實驗方法的選擇及評價

1、臨床生化實驗方法的選擇及評價教學目標和要求o 掌握：校準物與質(zhì)控物的概念及其區(qū)別，重復性實驗、回收試驗、干擾試驗、對比實驗的方法及指標的計算o 熟悉：參考值的概念，實驗方法的性能標準及其評價指標、醫(yī)學決定水平、危急值o 了解：方法和標準品的分級一、方法的分級：決定性方法、參考方法、常規(guī)方法1.1 決定性方法（definitive method）o 準確度最高o 系統(tǒng)誤差最小o 經(jīng)過詳細的研究，沒有發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生誤差的原因或在某些方面不夠明確的方法o 測定結(jié)果為“確定值”，與“真值”最接近o 技術(shù)要求太高，費用昂貴o 不直接用于鑒定常規(guī)方法的準確性o 只用于發(fā)展及評價參考方法和標準品1.2 參考方法（

2、reference method）o 準確度與精密度已經(jīng)充分證實的分析方法o 干擾因素少，系統(tǒng)誤差很小，與重復測定的隨機誤差相比可以忽略不計o 有適當?shù)撵`敏度、特異性、較寬的分析范圍(線性)o 在條件優(yōu)越的實驗室中經(jīng)常使用o 主要應用于鑒定常規(guī)方法，評價其誤差大小，干擾因素，并決定其是否可以被接受o 也用于鑒定二級標準品，為質(zhì)控血清定值，也可用于評價商品試劑盒等1.3 常規(guī)方法（routine method）o 性能指標符合臨床或其它目的需要o 有適當?shù)姆治龇秶鷒 經(jīng)濟實用o 偏差已知的方法（指準確度已經(jīng)確定的方法，準確度不明者稱為偏差未知的方法）o 常規(guī)方法在作出評價以后，經(jīng)有關(guān)學術(shù)組織認可

3、，可以作為推薦方法常見項目的方法分類項目決定性方法參考方法鉀ID-MS、中子活化法火焰光度法鈉重量分析法、中子活化法火焰光度法氯電量滴定法、中子活化法電流滴定法鈣ID-MS原子吸收分光光度法磷ID-MS-鎂ID-MS原子吸收分光光度法GluID-MS己糖激酶法項目決定性方法參考方法總蛋白-雙縮脲法白蛋白-免疫化學法尿素ID-MS尿素酶法肌酐ID-MS、離子交換層析法離子交換層析法尿酸ID-MS尿酸酶法（紫外）膽紅素-重氮反應法膽固醇ID-MS Abell-Kendall法膽固醇氧化酶法項目決定性方法參考方法TGID-MS酶法ALT-LDH-NADH法AST-MDH-NADH法GGT-連續(xù)監(jiān)測產(chǎn)

4、物生成法CK-NAD+偶聯(lián)法注：ID-MS：同位素稀釋一質(zhì)譜法MDH：蘋果酸脫氫酶 LDH：乳酸脫氫酶二、標準物質(zhì)的分級及質(zhì)控物o 國際標準化委員會（International Standards Organization, ISO)對標準品（參考物）定義：它的一種或幾種物理或化學性質(zhì)已經(jīng)充分確定，被用于校正儀器或用于評價一種測定方法的物質(zhì)。o 標準品分級：n 一級標準物質(zhì)n 二級標準物質(zhì)n 校準物o 質(zhì)控物2.1 標準物質(zhì)（standard material ）o 又稱參考物質(zhì)（ reference material ），是一類充分均勻，并具有一個（或多個）確定特性值的材料或物質(zhì)o 用以校準

5、儀器設備、評價測量方法，或給其它物質(zhì)賦值o 標準物質(zhì)的定值結(jié)果一般表示為：標準值±總不確定度o “標準物質(zhì)證書”是介紹標準物質(zhì)的技術(shù)文件，是研制單位向用戶提出的質(zhì)量保證書和使用說明2.2 一級標準物質(zhì)o 又稱原級參考物( primary reference material )o 是已經(jīng)確定的穩(wěn)定而均一的物質(zhì)，它的數(shù)值由決定性方法確定，或由高度準確的若干方法確定，所含雜質(zhì)也已經(jīng)定量o 用于校正決定性方法，評價及校正參考方法以及為“二級標準品”定值o 一級標準品都有證書認可的參考物質(zhì)o 認可的參考物質(zhì)（Certified Reference Material, CRM ），其特性值由建

6、立了溯源性的程序確定，且每個標準值都附有給定置信水平的不確定度o CRM 470由歐洲共同體參考局制備提供 o CRM 470含14種血清蛋白的定值：白蛋白、Ig A、a1-抗胰蛋白酶、Ig G、C3、Ig M、C4 、巨球蛋白、銅藍蛋白、前白蛋白、C反應蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、酸性糖化蛋白、觸珠蛋白2.3 二級標準物質(zhì)o 又稱二級參考物（secondary reference material）o 用一級標準物質(zhì)校準，參考方法定值o 用于校準常規(guī)方法、為質(zhì)控物定值o 國內(nèi)的幾種二級參考物：n 紅細胞微粒標準物質(zhì) GBW E 090001 n 膽紅素標準物質(zhì) GBW E 090002 n 氰化高鐵血紅

7、蛋白溶液標準物質(zhì) GBW E 090004 n 純化血紅蛋白標準物質(zhì) GBW E 0900112.4 校準物（ Calibrator ）及校準o 用二級標準物質(zhì)和常規(guī)方法校準o 用于對常規(guī)方法和儀器進行校準的物質(zhì)即為校準物o 典型產(chǎn)品：n Roche公司的CFAS（ Calibrator for automation system）n BECKMAN公司的multi Calibrator o 什么是校準（Calibration）：n 用已知濃度的校準物（ calibrator ）在規(guī)定條件下進行測定以找出一個參考點（K值）的過程即為校準n K=校準物濃度/(校準物吸光度試劑空白吸光度) n 常

8、規(guī)條件下校準的用途：獲得K值以便于計算待測標本的結(jié)果2.5 質(zhì)控物（control material ）o 質(zhì)量控制（Quality control）是保證產(chǎn)品（檢驗結(jié)果）滿足要求的過程o 用于確定測量過程的系統(tǒng)誤差，確定是否可以發(fā)出報告o 具有與檢測過程相適應的特性，其成份與檢測樣本的基質(zhì)相同或相似o 用于進行質(zhì)量控制的物質(zhì)即為質(zhì)控物。(血清、配制溶液)o 應使用充分均 一 和穩(wěn)定的質(zhì)控物， 其瓶間變異必須小于監(jiān)測系統(tǒng)預期的變異，其常規(guī)檢測應有助于確認報告范圍o 為了保證質(zhì)控方法對系統(tǒng)性能提供獨立的評價，必須將質(zhì)控物與校準物區(qū)分開來 三、方法選擇的要求：實用性、可靠性3.1 方法的實用性o

9、微量、快速、便于急診，適合成套項目分析o 費用低廉：包括勞動力與試劑、設備及一般管理費用等o 方法簡便o 安全可靠3.2 方法的可靠性o 精密度高：變異系數(shù)（CV）5o 準確度高、特異性好：偏差系數(shù)（CB）5n 準確度（accuracy） ：測定值與“真值”的符合程度n 特異性（Specificity）：只對待測物質(zhì)起化學反應，不與其它結(jié)構(gòu)類似的化合物發(fā)生反應的特性o 檢測限度（檢出限、檢測靈敏度 Analytical sensitivity (lower detection limit)：指能與適當?shù)摹翱瞻住弊x數(shù)相區(qū)別的待測物的最小值檢測限與重復性的關(guān)系四、方法選擇步驟和評價試驗o 查閱文獻

10、o 選定候選方法o 進行初步試驗n 重復性試驗o 批內(nèi)重復性試驗o 天內(nèi)重復性試驗o 天間重復性試驗o 病人標本的平行雙份測定n 回收試驗n 干擾試驗n 方法比較試驗4.1 方法選擇-廣泛查閱文獻o 根據(jù)方法選擇的要求對已發(fā)表的各種方法進行比較與檢驗，確定哪些方法有充分的科學根據(jù)及實用價值o 仔細分析各種方法的特點，選擇適合于本實驗室具體條件的方法，并且要判斷所選方法能否滿足本室工作的需要o 如果文章中沒有寫上方法的有關(guān)性能資料或引用文獻中的有關(guān)論述，則不應輕易采用4.2 方法選擇-選定候選方法o 經(jīng)初步選定的方法稱為候選方法o 候選方法確定后，應關(guān)注該法的有關(guān)指標：n 原理與參考文獻（Tes

11、t principle & References）n 所用儀器品牌、型號（Instrument)n 試劑（或配套試劑盒）的品牌、批號、純度(Reagents) n 標本收集要求（Specimen collection and preparation）n 詳細的操作步驟（Analytic Processing）n 標準曲線和結(jié)果計算(Standard curve & Calculation) n 性能指標（Specific performance data of the test）n 精密度（Precision）n 檢測靈敏度（ Analytical sensitivity ，l

12、ower detection limit）n 干擾因素（Limitations interference）n 檢測（線性）范圍（Measuring range）n 參考值范圍（reference values，Expected values）n 注意事項（Notes）n 安全防護措施（Precautions and warnings）4.3 方法選擇-進行初步試驗o 標準曲線制備及其重復性o 質(zhì)控血清或新鮮標本的重復試驗o 分析待測物濃度不同的標本，與公認的參考方法的測定值作對比o 要有足夠的試驗證明儀器與試劑能符合要求o 初試有希望揭露明顯的問題：未曾預料的困難或誤差來源等o 初試的目的：n

13、 使分析工作者熟悉有關(guān)技術(shù)n 掌握各分析步驟的特性n 操作是否可以改進或簡化n 確定是否有必要作技術(shù)上的某些修改(Modify) 4.3.1 重復性試驗（ repeatability ）o 目的：考察候選方法的精密度（Precision）亦即隨機誤差的大小。反映診斷試驗的可靠性（reliability）。o 精密度是指在一定條件下進行多次測定時，所得測定結(jié)果之間的符合程度o 重復性試驗的方法是對同一試驗樣品進行多次分析測定o 計算：均值（x）、標準差（S）、變異系數(shù)（CV%）批內(nèi)重復性試驗（Within Run）o 用同一份標本在相當短的時間內(nèi)，按規(guī)定的操作方法，在較穩(wěn)定的條件下，作多次（一般

14、為20次）重復性測定o 計算測定結(jié)果的均值（X ）、標準差（S）與變異系數(shù)（CV%）o 不同性質(zhì)的分析對CV值的要求不同，一般應5%天內(nèi)重復性試驗（Between Run）o 在一天內(nèi)對一個或數(shù)個標本作數(shù)批重復測定，其它條件和批內(nèi)相同o 計算測定結(jié)果的均值（X）、標準差（S）與變異系數(shù)（CV%）o 因在一天內(nèi)重復測定幾批，所受影響因素要比批內(nèi)多，所得的CV值可能比批內(nèi)大一些天間重復性試驗（Between Day）o 將同一標本每天一次隨機插入常規(guī)標本中測定，連續(xù)20個工作日o 計算測定結(jié)果的均值（X）、標準差（S）與變異系數(shù)（CV%）o 這樣得到的CV值比上述批內(nèi)與天內(nèi)大，能反映實際工作的情況

15、病人標本的平行雙份測定o 如不易得到含有合適基質(zhì)的穩(wěn)定樣品（如作血液pH的重復性測定的標本），可采用病人標本的雙份測定來代替重復性試驗o 選擇一批病人標本（20至100份），待測物濃度應在實驗方法的分析范圍內(nèi)，有高有低o 記錄標本的特性，如有某種藥物、混濁、溶血或有尿毒癥等，可影響其準確性o 可作一批或幾批分析，但每一標本都平行做兩份，用雙份分析結(jié)果之差（d）來計算S（d/2N）作為不精密度的指標重復性試驗樣品及濃度選擇o 一般用病人混合血清標本或質(zhì)控血清o 在進行天間重復性試驗時，用混合后分裝并低溫保存的血清o 分析物濃度宜選擇在醫(yī)學上具有決定性意義的濃度進行試驗4.3.2 回收試驗o 指分

16、析方法能夠正確測定加入常規(guī)分析樣品中的純分析物的能力o 目的是測定比例系統(tǒng)誤差，以衡量候選方法的準確度o 準確度（accuracy），又稱真實性（validity）是測量值與實際值的符合程度 o 將被分析的純品標準液加入病人樣品中，成為分析樣品，另一份原病人樣品加入相同量的無分析物的溶液作基礎(chǔ)樣品，然后用實驗方法分析，兩者測定結(jié)果的比值為回收率o 計算回收率：實測值/理論值×100%o 理想的回收率為100%，一般95%105%回收試驗注意事項o 準確吸量：被分析物的理論值是根據(jù)加入標準液體積及原樣品的體積計算所得，吸量稍有不準，就會影響結(jié)果o 樣品中加入標準液后，總的濃度必須控制在

17、測定方法的分析范圍內(nèi)，一般須作加入高、中、低不同濃度的回收試驗，計算平均回收率o 加入標準液后，最好使實驗樣品中被測濃度達到醫(yī)學上具有決定意義的濃度o 加入標準液的體積占整個樣品的體積一般不應超過10 。若稀釋過大，誤差將發(fā)生改變，甚至消失4.3.3 干擾試驗及有關(guān)問題o 干擾試驗（Interference test)的目的：用來衡量候選方法給出的結(jié)果是否受非分析物影響及影響程度o 干擾是指在測定某分析物的濃度或活性時，受另一非分析物影響而導致測定結(jié)果增高（正干擾）或降低（負干擾）o 檢測在加入一定濃度的干擾物的條件下，形成的恒定系統(tǒng)誤差o 干擾物質(zhì)可分為內(nèi)源性（標本中存在的）和外源性（外界污

18、染的）兩類 o 干擾物濃度不同，誤差大小也不同干擾試驗及有關(guān)問題o 方法基本與回收試驗一樣，但是加入的是疑有干擾或非特異性反應的物質(zhì)而不是標準液o 可疑干擾物的加入：可疑干擾物的濃度須達到有價值的范圍，有可能應達到病理標本的最高濃度值，在確證有影響后應測定在何濃度時，產(chǎn)生的誤差在臨床上無意義，即確定使分析結(jié)果影響臨床應用價值的最低可疑物濃度值o 被試驗的物質(zhì)可根據(jù)該方法的反應原理，提示出可能的干擾物。一般應考慮的是用膽紅素、溶血（血紅蛋白）、脂血、防腐劑、抗凝劑等消除干擾的常用方法 o 作空白（對照）試驗：n 試劑空白：校正試劑吸光度變化的影響n 標本空白：校正標本中被測物以外的其它物質(zhì)的影響

19、o 采用物理或化學方法，分離除去干擾物o 采用雙波長或多波長等檢測技術(shù)，排除干擾因素 4.4.4 對比試驗(Method Comparison)o 對比試驗用于檢測候選方法的系統(tǒng)誤差n 比例誤差（斜率Slope ） n 恒定誤差（截距intercept）o 對適當?shù)臄?shù)據(jù)進行分析，可確定系統(tǒng)誤差的性質(zhì)究竟是恒定誤差還是比例誤差對比實驗的方法o 選擇參考方法作為對比方法（x）o 對一組病人的標本用候選方法和對比方法同時進行分析測定o 解釋結(jié)果時，一般把方法間的任何分析誤差都歸于候選方法 （y）o 觀察兩者所得結(jié)果之間的差異o 計算回歸方程： y = a + bx ( a= intercept b

20、= Slope) 對比實驗注意事項o NCCLS的EP9-A（用患者樣品進行方法對比及偏倚評估：批準指南）規(guī)定：n 在至少5個工作日內(nèi)最少分析40個患者樣品。增加樣品數(shù)將提高統(tǒng)計估計值的可信度n 用待評方法及參比方法對每一患者樣品進行雙份測定，第二次按相反順序測定n 應盡可能使至少50%樣品的測定結(jié)果處于實驗室的參考范圍之外n o 按EP9-A的方法對數(shù)據(jù)進行處理數(shù)據(jù)處理及其意義o 比較試驗所得的結(jié)果，進行相關(guān)和回歸分析，得出相關(guān)系數(shù)（r）和回歸方程：yabxo 回歸方程可顯示候選方法與參比方法有無系統(tǒng)性誤差n 恒定誤差n 比例誤差n 兩者兼有o 截距a代表恒定誤差o 斜率b代表比例誤差o 相

21、關(guān)系數(shù)r (correlation coefficient)代表兩種方法的相關(guān)性是否密切五、實驗方法的性能標準o 性能標準（performance standards，PS）也稱分析目標o 應根據(jù)不同的應用目的（篩選、診斷、預后、監(jiān)測）而異，兩個指標：n 允許分析誤差（allowable analytical error ）： 用EA表示，規(guī)定為95樣品的允許誤差限度，即95的病人樣品其誤差應小于這個限度n 醫(yī)學決定水平（medical decision level）： 用Xc表示，臨床判斷結(jié)果具有意義的分析物濃度5.1 EA與Xc的關(guān)系o 每個醫(yī)學決定水平都應規(guī)定相應的性能標準，即在一定Xc

22、值下的EA值o 以血清葡萄糖測定為例n Xcl2.8mmol/Ln Xc26.7mmol/L EA均為0.56mmol/Ln Xc38.9mmol/Ln Xc416.8mmol/L，EA為1.4mmol/L5.2 性能標準的制定o 滿足醫(yī)學效用限度（medical usefulness limits）o 符合實驗室所能達到的技能狀態(tài)（state of art）n 根據(jù)參考值與參考范圍而定的標準，Tonks于1963年提出：最大的允許誤差定為±10，對某些物質(zhì)（如酶）則提高到±20n 根據(jù)臨床觀察制定的標準。綜合臨床和實驗室意見：o 在參考范圍內(nèi)的中間及很不正常的水平時，允許

23、有較大的變異系數(shù)o 在醫(yī)學決定水平需要最嚴格的指標n 根據(jù)生物學變異制定的不精密度標準。包括個體內(nèi)變異（CVP）及個體間變異（CVg） n 根據(jù)實驗室技能狀態(tài)制定的標準 5.3 單值判斷指標o 用單值判斷指標（single-value criteria)初步評估 o 計算公式：5.4 使用可信區(qū)間判斷指標判斷 o Westgard推薦用90的可信區(qū)間： o EU為誤差的可信上限，EL為誤差的可信下限 n 如果EUEA，則方法性能可接受； n 如果ELEA，則方法必須改進，以減少誤差 n 如果EUEA，但ELEA，說明僅有的數(shù)據(jù)不足以作出任何有關(guān)可接受性的結(jié)論，還需繼續(xù)實驗以收集更多的數(shù)據(jù)六、生

24、化診斷試驗性能評價6.1 診斷試驗選擇原則o 任何診斷試驗必須具備靈敏度與特異度兩個特征o 靈敏度（Sensitivity）：又稱敏感性、真陽性率（True positive rate，TPR），指診斷試驗檢測出陽性病例的百分率（實際患病且被診斷為陽性的概率）。靈敏度反映診斷試驗正確地識別患病者的能力, 該值愈大愈好。 n 靈敏度=檢測結(jié)果為陽性的病人數(shù)/實際的陽性病人數(shù)×100%o 特異度（Specificity）：又稱特異性、真陰性率（True negative rate，TNR），指診斷試驗確定未患病者的陰性結(jié)果百分率（實際未患病且被診斷為陰性的概率）。特異度反映診斷試驗正確地

25、鑒別非患者的能力，該值愈大愈好。n 特異度=檢測結(jié)果為陰性的人數(shù)/全部受檢者未患病的人數(shù)×100%6.2 參考值概念及其范圍的確定o 20世紀70年代以前，以“正常值”表示健康者的生理數(shù)據(jù)o 1969年Grasbeck首先提出“參考值”概念o 參考值與參考范圍的概念是指對某一規(guī)定人群進行抽樣測定，由此得到均數(shù)值及分布范圍。它只能作為它所代表人群的判斷參考標準 o 某一地區(qū)健康人至少100例，測定結(jié)果統(tǒng)計均值（x）、標準差（s）o 正態(tài)分布的一般將均值（x）定為參考值，x±2s為參考值范圍，非正態(tài)分布的用百分位數(shù)表示6.3 醫(yī)學決定水平和危急值o 醫(yī)學決定水平（medical

26、 decision level）是指臨床按照不同病情給于不同處理的指標閾值n 區(qū)分健康、本病與非本病的界值n 需要治療與判斷預后的界值o 一個診斷試驗一般確定三個醫(yī)學決定水平:n 提示需要進一步檢查的閾值（待診值）n 提示需要采取治療措施的界值（確診值）n 提示預后或需要緊急處理的界值o 危急值（Critical value）：指需要立即采取臨床干預措施的測定值。必須立即報告給臨床人員Recommended Critical Values Test  Lower Limit Upper Limit UnitspH 7.207.50pCO220 60 mm Hg pO2 40 -mm

27、Hg K+ 3.0 6.0 mmol/L Na+ 120 160 mmol/L Cl- 80 125 mmol/L Calcium1.5 3.0 mmol/L Test  Lower Limit Upper Limit UnitsHCO3-  15 35 mmol/L Glu2.5 25 mmol/L Crea *- 1500 mol/L Osmolality 250 330 mOsm/L Mg 0.4 3.0 mmol/L Phos 0.4 3.0 mmol/L * First time Crea:  200 mol/L -加拿大臨床化學協(xié)會1999年6.4 診

28、斷試驗的評價指標6.5 ROC曲線o ROC 是受試者工作特征Receiver Operating Characteristic 或相對工作特征Relative Operating Characteristic 的縮寫ROCo ROC 分析于二十世紀五十年代起源于統(tǒng)計決策理論，后來應用于雷達信號接收能力的評價o 自從八十年代起， ROC廣泛應用于醫(yī)學診斷試驗性能的評價o 通過改變診斷界點，獲得多對TPR與FPR值，以FPR為橫坐標，TPR為縱坐標，繪制ROC曲線，計算與比較ROC曲線下的面積，以此反映診斷試驗的價值ROC曲線及特征o 以假陽性率FPR(1特異度)為橫軸，真陽性率TPR(即靈敏度

29、)為縱軸，橫軸與縱軸長度相等，形成正方形，將ROC曲線各工作點標出來，用直線連接各相鄰兩點構(gòu)建未光滑的ROC曲線o ROC曲線一定通過(0,0)和(1,1)兩點，這兩點分別對應于靈敏度為0而特異度為1，和靈敏度為1而特異度為0o 靠近ROC曲線左上角的點準確性和特異性最好ROC曲線圖及其意義o 當診斷試驗完全無價值時，有TPR=FPR，是一條從原點到右上角的對角線，這條線稱為機會線(chance line)o ROC曲線一般位于機會線的上方，離機會線越遠，說明診斷準確度越高o 最好的診斷試驗在圖中表現(xiàn)為ROC曲線從原點垂直上升至左上角，然后水平到達右上角診斷試劑盒的選擇和評價教學目標和要求o

30、掌握：臨床生化診斷試劑盒的性能指標及質(zhì)量評價方法，能正確地選擇和評價試劑盒o 熟悉：診斷試劑盒的分類和特點o 了解：診斷試劑盒的發(fā)展史以及與方法學的關(guān)系，診斷試劑盒的組成成分及質(zhì)量要求A、生化試劑盒分類及其特點o 商品試劑（與標準液）按檢測項目組合成一套放在一個包裝盒內(nèi)叫試劑盒（reagent kit），或試劑組合（reagent set）o 臨床生化診斷試劑種類繁多：按劑型分類按組成分類液體型單試劑粉劑型雙試劑片劑型多試劑各類試劑盒及其特點一、液體型試劑和粉（片）劑型試劑（一）液體型試劑 o 優(yōu)點：n 試劑組分高度均一，瓶間差異小，測定重復性好n 使用方便n 無需加入任何輔助試劑及蒸餾水，避

31、免了外源性水質(zhì)對試劑的影響，性能較穩(wěn)定，測定結(jié)果較為準確o 缺點：n 保存時間較短（尤其是酶試劑）n 不便于運輸液體單試劑及其缺點p 將某種生化檢驗項目所用到的試劑科學地混合在一起，組成為單一液體試劑?？芍苯討胦 缺點：抗干擾能力較差，給測定結(jié)果帶來分析誤差。例如：n 內(nèi)源性甘油對甘油三酯測定的干擾n 內(nèi)外源性NH4+對酶法測定尿素的干擾 n 內(nèi)源性丙酮酸對ALT、AST測定的干擾 n 維生素C和膽紅素對Trinder反應的干擾（二）粉（片）劑型試劑及其缺點p 將試劑的各組分用球磨技術(shù)粉碎成粉劑或混合后壓成片劑，使用前再加入指定的溶液復溶成液體試劑o 加工和應用過程存在的問題：n 要使試劑組

32、分混合得非常均勻，技術(shù)難度很大n 分裝過程中的稱量誤差及復溶時加水量的準確性影響試劑的瓶間差n 水質(zhì)優(yōu)劣對試劑的穩(wěn)定性和測定的可靠性有相當大的影響二、液體雙試劑盒的特點（一）抗干擾反應能力強（二）測定更科學合理（三）穩(wěn)定性能（四）試劑組分高度均一液體雙試劑及其應用p 液體雙試劑就是將某些生化檢測項目所用到的試劑，按用途科學地分成兩類，分別配成兩種試劑p 通常第一試劑（R1）加入后可起到全部或部分消除某些內(nèi)源性干擾的作用p 第二試劑（R2）為啟動被檢測物質(zhì)反應的試劑p 兩種試劑混合后才共同完成被檢項目的生化反應p 然后用適當?shù)姆椒z測結(jié)果2.1 提高了抗干擾反應的能力o 血標本成分復雜，除了含有

33、待測物質(zhì)外，還含有各種酶、有機物、無機鹽等物質(zhì)o 這些物質(zhì)都會干擾或參與測試反應，引起非特異性反應o 雙試劑型試劑盒設計的一個主要目的就是為了克服干擾反應o 在測定過程中，首先讓試劑1與標本中的干擾物質(zhì)反應，反應5分鐘后，再用試劑2啟動真正的測試反應，從而使測定結(jié)果更加準確雙試劑抗干擾反應測定實例 o 酶法測定尿素，通過二步化學反應來完成o 在340nm下監(jiān)測吸光度值的變化，與同樣處理的尿素標準液比較，計算出樣品尿素含量尿素測定的干擾因素o 第一步特異性高，脲酶只對樣品中的尿素起催化作用o 第二步反應存在一些干擾：n 樣品中的內(nèi)源性NH4+，會消耗NADH，使測定結(jié)果偏高n 復溶試劑時所用蒸餾

34、水如果含有NH4+n 所用器材不夠清潔被NH4+污染（外源性NH4+ ）也會消耗NADH，使測定結(jié)果偏高；n 當樣品中（如血清）含有較高的丙酮酸時，血清中的乳酸脫氫酶會催化丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?，同時消耗NADH，使測定結(jié)果偏高o 也就是說，用單一試劑型試劑測定尿素時存在內(nèi)源性NH4+ 、外源性NH4+和內(nèi)源性丙酮酸的干擾，使測定結(jié)果產(chǎn)生正誤差雙試劑去除干擾o 測定尿素的酶法雙試劑（液體型）試劑盒有兩種試劑，均為液體，不必復溶n 第一試劑含-酮戊二酸、NADH、谷氨酸脫氫酶及維持pH的緩沖物質(zhì)n 第二試劑含脲酶、NADH、-酮戊二酸o 被檢樣品加入第一試劑在37作用5分鐘，將內(nèi)源NH4+ 、外源性N

35、H4+及內(nèi)源性丙酮酸消耗掉o 再加入第二試劑使樣品中的尿素被脲酶水解成NH4+ ，再進行第二步反應：o 此時消耗NADH量與尿素含量成正比，從而保證了尿素測定的準確性雙試劑抗干擾反應測定實例 p 目前在臨床化學檢測中用的較為普遍的指示反應Trinder反應（主要用于代謝產(chǎn)物的測定，如葡萄糖、尿酸、甘油三脂、膽固醇、HDL_C）p Trinder反應的特異性較差，易受血標本中的膽紅素、維生素C的干擾，導致結(jié)果的負偏差液體雙試劑消除干擾o 排除膽紅素的干擾：n 試劑中加入鐵氰化鉀、調(diào)整顯色劑pH、改變測定波長來排除膽紅素的干擾n 加膽紅素氧化酶，先作用黃疸血清使其氧化無色，而后再加反應試劑完成測定

36、o 克服標本中維生素C的干擾：n 在試劑1中加入了維生素C氧化酶，讓標本和試劑1先反應，消除標本中維生素C的干擾，當抗干擾反應完畢后n 再加入試劑2啟動反應，從而使得整個反應的特異性大大提高，準確度也相應提高2.2 使測定更科學合理o 由于液體雙試劑的使用，使測定更加科學合理。如雙試劑測甘油三酯的合理性o 單一試劑:n 測定甘油三酯的含量實際上是標本中甘油三酯與游離甘油的總含量p 液體雙試劑:n 先讓標本與試劑1反應（試劑I中包括甘油激酶、抗壞血酸氧化酶、甘油-3-磷酸氧化酶、過氧化物酶），徹底消耗標本中游離甘油，排除抗壞血酸的干擾n 再用含有LP和發(fā)色團的試劑2啟動反應，使測定的結(jié)果真正反映

37、標本中甘油三酯的含量2.3 性能穩(wěn)定o 臨床化學的許多項目都已用酶法進行測定，酶法測定與化學測定法相比具有更多的優(yōu)越性： n 特異性高n 試劑單一，操作步驟簡單，可自動化n 反應條件溫和n 無污染全液體酶法雙試劑的優(yōu)點p 在使用過程無需任何輔助試劑及蒸餾水，避免了外源水質(zhì)不純而導致對試劑的影響，保證了試劑在有效期內(nèi)的穩(wěn)定性o 可根據(jù)標本量臨用時按一定比例配制適量工作液，當天配制當天用完，減少試劑浪費o 利用自動生化分析儀的雙試劑加樣功能，分別加雙試劑的1、2試劑，延長試劑的有效期酶法試劑的影響因素p 酶法試劑生產(chǎn)的最大技術(shù)障礙是試劑的穩(wěn)定性問題p 凍干、干粉、片劑的酶法試劑，可解決成品貯存與運

38、輸問題p 復溶后穩(wěn)定性受影響p 試劑包裝太大，復溶后穩(wěn)定期過后便會造成浪費p 試劑包裝太小，價格相對偏高2.4 試劑組分高度均一o 試劑中組分均一性是影響試劑測定重復性的一個重要因素o 在干粉、片劑與凍干生化試劑生產(chǎn)、使用過程必須解決的難題：n 原料干粉生產(chǎn)過程中各種組分的均勻性n 在分裝過程中的加樣誤差引起的均勻性問題n 在使用過程中的復溶，溶劑的加樣誤差也會造成瓶間組分濃度的差異p 液體試劑保證了各種組分的均勻性，能提高試劑測定的重復性三、其它類型試劑3.1 快速反應試劑盒o 用途：n 適應生化分析的技術(shù)進步，縮短反應時間，提高工作效率o 實例：n 快速血液葡萄糖測定試劑盒：增加了葡萄糖氧

39、化酶及過氧化物酶用量，更主要是增加了變旋酶，可使反應加快，34分鐘后即生成最終顏色n 快速膽固醇試劑盒：它加大膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶等效應酶用量，使反應加速。樣品與試劑比例是1:100。37反應2分鐘即可完成反應3.2 一步法試劑盒o 屬于方法學改進的新型試劑o 實例:高密度脂蛋白膽固醇（HDL_C）：n 傳統(tǒng)采用超速離心法和沉淀法使HDL從其它脂蛋白中分離后再測定HDL中膽固醇，操作繁瑣，不適合自動分析n 一步法測定：3.3 多項同測組合試劑盒o 方法（三點雙項同測終點法）：n 在同一比色杯中，先后加入兩種試劑與樣品中的兩種被測物發(fā)生反應n 在各反應達到平衡時分別測定吸光度n 整個測定過程

40、進行三次比色，測定兩個項目o 類型:n 三點雙項同測終點法n 三點雙項同測連續(xù)監(jiān)測法n 三點雙項同測終點速率法例：甘油三脂、膽固醇同時測定法p 第一試劑為Tris緩沖液，含膽固醇酯酶、ATP、MgCl2、過氧化物酶、磷酸甘油氧化酶、甘油激酶、脂肪酶、4-氨基安替吡啉、2-羥3.5-氯苯磺酸鈉、Triton-X等，p 第二試劑為Tris緩沖液，含膽固醇氧化酶p 當血清或標準液與第一試劑混合后立即進行第一次比色（510nm）得空白吸光度。p 37作用5分鐘后進行第二次比色，為甘油三酯與酶試劑反應終點的吸光度，又是膽固醇測定的空白吸光度p 再加入第二試劑，37作用510分鐘，進行第三次比色，為膽固醇

41、與酶試劑反應終點的吸光度三點同測TG、TC的計算o 甘油三酯濃度=A2（樣品）-AB（樣品）/A2（TG標準）-AB（TG標準）×甘油三酯標準的濃度 o 總膽固醇濃度=A3（樣品）-A2（樣品）/A3（TC標準）-A2（TC標準）×膽固醇標準的濃度3.4 條碼試劑盒o 掃描二維條碼可快捷準確地在系統(tǒng)中輸入試劑數(shù)據(jù)，如測試項目的程序參數(shù)、試劑批號、有效期等等E170的條碼試劑盒p 二維條形碼自動輸入全部信息p 試劑聯(lián)體包裝，成分獨立，穩(wěn)定性好p 無需配制，打開即用p 儀器可以自動開蓋3.5 濃縮試劑盒o 采用濃縮試劑，使用時自動完成稀釋o 優(yōu)點：n 濃縮試劑便于工作、儲存、運

42、輸、裝載n 濃縮試劑便于監(jiān)控、減少校正次數(shù)、提高工作質(zhì)量o 應用擴展：在濃縮試劑基礎(chǔ)上又組成雙試劑及多項同測組合試劑，發(fā)揮各自所具有的特點及優(yōu)越性B、生化診斷試劑盒的選擇一、生化試劑盒的性能指標1.1 準確度指標o 回收試驗：回收率越接近100%，準確率越高，一般以100%±5%為合格。o 定值血清測定：對于某些無法準確加入標準物的試劑盒，可用低、中、高濃度的定值血清進行測定，測得值符合定值血清的靶值范圍（±2S）為合格o 干擾試驗：對維生素C、黃疸、溶血、乳糜等因素的耐受程度，干擾值越小越好o 對比試驗：將被檢試劑盒與公認的參考方法同時測定若干樣本，計算兩組結(jié)果的相關(guān)系數(shù)

43、和回歸方程:o 相關(guān)系數(shù)r越接近1.0、斜率b越接近1.0，截距a越接近0，則準確度越高。o 相關(guān)系數(shù)要求在0.91.0之間，r值符合要求不等于準確度都符合要求。o b表示比例偏差。（1-b）×100%表示比例偏差的大小o a表示恒定偏差。（a值/樣品含量）×100%表示恒定偏差的大小1.2 精密度 o 考察試劑的瓶間差異、批內(nèi)精密度和批間差異，三組測定的平均值之間應無顯著差異，否則，試劑盒的均一性不符合要求。o 瓶間差異：同一試劑盒，取10瓶試劑復溶，測定同一樣品的含量，求平均值、標準差、變異系數(shù)o 批內(nèi)精密度：同一樣品用同一瓶試劑測定10次，求平均值、標準差、變異系數(shù)o

44、 批間差異：同一樣品，用不同批號的10瓶試劑測定，求平均值、標準差、變異系數(shù)1.3 線性范圍o 指該試劑盒按其說明使用時可準確測量的范圍o 試劑盒的測定線性范圍是衡量試劑盒質(zhì)量的一個指標，也是正確使用該試劑盒的關(guān)鍵之一o 試劑盒測定線性范圍要求能覆蓋該項測定的常見醫(yī)學決定水平n 測定線性范圍太窄時，常規(guī)工作中需調(diào)整標本量，重做的標本多，造成人力、物力、財力和時間的浪費n 測定線性范圍也不必過大，否則，成本高，價格貴，原材料浪費o 檢測試劑盒的測定線性范圍：o 用標本、定值血清或標準液操作，高濃度標本含量應超過說明書線性上限的20%，整個線性需要五組不同的濃度，每組均需測定三次，并求平均值1.4

45、 抗干擾作用o 雙試劑型試劑盒主要優(yōu)點是抗干擾作用o 實例：o ALT雙試劑盒的第一試劑能排除內(nèi)源性丙酮酸干擾n 第一試劑加入被檢血清后，375分鐘內(nèi)顯示NADH被消耗、340nm吸光度值下降的曲線，當內(nèi)源性丙酮酸被消耗完，吸光度曲線平坦n 加入第二試劑后，340nm吸光度立即上升，當ALT酶促反應發(fā)生后又下降。這種反應曲線顯示了ALT雙試劑具抗干擾作用。o 甘油三脂測定雙試劑的排除游離甘油的干擾n 可加入甘油標準液進行試驗，以證實排除游離甘油的能力1.5 靈敏度o 終點法靈敏度以特定波長下1cm光徑時單位濃度的吸光度值表示n 如膽固醇酶法測定試劑盒要求其靈敏度在500nm比色，A為0.005

46、時的膽固醇濃度相當于0.08mmol/Lo 連續(xù)監(jiān)測法以特定波長下1cm光徑單位酶活性的吸光度值表示n 試劑盒質(zhì)量合格時，其靈敏度值與理論計算的A/min×F 一致o 試劑盒的質(zhì)量與靈敏度密切相關(guān)，靈敏度達不到要求的試劑盒不宜使用1.6 穩(wěn)定性o 試劑盒穩(wěn)定性是指試劑盒在規(guī)定條件下儲存仍保持其性能指標的期限。該期限應符合規(guī)定的儲存期。方法有以下三種。o 1原包裝試劑的穩(wěn)定性：n 按說明書的保存方法儲藏，于不同時期取出一瓶復溶，測定試劑吸光度值、標準品含量、定值血清含量、線性范圍、酶促反應時間曲線或化學反應速度時間曲線及其他性能指標，直到這些指標變化超出規(guī)定值的10%以上的期限，為原包

47、裝試劑的穩(wěn)定期o 2復溶后試劑的穩(wěn)定性：n 將復溶試劑分別放在4、25保存，逐日與新復溶試劑對比，觀察上述指標（見原包裝試劑穩(wěn)定性），直到測定結(jié)果與新復溶試劑的差值>10%以上，這一期限為復溶后試劑在規(guī)定溫度下的穩(wěn)定期o 3不同溫度下的保存期:n 將原包裝試劑盒置4 、25、37保存，以出現(xiàn)說明試劑變質(zhì)的指標來確定在不同溫度下的保存期二、選購試劑盒的要求和注意事項2.1 選購試劑盒的一般要求o 試劑盒所采用的測定方法特異性好，靈敏度、準確度、精密度符合衛(wèi)生部臨床檢驗中心、IFCC、WHO等推薦的方法性能o 試劑盒的儲存期至少為1年o 水溶性、低粘性、無腐蝕、無毒害、不爆炸、不易燃、不污染

48、環(huán)境o 所用標準品或參考物符合衛(wèi)生部臨床檢驗中心、IFCC、WHO推薦的標準和要求2.2 選購試劑盒的注意事項o 首先要仔細閱讀試劑盒的說明書，對試劑盒選用方法有所了解n 科學研究工作時應選擇參考方法試劑盒n 醫(yī)療預防工作應選擇推薦的常規(guī)方法試劑盒，或選擇公認的測定方法試劑盒n 對試劑盒的組成、方法性能指標加以分析n 是用于手工操作，還是用于自動分析儀n 其實驗參數(shù)是否與適用于本單位自動分析儀o 有無衛(wèi)生部的批準文號n 凡已列入衛(wèi)生部臨床檢驗體外診斷試劑審批管理范圍的試劑盒，沒有生產(chǎn)批準文號的，不應使用n 對有生產(chǎn)批準文號者，也需考察生產(chǎn)廠家的信譽o 對試劑盒的包裝、理學性能、方法學性能指標進行考察和檢測，并經(jīng)實際應用。符合說明書規(guī)定及本室實驗要求者方可選購o 根據(jù)本單位的日工作量、分析儀試劑用量、試劑復溶后4穩(wěn)定期等因素綜合分析，應選購合適包裝，近期出廠的產(chǎn)品o 注意季節(jié)、氣溫對試劑質(zhì)量的影響，防止試劑盒在運輸途中變質(zhì)o 在確保試劑盒質(zhì)量前提下，應選購價格低的產(chǎn)品C、生化試劑盒的性能評價一、說明書審