產(chǎn)物的膠回收分離純化

1、 PCR產(chǎn)物的膠回收分離純化 一、實(shí)驗(yàn)儀器1、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)2、紫外觀察分析儀3、離心機(jī)4、單面刀片5、恒溫水浴鍋二、試劑1、 DNA回收試劑盒2、50×TAE3、ddH2O3、 步驟1 在紫外燈下切分含DNA的瓊脂糖塊，盡可能除去多余的瓊脂糖放入1.5ml離心管中。4. 稱量膠塊重量，計(jì)算膠塊體積。計(jì)算膠塊體積時(shí)，以 1 mg=1 l 進(jìn)行計(jì)算。 5. 向膠塊中加入膠塊融化液 DR-I Buffer，DR-I Buffer 的加量如下表： 凝膠濃度 DR-I Buffer 使用量 1.0 3 個(gè)凝膠體積量 1.01.5 4 個(gè)凝膠體積量 1.52.0 5 個(gè)凝膠體積量 6. 均

2、勻混合后 75加熱融化膠塊（低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠只需在 45加熱）。此時(shí)應(yīng)間斷振蕩混合，使膠塊充分融化（約 610 分鐘）。注）膠塊一定要充分融化，否則將會(huì)嚴(yán)重影響 DNA 的 回收率。 7. 向上述膠塊融化液中加入DR-I Buffer量的1/2體積量的 DR-II Buffer，均勻混合。當(dāng)分離小于 400 bp 的 DNA 片段時(shí)，應(yīng)在此溶液中再加入終濃度為 20% 的異丙醇。 8. 將試劑盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。 9. 將上述操作 7 的溶液轉(zhuǎn)移至 Spin Column 中，12,000 rpm 離心 1 分鐘，棄濾液。 注）如將濾液再

3、加入 Spin Column 中離心一次，可以 提高 DNA 的回收率。 10. 將500 l的漂洗液Rinse A加入Spin Column中，12,000 rpm 離心 30 秒鐘，棄濾液。 11. 將700 l的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm 離心 30 秒鐘，棄濾液。注）請(qǐng)確認(rèn)Rinse B中已經(jīng)加入了指定體積的100%乙醇。 12. 重復(fù)操作步驟 11。 13. 將 Spin Column 安置于新的 1.5 ml 的離心管上，在 Spin Column 膜的中央處加入 25 l 的滅菌蒸餾水或 Elution Buffer，室溫靜置 1 分鐘。注）

4、把滅菌蒸餾水或 Elution Buffer 加熱至 60使用時(shí)有利于提高洗脫效率。 14. 12,000 rpm 離心 1 分鐘洗脫 DNA。將1.5ml離心管(DNA)貯存于-20。15 瓊脂糖凝膠電泳檢測回收產(chǎn)物。 制備 ：溶膠液：6 M NaClO 4 (pH 5.2) ，0.03M NaAC(pH 5.2)溴酚紅少許 洗液：50 mM Tris-cl，0.1 mM EDTA，pH 8.0) 70%乙醇 存儲(chǔ)液：TE buffer (10 mM Tris-cl，0.1 mM EDTA，pH 8.0). 注意事項(xiàng)1. 電泳的buffer和gel都是新制的，切膠的臺(tái)子清理干凈，刀片最好洗凈滅菌，總之一句話就是保證切下的帶沒有外源dna污染。2. 切膠是要把整個(gè)目的片斷所在位置的膠全部回收。為了減少膠的體積，可以用相對(duì)比較薄的膠來做，只要夠點(diǎn)樣即可，也可采用薄而寬的梳子來跑膠。3. 關(guān)于防護(hù)，在一般有機(jī)玻璃后就足夠了，戴上防護(hù)面具以保護(hù)眼睛，如果戴樹脂眼鏡就可以了。要是非常害怕紫外照射，或者對(duì)于膠有特殊要求，例如要求不含EB，可以采用點(diǎn)marker和帶刻度的尺子一起照相的方法來確定目的條帶在膠上的位置進(jìn)行切膠。4. 按照正常程序點(diǎn)marker跑膠，然后切下有marker的膠，EB染色，紫外燈下與帶刻度的尺子一起照相。由于要回收