動物基因組DNA的分離與核酸濃度的測定

1、動物基因組動物基因組DNA的分離與的分離與核酸濃度的測定核酸濃度的測定實驗方法實驗方法 n先將小鼠肝臟進行預處理：斷頸法處死一只小鼠，先將小鼠肝臟進行預處理：斷頸法處死一只小鼠，采集肝臟組織，用生理鹽水清洗血污。采集肝臟組織，用生理鹽水清洗血污。n取一只小鼠的肝臟（約取一只小鼠的肝臟（約2g），加入），加入20 mL勻漿緩沖勻漿緩沖液（液（STE buffer），用電動組織勻漿器勻漿至無明），用電動組織勻漿器勻漿至無明顯組織塊存在（最好冰浴操作）。顯組織塊存在（最好冰浴操作）。n將組織細胞的勻漿液體轉(zhuǎn)移至將組織細胞的勻漿液體轉(zhuǎn)移至15 mL藍蓋離心管中，藍蓋離心管中，4 4000 r/min離

2、心離心15 min，棄上清，留沉淀。，棄上清，留沉淀。n沉淀中加入沉淀中加入6 mL消化緩沖液（含蛋白酶消化緩沖液（含蛋白酶K），輕輕），輕輕反轉(zhuǎn)混勻，反轉(zhuǎn)混勻，5055 溫育溫育1 h。n加入加入RNA酶（酶（10mg/mL）至終濃度）至終濃度200 g/mL，37水浴水浴0.5 h。n每小組取每小組取1.5 ml EP管，加入上述消化細胞液管，加入上述消化細胞液600ul ，加，加入等體積酚氯仿異戊醇，緩慢顛倒離心管使兩相均勻入等體積酚氯仿異戊醇，緩慢顛倒離心管使兩相均勻混合形成乳濁液，混合形成乳濁液，1200 r/min，4離心離心10 min。n小心吸出小心吸出EP管中的上層液體，即為

3、含管中的上層液體，即為含DNA的水相，注意的水相，注意不要吸中間界面上一層厚的白色物質(zhì)（蛋白質(zhì)沉淀）。然不要吸中間界面上一層厚的白色物質(zhì)（蛋白質(zhì)沉淀）。然后加入等體積氯仿異戊醇，后加入等體積氯仿異戊醇，12000 r/min，4離心離心10 min。(如果界面或水相中含蛋白質(zhì)沉淀較多，可重復操作如果界面或水相中含蛋白質(zhì)沉淀較多，可重復操作67)n小心吸出上層含小心吸出上層含DNA的水相，加入的水相，加入1/10體積體積NaAc，充分，充分混勻，然后加入混勻，然后加入2倍體積的無水乙醇，充分混勻，置倍體積的無水乙醇，充分混勻，置20冰箱約冰箱約2 h。n12000 r/min，4離心離心10 m

4、in，棄上清液，得到的白色，棄上清液，得到的白色沉淀。加入沉淀。加入1 mL 70冷乙醇洗滌，繼續(xù)離心，獲得沉淀，冷乙醇洗滌，繼續(xù)離心，獲得沉淀，室溫干燥。加入室溫干燥。加入50 L TE緩沖液溶解，即可得到基因組緩沖液溶解，即可得到基因組DNA。20冰箱保存。冰箱保存。n如果要對提取的如果要對提取的DNA進行完整性鑒定，可通過瓊脂糖凝膠。進行完整性鑒定，可通過瓊脂糖凝膠。方法是取方法是取1 l溶解的溶解的DNA樣品，在樣品，在1的瓊脂糖凝膠中進的瓊脂糖凝膠中進行電泳，用溴化乙錠（或行電泳，用溴化乙錠（或Goldenview）染色觀察結(jié)果。）染色觀察結(jié)果。n每組取每組取1 L 、2 L DNA

5、樣品，加樣品，加0.4 L電泳上樣緩沖液電泳上樣緩沖液（含溴酚藍），少量的水（含溴酚藍），少量的水（10 ul），混勻后加樣于瓊脂），混勻后加樣于瓊脂糖凝膠孔內(nèi)。糖凝膠孔內(nèi)。n電泳（小膠電泳（小膠100-120V，大膠，大膠150-180V）：使）：使DNA移入瓊移入瓊脂糖膠內(nèi)。一般為溴酚藍遷移至中間即可停止電泳。脂糖膠內(nèi)。一般為溴酚藍遷移至中間即可停止電泳。n用短波紫外線（用短波紫外線（254 nm）進行拍照，比較樣品）進行拍照，比較樣品DNA與與DNA標準品（標準品（marker）的熒光強度（一般最亮的條帶為）的熒光強度（一般最亮的條帶為750bp，上樣，上樣5 ul約約100 ng），并計算出待測樣品中），并計算出待測樣品中DNA的濃度。的濃度。n如果如果DNA已經(jīng)降解，已經(jīng)降解，DNA的帶就會拖尾巴，或出現(xiàn)彌散