加樣，有兩種方案：nIPGIPG膠重泡脹后，利用加樣杯，邊運(yùn)行等電聚焦，膠重泡脹后，利用加樣杯，邊運(yùn)行等電聚焦，邊上樣；邊

13、上樣；o利用加樣杯上樣的好處是在于加樣量可以提高很利用加樣杯上樣的好處是在于加樣量可以提高很多，由于加樣杯直接和膠面接觸，使得分子量大多，由于加樣杯直接和膠面接觸，使得分子量大于于100000Da100000Da的蛋白質(zhì)可以有效地進(jìn)入的蛋白質(zhì)可以有效地進(jìn)入IPGIPG膠條膠條o容易在上樣處形成蛋白質(zhì)沉淀，蛋白質(zhì)樣品易滲漏容易在上樣處形成蛋白質(zhì)沉淀，蛋白質(zhì)樣品易滲漏 二、加樣二、加樣n另一種方案是將樣品與重泡脹液混合，在另一種方案是將樣品與重泡脹液混合，在IPGIPG膠條膠條泡脹的同時(shí)樣品也滲入膠條，然后再加電壓，即泡脹的同時(shí)樣品也滲入膠條，然后再加電壓，即膠內(nèi)泡脹法膠內(nèi)泡脹法o其優(yōu)點(diǎn)是泡脹和等

14、電聚焦整合為一程序即可完成，其優(yōu)點(diǎn)是泡脹和等電聚焦整合為一程序即可完成，高效和高可重復(fù)性，是目前常用的加樣方法高效和高可重復(fù)性，是目前常用的加樣方法o因需要泡漲過(guò)夜，故蛋白質(zhì)可能發(fā)生溶解或修飾因需要泡漲過(guò)夜，故蛋白質(zhì)可能發(fā)生溶解或修飾加樣量過(guò)大加樣量過(guò)大三、運(yùn)行三、運(yùn)行o重泡脹完成后，可以加電壓開(kāi)始重泡脹完成后，可以加電壓開(kāi)始IEFIEFo由于膠條所能承受的電流有限，由于膠條所能承受的電流有限，IEFIEF過(guò)程中要避免電流過(guò)程中要避免電流過(guò)大，一般限流為過(guò)大，一般限流為50A50Ao最初樣品中離子強(qiáng)度高電壓應(yīng)限制于最初樣品中離子強(qiáng)度高電壓應(yīng)限制于200V200V、30min30min，逐步增壓

15、，最終電壓至逐步增壓，最終電壓至8000V8000V并恒定運(yùn)行若干小時(shí)并恒定運(yùn)行若干小時(shí)o運(yùn)行時(shí)間決定于幾個(gè)不同因素：樣品類(lèi)型、蛋白運(yùn)行時(shí)間決定于幾個(gè)不同因素：樣品類(lèi)型、蛋白上樣量、上樣量、IPGIPG膠條長(zhǎng)度、所用膠條長(zhǎng)度、所用pHpH梯度梯度三、運(yùn)行三、運(yùn)行o獲得最好圖譜質(zhì)量和所需最佳時(shí)間是獲得最好圖譜質(zhì)量和所需最佳時(shí)間是IEFIEF分離達(dá)分離達(dá)到穩(wěn)定態(tài)所需的時(shí)間到穩(wěn)定態(tài)所需的時(shí)間o聚焦時(shí)間短，導(dǎo)致水平和垂直條紋聚焦時(shí)間短，導(dǎo)致水平和垂直條紋o過(guò)度聚焦：活性水轉(zhuǎn)運(yùn)而導(dǎo)致過(guò)多水在過(guò)度聚焦：活性水轉(zhuǎn)運(yùn)而導(dǎo)致過(guò)多水在IPGIPG膠表膠表面滲出（電滲），會(huì)造成蛋白圖譜變形面滲出（電滲），會(huì)造成蛋白

16、圖譜變形o在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白質(zhì)丟失在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白質(zhì)丟失o溫度低尿素會(huì)結(jié)晶，溫度低尿素會(huì)結(jié)晶，IEFIEF應(yīng)當(dāng)在應(yīng)當(dāng)在2020運(yùn)行運(yùn)行沒(méi)有完全聚焦或聚焦時(shí)間不夠四、四、IPGIPG膠條的平衡膠條的平衡oIPG IPG 膠條平衡兩次，每次膠條平衡兩次，每次15 15 分鐘分鐘o第一步的平衡液第一步的平衡液n50mmol/L Tris50mmol/L Tris緩沖液（緩沖液（pH8.8pH8.8）, ,含含2%SDS2%SDS、20mmol/LDTT20mmol/LDTT、6mol/L6mol/L尿素、尿素、3030甘油甘油n使一向膠條上的蛋白質(zhì)變性使一向膠條上的蛋白

17、質(zhì)變性nSDSSDS：與蛋白定量結(jié)合：與蛋白定量結(jié)合o蛋白質(zhì)蛋白質(zhì):SDS:SDS1 1：1.41.4四、四、IPGIPG膠條的平衡膠條的平衡n尿素，甘油：尿素，甘油：o去除蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)以及亞基間的相互作用去除蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)以及亞基間的相互作用o減少電內(nèi)滲，有利于蛋白從第一向到第二向的減少電內(nèi)滲，有利于蛋白從第一向到第二向的轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移nDTTDTTo使變性的非烷基化的蛋白處于還原狀態(tài)使變性的非烷基化的蛋白處于還原狀態(tài)四、四、IPGIPG膠條的平衡膠條的平衡o第二步平衡液中加入碘乙酰胺以取代第二步平衡液中加入碘乙酰胺以取代DTTDTTn使蛋白質(zhì)巰基烷基化，防止它們?cè)陔娪具^(guò)程中使蛋白質(zhì)巰基烷基化，

18、防止它們?cè)陔娪具^(guò)程中重新氧化重新氧化n碘乙酰胺并且能使殘留的碘乙酰胺并且能使殘留的DTT DTT 烷基化烷基化( (銀染過(guò)程銀染過(guò)程中，中，DTT DTT 會(huì)導(dǎo)致點(diǎn)拖尾會(huì)導(dǎo)致點(diǎn)拖尾“point streaking”)point streaking”)o將將IPG IPG 膠條輕輕潤(rùn)洗，并去除多余的平衡緩沖液，然膠條輕輕潤(rùn)洗，并去除多余的平衡緩沖液，然后放入第二向后放入第二向SDS SDS 膠中膠中四、四、IPGIPG膠條的平衡膠條的平衡o一步平衡法一步平衡法n平衡液中平衡液中5mmol/L TBP5mmol/L TBP取代取代DTTDTTnTBPTBP不帶電荷，在不帶電荷，在SDS-PAGES

19、DS-PAGE過(guò)程中不遷移過(guò)程中不遷移第三節(jié)第三節(jié) 二維二維SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳二維二維SDS-PAGESDS-PAGEo平衡后，平衡后，IPGIPG條可直接加在二向條可直接加在二向SDS-PAGESDS-PAGE膠膠的表面的表面o一向膠和二向膠的接觸是影響電泳重復(fù)性的一向膠和二向膠的接觸是影響電泳重復(fù)性的一個(gè)很重要因素一個(gè)很重要因素n避免兩者接觸面之間產(chǎn)生氣泡避免兩者接觸面之間產(chǎn)生氣泡n否則會(huì)產(chǎn)生阻力，使得膠條中蛋白無(wú)法順利遷否則會(huì)產(chǎn)生阻力，使得膠條中蛋白無(wú)法順利遷移至二向，從而產(chǎn)生點(diǎn)的扭曲現(xiàn)象移至二向，從而產(chǎn)生點(diǎn)的扭曲現(xiàn)象二維二維SDS-PAGEo同普通同普通SDS

20、-PAGESDS-PAGE類(lèi)似類(lèi)似o分水平和垂直兩種分水平和垂直兩種o水平水平SDS-PAGESDS-PAGEn必須有必須有6 6的濃縮膠，均一或梯度的分離膠的濃縮膠，均一或梯度的分離膠n凝膠附著在塑料支持膜上，在染色過(guò)程中可以凝膠附著在塑料支持膜上，在染色過(guò)程中可以防止凝膠大小發(fā)生變化防止凝膠大小發(fā)生變化n水平膠厚度較小（一般在水平膠厚度較?。ㄒ话阍趏.5mm,o.5mm,垂直膠為垂直膠為1mm1mm或或1.5mm1.5mm），可施加高電壓，減短運(yùn)行時(shí)間，減少蛋白），可施加高電壓，減短運(yùn)行時(shí)間，減少蛋白質(zhì)擴(kuò)散，使得水平膠分離蛋白質(zhì)點(diǎn)的邊緣要比垂直質(zhì)擴(kuò)散，使得水平膠分離蛋白質(zhì)點(diǎn)的邊緣要比垂直膠

21、清晰膠清晰n凝膠聚合均勻，邊緣效應(yīng)小，蛋白質(zhì)點(diǎn)的分布變形凝膠聚合均勻，邊緣效應(yīng)小，蛋白質(zhì)點(diǎn)的分布變形程度小程度小o垂直垂直SDS-PAGESDS-PAGEn避免二向電泳時(shí)膠條在電極液中移位，需用避免二向電泳時(shí)膠條在電極液中移位，需用0.50.5的瓊脂糖電極緩沖液封膠的瓊脂糖電極緩沖液封膠n封膠應(yīng)注意瓊脂糖溶液的溫度不能太高封膠應(yīng)注意瓊脂糖溶液的溫度不能太高o會(huì)造成會(huì)造成IPGIPG膠上蛋白質(zhì)變性或蛋白質(zhì)修飾膠上蛋白質(zhì)變性或蛋白質(zhì)修飾n避免在封膠時(shí)引入氣泡避免在封膠時(shí)引入氣泡n無(wú)需濃縮膠無(wú)需濃縮膠oIPGIPG膠條中蛋白質(zhì)區(qū)域已得到濃縮，可以認(rèn)為非限制性膠條中蛋白質(zhì)區(qū)域已得到濃縮，可以認(rèn)為非限制

22、性IEFIEF膠（低濃度丙烯酰胺膠）充當(dāng)了濃縮膠膠（低濃度丙烯酰胺膠）充當(dāng)了濃縮膠n可成批二向可成批二向SDS-PAGESDS-PAGE同時(shí)運(yùn)行以獲得最好的圖譜同時(shí)運(yùn)行以獲得最好的圖譜重復(fù)性重復(fù)性n操作簡(jiǎn)單、上樣量大、重復(fù)性好操作簡(jiǎn)單、上樣量大、重復(fù)性好膠在聚合過(guò)程中未被水覆蓋或水太少膠在聚合過(guò)程中未被水覆蓋或水太少至少加至少加1ml水至膠的表面水至膠的表面不是所有蛋白特別是高分子量蛋白都與不是所有蛋白特別是高分子量蛋白都與SDS結(jié)合結(jié)合制備制備SDS-PAGE膠時(shí)用膠時(shí)用0.15%SDS替代替代0.1%SDS非正常聚合非正常聚合聚合過(guò)程中產(chǎn)生氣泡或膠盒有雜質(zhì)聚合過(guò)程中產(chǎn)生氣泡或膠盒有雜質(zhì)第四

23、節(jié)第四節(jié) 膠上蛋白的檢測(cè)膠上蛋白的檢測(cè)o考馬斯亮藍(lán)（考馬斯亮藍(lán)（Commassie blue)Commassie blue)染色染色o銀染銀染o負(fù)染負(fù)染o熒光染色熒光染色一、考馬斯亮藍(lán)染色一、考馬斯亮藍(lán)染色o原理：利用考馬斯亮藍(lán)分子上的芳香苯環(huán)，與蛋白原理：利用考馬斯亮藍(lán)分子上的芳香苯環(huán)，與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合；同時(shí)其亞硫酸基團(tuán)（質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合；同時(shí)其亞硫酸基團(tuán)（-SO-SO3 32-2-）與）與蛋白質(zhì)的正電荷結(jié)合，可使蛋白質(zhì)染出蘭色條帶蛋白質(zhì)的正電荷結(jié)合，可使蛋白質(zhì)染出蘭色條帶o考馬斯亮藍(lán)在一定濃度乙醇和酸性溶液中呈現(xiàn)紅色?？捡R斯亮藍(lán)在一定濃度乙醇和酸性溶液中呈現(xiàn)紅色。此條件下，考馬斯亮藍(lán)可以

24、與蛋白質(zhì)結(jié)合，顏色從此條件下，考馬斯亮藍(lán)可以與蛋白質(zhì)結(jié)合，顏色從紅色變?yōu)樗{(lán)色，最大吸收峰從紅色變?yōu)樗{(lán)色，最大吸收峰從465nm465nm移至移至595nm595nm。o考染程序考染程序n固定：固定：50%50%乙醇乙醇/10%/10%冰醋酸冰醋酸n染色：染色：45%45%甲醇甲醇/10%/10%冰醋酸冰醋酸/0.25/0.25考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)G250G250n脫色：脫色：25%25%乙醇乙醇/8%/8%冰醋酸冰醋酸n保存保存o考染優(yōu)點(diǎn)考染優(yōu)點(diǎn)n染色過(guò)程簡(jiǎn)單、所需配置的試劑少，操作簡(jiǎn)單，染色過(guò)程簡(jiǎn)單、所需配置的試劑少，操作簡(jiǎn)單，無(wú)毒性，染色背景及對(duì)比度好，與下游的蛋白無(wú)毒性，染色背景及對(duì)比度

25、好，與下游的蛋白質(zhì)鑒定方法兼容質(zhì)鑒定方法兼容o缺陷缺陷n靈敏度遠(yuǎn)低于銀染或熒光染料靈敏度遠(yuǎn)低于銀染或熒光染料n檢測(cè)蛋白質(zhì)的極限是檢測(cè)蛋白質(zhì)的極限是810ng810ngn用含三氯醋酸和乙醇的考馬斯亮藍(lán)染色的蛋白用含三氯醋酸和乙醇的考馬斯亮藍(lán)染色的蛋白質(zhì)易導(dǎo)致谷氨酸羧基側(cè)鏈的不可逆酸催化酯基質(zhì)易導(dǎo)致谷氨酸羧基側(cè)鏈的不可逆酸催化酯基化，使肽譜數(shù)據(jù)復(fù)雜化化，使肽譜數(shù)據(jù)復(fù)雜化n所需時(shí)間長(zhǎng)，所需時(shí)間長(zhǎng)，2448h2448h二、銀染二、銀染二、銀染二、銀染o銀染是非放射性染色中靈敏度最高的，其靈敏度可達(dá)銀染是非放射性染色中靈敏度最高的，其靈敏度可達(dá)200pg200pgo但銀染過(guò)程中醛類(lèi)的特異反應(yīng)，使得對(duì)凝膠

26、酶切肽譜但銀染過(guò)程中醛類(lèi)的特異反應(yīng)，使得對(duì)凝膠酶切肽譜提取存在困難提取存在困難n采用銀染凝膠進(jìn)行圖譜分析，然后加大上樣量，采用銀染凝膠進(jìn)行圖譜分析，然后加大上樣量，進(jìn)行考染并將凝膠切下用于下游鑒定進(jìn)行考染并將凝膠切下用于下游鑒定o銀染和考染的特異性不同，使得兩種不同方法所銀染和考染的特異性不同，使得兩種不同方法所得到二維電泳圖譜可比性不好得到二維電泳圖譜可比性不好o經(jīng)典銀染法經(jīng)典銀染法n二維凝膠在固定液中固定后，在含戊二醛的溶液二維凝膠在固定液中固定后，在含戊二醛的溶液中增敏，然后在中增敏，然后在AgNOAgNO3 3溶液中浸泡，蛋白質(zhì)與溶液中浸泡，蛋白質(zhì)與AgAg+ +結(jié)合，凝膠空白背景中的

27、結(jié)合，凝膠空白背景中的AgAg+ +由于結(jié)合不牢，大部由于結(jié)合不牢，大部分被洗去，而含蛋白質(zhì)的區(qū)域由于自由氨基與分被洗去，而含蛋白質(zhì)的區(qū)域由于自由氨基與AgAg+ +的相互作用，使這些位置的的相互作用，使這些位置的AgAg+ +沒(méi)能被洗去，隨后沒(méi)能被洗去，隨后在堿性環(huán)境中，甲醛溶液將結(jié)合在蛋白帶上的在堿性環(huán)境中，甲醛溶液將結(jié)合在蛋白帶上的AgAg+ +還原為金屬銀，銀顆粒沉積在蛋白點(diǎn)上，沉淀的還原為金屬銀，銀顆粒沉積在蛋白點(diǎn)上，沉淀的銀顆粒又產(chǎn)生自催化反應(yīng)，提高銀染反應(yīng)靈敏度，銀顆粒又產(chǎn)生自催化反應(yīng)，提高銀染反應(yīng)靈敏度，使蛋白點(diǎn)顯示棕黃色或棕黑色使蛋白點(diǎn)顯示棕黃色或棕黑色三、負(fù)染三、負(fù)染o能專(zhuān)

28、門(mén)提高能專(zhuān)門(mén)提高PAGEPAGE膠上蛋白質(zhì)的回收率，但不能用于膜膠上蛋白質(zhì)的回收率，但不能用于膜上染色上染色o速度快（速度快（515min515min），蛋白質(zhì)的生物活性能保持：一），蛋白質(zhì)的生物活性能保持：一旦用絡(luò)合劑如旦用絡(luò)合劑如EDTAEDTA或或Tris/Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液來(lái)絡(luò)合甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液來(lái)絡(luò)合金屬離子就可進(jìn)行提取來(lái)轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)金屬離子就可進(jìn)行提取來(lái)轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)o它主要適用于蛋白質(zhì)顯色、完整蛋白質(zhì)的膠上被動(dòng)提它主要適用于蛋白質(zhì)顯色、完整蛋白質(zhì)的膠上被動(dòng)提取以及質(zhì)譜分析取以及質(zhì)譜分析o負(fù)染的原理負(fù)染的原理n有選擇的將金屬離子沉淀在膠上，蛋白質(zhì)條帶有選擇的將金屬離子沉淀在膠上，蛋

29、白質(zhì)條帶不能被染色，因此，它們所處的位置是透明的不能被染色，因此，它們所處的位置是透明的o重復(fù)性依賴(lài)于許多物理化學(xué)因素（染色液的重復(fù)性依賴(lài)于許多物理化學(xué)因素（染色液的pHpH，膠中，膠中陰離子的濃度、溫度等），它不能作為一種通常運(yùn)用陰離子的濃度、溫度等），它不能作為一種通常運(yùn)用的方法的方法o允許蛋白質(zhì)保持完整并有效回收以做進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)允許蛋白質(zhì)保持完整并有效回收以做進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)分析和生物學(xué)分析n特別是在運(yùn)用咪唑鋅進(jìn)行負(fù)染時(shí)，凝膠中鋅介導(dǎo)的蛋白質(zhì)特別是在運(yùn)用咪唑鋅進(jìn)行負(fù)染時(shí)，凝膠中鋅介導(dǎo)的蛋白質(zhì)固定是完全可以逆轉(zhuǎn)的，洗脫后的蛋白質(zhì)沒(méi)有受到化學(xué)修固定是完全可以逆轉(zhuǎn)的，洗脫后的蛋白質(zhì)沒(méi)有受到

30、化學(xué)修飾，也沒(méi)有受到有機(jī)物的污染，咪唑鋅或者改進(jìn)后的咪唑飾，也沒(méi)有受到有機(jī)物的污染，咪唑鋅或者改進(jìn)后的咪唑- -SDS-SDS-鋅染色法靈敏度接近于銀染（鋅染色法靈敏度接近于銀染（1 1l0ngl0ng），重復(fù)性?xún)?yōu)于），重復(fù)性?xún)?yōu)于用銅或者鋅進(jìn)行的負(fù)染用銅或者鋅進(jìn)行的負(fù)染 四、熒光染色四、熒光染色o熒光試劑對(duì)蛋白質(zhì)無(wú)固定作用，與質(zhì)譜兼容性好，靈熒光試劑對(duì)蛋白質(zhì)無(wú)固定作用，與質(zhì)譜兼容性好，靈敏度高，線(xiàn)性范圍高，適合于大規(guī)模蛋白質(zhì)組研究敏度高，線(xiàn)性范圍高，適合于大規(guī)模蛋白質(zhì)組研究o原理：原理：n利用丙基利用丙基Cy3Cy3和甲基和甲基Cy5Cy5兩種染料分別對(duì)兩種蛋兩種染料分別對(duì)兩種蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行熒

31、光標(biāo)記，并在一塊白質(zhì)樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記，并在一塊2-DE2-DE膠上同膠上同步運(yùn)行，由于兩種修飾后染料的激發(fā)波長(zhǎng)不同，步運(yùn)行，由于兩種修飾后染料的激發(fā)波長(zhǎng)不同，可以在一塊膠上用兩個(gè)波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描，同可以在一塊膠上用兩個(gè)波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描，同時(shí)得到兩個(gè)圖像，經(jīng)相應(yīng)軟件匹配，可方便地時(shí)得到兩個(gè)圖像，經(jīng)相應(yīng)軟件匹配，可方便地找到兩個(gè)樣品間的差異，即完全避免了實(shí)驗(yàn)因找到兩個(gè)樣品間的差異，即完全避免了實(shí)驗(yàn)因素對(duì)重復(fù)性的影響素對(duì)重復(fù)性的影響o缺點(diǎn)缺點(diǎn)n標(biāo)記過(guò)程中的共價(jià)修飾和熒光探針淬滅作用可能標(biāo)記過(guò)程中的共價(jià)修飾和熒光探針淬滅作用可能改變樣品中蛋白的某些性質(zhì)改變樣品中蛋白的某些性質(zhì)( (如移動(dòng)性能、溶解性如移動(dòng)性能、溶解性能能) )，標(biāo)記蛋白與未標(biāo)記蛋白質(zhì)間的輕微相對(duì)分子，標(biāo)記蛋白與未標(biāo)記蛋白質(zhì)間的輕微相對(duì)分子質(zhì)量的差異，可能會(huì)導(dǎo)致分離后蛋白質(zhì)的后續(xù)分質(zhì)量的差異，可能會(huì)導(dǎo)致分離后蛋白質(zhì)的后續(xù)分析出現(xiàn)偏差析出現(xiàn)偏差熒光染料和銀染比較熒光染料和銀染比較雙向熒光差異凝膠電泳雙向熒光差異凝膠電泳金屬螯合染料金屬螯合染料o這是一類(lèi)與現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)研究相兼容的、相對(duì)較新這是一類(lèi)與現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)研究相兼容的、相對(duì)較新的蛋白質(zhì)顯色試劑，其設(shè)計(jì)專(zhuān)