水中退伍軍人菌檢測(cè)方法

1、水中退伍軍人菌檢測(cè)方法NIEA W238.50C一、方法概要水樣經(jīng)濃縮及酸處理後，塗抹於活性碳酵母萃取物選擇性培養(yǎng)基（Buffered charcoal yeast extract agar with selective supplements, BCYE with selective supplements），在二氧化碳培養(yǎng)箱，36 ± 1，培養(yǎng)5 ± 2天，疑似退伍軍人菌（Legionella spp.）的菌落，應(yīng)進(jìn)行半胱氨酸需求試驗(yàn)（L-cysteine requirement test）、革蘭氏染色（Gram stain）及直接螢光抗體染色試驗(yàn)（Direct imm

2、unofluorescent antibody test，DFA）或乳膠凝集試驗(yàn)（Latex agglutination test）確認(rèn)。   凡生長(zhǎng)於含半胱氨酸之活性碳酵母萃取物培養(yǎng)基（BCYE），但不生長(zhǎng)於不含半胱氨酸之活性碳酵母萃取物培養(yǎng)基（BCYE without L-cysteine）之菌落，革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性桿菌，無(wú)莢膜、不產(chǎn)孢子、短胖型或長(zhǎng)絲型，及直接螢光抗體檢驗(yàn)或乳膠凝集試驗(yàn)呈陽(yáng)性反應(yīng)者，即判定為退伍軍人菌陽(yáng)性菌落。 二、適用範(fàn)圍 (一)本方法適用飲用水水質(zhì)、飲用水之水源水質(zhì)及水塔冷卻水中退伍軍人菌之檢驗(yàn)。 (二)生物安全等級(jí)二級(jí)以上之實(shí)驗(yàn)室才能進(jìn)行本方法之檢

3、測(cè)。三、干擾 (一)水樣中含有抑制或促進(jìn)退伍軍人菌生長(zhǎng)之物質(zhì)（如水樣中含有消毒劑或營(yíng)養(yǎng)源會(huì)抑制或促進(jìn)生長(zhǎng)）。 (二)檢測(cè)使用的器皿及設(shè)備含有抑制或促進(jìn)退伍軍人菌生長(zhǎng)的物質(zhì)（如器皿及設(shè)備含有清潔劑或營(yíng)養(yǎng)源會(huì)抑制或促進(jìn)生長(zhǎng)）。 (三)濁度過(guò)高之水樣易造成濾膜孔隙阻塞，將影響水樣的濃縮效率，進(jìn)而影響檢測(cè)結(jié)果。 (四)雜菌過(guò)多將遮蔽或抑制退伍軍人菌之生長(zhǎng)。 四、設(shè)備與材料 (一)量筒：100至1000 mL之量筒。 (二)吸管：有0.1 mL刻度之10 mL滅菌玻璃吸管或市售無(wú)菌塑膠吸管，或無(wú)菌微量吸管（micropipet）。 (三)試管：大小約150 × 15 mm之試管或有蓋螺旋試管。

4、 (四)稀釋瓶：容量約100 mL可滅菌之硼矽玻璃製品。 (五)錐形瓶：200至2000 mL之可滅菌硼矽玻璃製品。 (六)採(cǎi)樣容器：容量500 mL以上無(wú)菌之硼矽玻璃瓶或無(wú)菌塑膠有蓋容器，或市售無(wú)菌袋。 (七)冰箱：溫度能保持在4 ± 2者。 (八)培養(yǎng)皿：可滅菌硼矽玻璃製或可拋棄式無(wú)菌塑膠製培養(yǎng)皿，大小為90100 × 15 mm或其他適當(dāng)大小。 (九)過(guò)濾裝置：能耐高溫高壓滅菌的玻璃、塑膠、陶瓷或不鏽鋼等材質(zhì)構(gòu)成之無(wú)縫隙漏斗，以鎖定裝置、磁力或重力固定於底部。 (十)抽氣幫浦：水壓式或吸氣式，壓力差最好在138至207 kPa者。 (十一)濾膜：直徑47 mm，孔徑0

5、.22 m的無(wú)菌聚碳酸濾膜（polycarbonate membrane）。 (十二)天平：待測(cè)物重量大於2 g時(shí)，須能精秤至0.01 g；待測(cè)物重量不大於2 g時(shí)，須能精秤至0.001 g。 (十三)二氧化碳培養(yǎng)箱（CO2培養(yǎng)箱）：能提供2.55.0% CO2，溫度能保持在36 ± 1者。 (十四)高壓滅菌釜：溫度能維持在 121（壓力約15 lb / in2或1.1 Kg / cm2）滅菌15分鐘以上者。 (十五)高溫乾熱烘箱：如用於玻璃器皿等用具之滅菌，溫度須能保持在160達(dá)2小時(shí)或170達(dá)1小時(shí)以上者。 (十六)加熱板：可調(diào)溫度，並附磁石攪拌功能。 (十七)鑷子：前端平滑、內(nèi)

6、側(cè)無(wú)波紋，使用前浸泡於95%酒精再以火燄燃燒滅菌。 (十八)接種環(huán)：為白金或鎳鉻合金製，適用於細(xì)菌接種或移植，亦可使用無(wú)菌塑膠製品。 (十九)水浴槽：溫度能保持在約50者。 (二十)第二級(jí)生物安全櫃（Class BSC）。 (二十一)pH計(jì)：pH計(jì)之精密度必須達(dá)到0.1 pH單位。用於內(nèi)含瓊脂培養(yǎng)基之pH值測(cè)定時(shí)，應(yīng)搭配表面電極（surface probe）。 (二十二)解剖顯微鏡：能放大1020倍。 (二十三)光學(xué)顯微鏡：能放大至1000倍油鏡。 (二十四)螢光顯微鏡：能放大至1000倍。 (二十五)紫外光燈：波長(zhǎng)365 nm。 (二十六)試管震盪器（Vortex mixer）。 (二十七)

7、馬克法藍(lán)氏濁度標(biāo)準(zhǔn)計(jì)（McFarland nephelometer standard units）。 (二十八)玻片及蓋玻片：光學(xué)染色及螢光染色專用兩種。 (二十九)乳膠或PVC手套。 (三十)離心機(jī)：轉(zhuǎn)速可達(dá)3000 g，30分鐘以上，能控制溫度在4 ± 2者。 (三十一)離心管：1050 mL，具螺紋蓋為佳。 五、試劑 (一)試劑水：蒸餾水或去離子水，導(dǎo)電度在25時(shí)小於2 mho / cm（S / cm）。 (二)0.2 M HCl：配製方法可任選下列任一種方式（用於配製HCl-KCl酸性緩衝液） 、取17.4 mL 35.4%濃鹽酸（試藥級(jí)）（比重1.18），加試劑水至1 L。

8、 、取20.0 mL 31.5%濃鹽酸（試藥級(jí)）（比重1.16），加試劑水至1 L。 (三)0.2 M KCl：（用於配製HCl-KCl酸性緩衝液） 秤取14.92 g KCl（試藥級(jí)），先溶於少量試劑水中，俟完全溶解後，再加試劑水至全量為 1 L。 (四)1 N HCl：配製方法可任選下列任一種方式（用於調(diào)整培養(yǎng)基之pH值） 、取8.8 mL 35.4%濃鹽酸（試藥級(jí)）（比重1.18），加試劑水至100 mL。 、取10.0 mL 31.5%濃鹽酸（試藥級(jí)）（比重1.16），加試劑水至100 mL。 (五)1 N KOH：（用於調(diào)整培養(yǎng)基之pH值） 秤取5.6 g KOH（試藥級(jí)），先溶於少

9、量試劑水中，俟完全溶解後，再加試劑水至全量為100 mL。 (六)1倍磷酸鹽緩衝液：（用於直接螢光抗體檢驗(yàn)） 磷酸二氫鉀（KH2PO4）（試藥級(jí)）2 g 氯化鉀（KCl）（試藥級(jí)）2 g 氯化鈉（NaCl）（試藥級(jí)）80 g 磷酸氫二鈉（Na2HPO4）（試藥級(jí)）11.5 g   配製方法：將以上成分混合，先溶於少量試劑水中，俟完全溶解後，再加試劑水至全量為1 L。(七)1%甲醛（福馬林）：（用於直接螢光抗體檢驗(yàn)） 取2.67 mL 37.5%福馬林（試藥級(jí)），加1倍磷酸鹽緩衝液至100 mL。 (八)3%硫代硫酸鈉：取3 g無(wú)水硫代硫酸鈉（試藥級(jí)），先溶於少量試劑水中，俟完全溶解後

10、，再加試劑水至全量為100 mL。 (九)培養(yǎng)基 、活性碳酵母萃取物培養(yǎng)基：由下列I、II、III等成份配製而成（用於疑似退伍軍人菌菌落之半胱胺酸需求試驗(yàn)、菌株純化及次培養(yǎng)） I基礎(chǔ)活性碳酵母萃取物培養(yǎng)基（BCYE agar base）（市售商品化培養(yǎng)基）酵母萃取物（Yeast extract）10.0 g 活性碳（Activated charcoal）2.0 g -酮戊二酸（Alpha-ketoglutarate）1.0 g 乙醯胺基-2-氨基乙磺酸（ACES）10.0 g （N-2-acetamido-2-aminoethanesulfonic acid） 焦磷酸鐵（Ferric pyro

11、phosphate）0.25 g 瓊脂（Agar）15.0 g II氫氧化鉀（KOH）（試藥級(jí)）2.4 g III 半胱氨酸（L-cysteine）（試藥級(jí)）0.4 g 配製方法：秤取BCYE agar base 38.25 g 溶於500 mL的試劑水中，秤取氫氧化鉀2.4 g溶於490 mL的試劑水中，混合兩者，俟完全溶解後，以121滅菌15分鐘，冷卻至約 50備用。秤取半胱氨酸0.4 g溶於10 mL的試劑水中，俟完全溶解後，以0.22 µm或0.45 µm濾膜過(guò)濾除菌。兩者充份混合後，以1 N HCl或1 N KOH調(diào)整pH值，先倒出小部份培養(yǎng)基，待凝固後

12、以表面電極測(cè)定，培養(yǎng)基最終pH值應(yīng)為6.9 ± 0.1。倒入約20 mL之培養(yǎng)基於無(wú)菌培養(yǎng)皿中，室溫下凝固。未用完之培養(yǎng)基可保存於冰箱中，4 ± 2下保存期限為30天。 、不含半胱氨酸之活性碳酵母萃取物培養(yǎng)基：由下列I、II等成份配製而成（用於疑似退伍軍人菌菌落之半胱胺酸需求試驗(yàn)） I基礎(chǔ)活性碳酵母萃取物培養(yǎng)基（市售商品化培養(yǎng)基） 酵母萃取物10.0 g 活性碳2.0 g -酮戊二酸1.0 g 乙醯胺基-2-氨基乙磺酸10.0 g 焦磷酸鐵0.25 g 瓊脂15.0 g II 氫氧化鉀（試藥級(jí)）2.4 g   配製方法：秤取BCYE agar base 38.25

13、 g溶於500 mL的試劑水中，秤取氫氧化鉀2.4 g溶於500 mL的試劑水中，混合兩者，俟完全溶解後，以121滅菌15分鐘，冷卻至約50，以1 N HCl或1 N KOH調(diào)整pH值，先倒出小部份培養(yǎng)基，待凝固後以表面電極測(cè)定，培養(yǎng)基最終pH值應(yīng)為6.9 ± 0.1。倒入約20 mL之培養(yǎng)基於無(wú)菌培養(yǎng)皿中，室溫下凝固。未用完之培養(yǎng)基可保存於冰箱中，4 ± 2下保存期限為30天。本培養(yǎng)基可以血液瓊脂培養(yǎng)基（Blood agar）替代。 、血液瓊脂培養(yǎng)基（Blood agar）（市售商品化培養(yǎng)基）：即胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基（Tryptic soy agar）添加5%馬或綿羊血（

14、Horse or sheep blood）：（用於疑似退伍軍人菌菌落之半胱胺酸需求試驗(yàn)） 胰化蛋白腖（Tryptone）15.0 g 大豆蛋白腖（Soytone）或硫化蛋白腖（Thiopeptone）5.0 g 氯化鈉（NaCl）5.0 g 瓊脂（Agar）15.0 g 蒸餾水（Distilled water）加至950 mL 馬或綿羊血（Horse or sheep blood）50 mL   配製方法：秤取培養(yǎng)基40g，溶於950 mL的試劑水中，經(jīng)121滅菌15分鐘後，冷卻至約50，在無(wú)菌環(huán)境下加入50 mL馬或綿羊血，充分混合後，倒入約20 mL之培養(yǎng)基於無(wú)菌培養(yǎng)皿中，室溫下

15、凝固。未用完之培養(yǎng)基可保存於冰箱中，4 ± 2下保存期限為30天。 、活性碳酵母萃取物選擇性培養(yǎng)基：可選用以下選擇性培養(yǎng)基任一種。 ()DGVP選擇性培養(yǎng)基：由下列I、II、III、IV等成份配製而成（BCYE with Dye, Glycine, Vancomycin, Polymyxin B）（用於篩選水樣中之退伍軍人菌）I 基礎(chǔ)活性碳酵母萃取物培養(yǎng)基（市售商品化培養(yǎng)基） 酵母萃取物10.0 g 活性碳2.0 g -酮戊二酸1.0 g 乙醯胺基-2-氨基乙磺酸10.0 g 焦磷酸鐵0.25 g 瓊脂15.0 g II 氫氧化鉀（試藥級(jí)）2.4 g III 半胱

16、氨酸（試藥級(jí)）0.4 g IV DGVP染料及抗生素添加劑（市售商品化抗生素添加劑）   Glycine3.0 g   Vancomycin1 mg   Polymycin B50000 IU   Bromocresol purple10 mg   Bromothymol blue10 mg 配製方法：秤取BCYE agar base 38.25 g溶於500 mL的試劑水中，秤取氫氧化鉀2.4 g，溶於480 mL的試劑水中，混合兩者，俟完全溶解後，以121滅菌15分鐘，冷卻至約50備用。秤取半胱氨酸0.4 g溶於10 mL的試劑水

17、中，俟完全溶解後，以0.22 µm或0.45 µm濾膜過(guò)濾除菌。取1管市售之DGVP染料及抗生素添加劑溶於10 mL的試劑水中，俟完全溶解後，以0.22 µm或0.45 µm濾膜過(guò)濾除菌。三者充份混合後，以1 N HCl或1 N KOH調(diào)整pH值，先倒出小部份培養(yǎng)基，待凝固後以表面電極測(cè)定，培養(yǎng)基最終pH值應(yīng)為6.9 ± 0.1。倒入約20 mL之培養(yǎng)基於無(wú)菌培養(yǎng)皿中，室溫下凝固。未用完之培養(yǎng)基可保存於冰箱中，4 ± 2下保存期限為30天。()CCVC選擇性培養(yǎng)基：由下列I、II、III、IV等成份配製而成（BCYE with Cep

18、halothin, Colistin, Vancomycin, Cycloheximide）（用於篩選水樣中之退伍軍人菌）I 基礎(chǔ)活性碳酵母萃取物培養(yǎng)基（市售商品化培養(yǎng)基） 酵母萃取物10.0 g 活性碳2.0 g -酮戊二酸1.0 g 乙醯胺基-2-氨基乙磺酸10.0 g 焦磷酸鐵0.25 g 瓊脂15.0 g II 氫氧化鉀（試藥級(jí)）2.4 g III 半胱氨酸（試藥級(jí)）0.4 g IV CCVC抗生素添加劑（市售商品化抗生素添加劑） Cycloheximide80 mg Colistin16 mg  Vancomycin0.5 mg Ce

19、phalothin4 mg   配製方法：秤取BCYE agar base 38.25 g 溶於500 mL 的試劑水中，秤取氫氧化鉀2.4 g，溶於480 mL的試劑水中，混合兩者，俟完全溶解後，以121滅菌15分鐘，冷卻至約50備用。秤取半胱氨酸0.4 g溶於10 mL的試劑水中，俟完全溶解後，以0.22 µm或0.45µm濾膜過(guò)濾除菌。取1管市售之CCVC抗生素添加劑溶於10 mL的試劑水中，俟完全溶解後，以0.22 µm或0.45 µm濾膜過(guò)濾除菌。三者充份混合後，以1 N HCl或1 N KOH調(diào)整pH值，先倒出小部份培養(yǎng)基，待凝固後

20、以表面電極測(cè)定，培養(yǎng)基最終pH值應(yīng)為6.9 ± 0.1。倒入約20 mL之培養(yǎng)基於無(wú)菌培養(yǎng)皿中，室溫下凝固。未用完之培養(yǎng)基可保存於冰箱中，4 ± 2下保存期限為30天。(十)HCl-KCl酸性緩衝液（Acid buffer）： 以0.2 M HCl調(diào)整0.2 M KCl之pH值為2.2 ± 0.1。經(jīng)121滅菌15分鐘後，儲(chǔ)存於冰箱中備用。4 ± 2下保存期限為30天。 (十一)無(wú)菌稀釋液：不建議使用含鹽類之緩衝液。 、水樣以0.22 µm或0.45 µm濾膜過(guò)濾之過(guò)濾水。如欲用於水樣10倍序列稀釋，分裝之體積須為 90 ±

21、 2.0 mL。4 ± 2下保存期限為3個(gè)月。、0.1%蛋白腖（Peptone）溶液： 秤取蛋白腖（試藥級(jí)）1 g溶於1 L試劑水水中，俟完全溶解後，以121滅菌15分鐘，置於48 ± 2的水浴槽中冷卻，冷卻後分裝適量之蛋白腖溶液於稀釋瓶中，作為無(wú)菌稀釋液用。如欲用於水樣10倍序列稀釋，分裝的無(wú)菌稀釋液滅菌後之體積須為90 ± 2.0 mL。4 ± 2下保存期限為3個(gè)月。 (十二)75%酒精消毒擦拭用。 (十三)革蘭氏染劑：市售商品化試劑，含有結(jié)晶紫染劑（Crystal violet）、革蘭氏碘液媒染劑（Gram iodine）、脫色劑（Decolori

22、zer）及碳酸複紅染劑（Carbolfuchsin）等四劑。 (十四)退伍軍人菌直接螢光抗體檢驗(yàn)試劑組【備註1】：內(nèi)含有FITC螢光標(biāo)定，對(duì)退伍軍人菌有專一性之單一及多價(jià)抗體（Monospecific conjugates and Panvalent conjugates）、1倍之磷酸鹽緩衝液（1 x PBS）、封片膠（Mounting media）。 (十五)退伍軍人菌乳膠凝集試驗(yàn)試劑組【備註2】：內(nèi)含有吸附抗體的藍(lán)色乳膠粒子，包括抗Legionella pneumophila serogroup 1 antigen抗體乳膠粒子、抗Legionella pneumophila serogro

23、up 214 antigen抗體乳膠粒子、抗Legionella species及serotypes 抗體乳膠粒子、陽(yáng)性對(duì)照菌液（Positive control suspension）、陰性對(duì)照菌液（Negative control suspension）、1倍磷酸鹽緩衝溶液、凝集試驗(yàn)紙卡（agglutination reaction cards）。 六、採(cǎi)樣及保存 (一)採(cǎi)集適量水樣，一般建議1001000 mL。採(cǎi)水樣時(shí)應(yīng)使用清潔並經(jīng)滅菌之玻璃或塑膠容器或市售無(wú)菌採(cǎi)樣袋，且於採(cǎi)樣時(shí)應(yīng)避免受到污染。水樣若含有餘氯時(shí)，無(wú)菌容器中應(yīng)加入適量之硫代硫酸鈉（採(cǎi)取含氯之飲用水及冷卻水塔之冷卻水水樣時(shí)

24、，每100 mL之水樣加入0.1 mL之3%硫代硫酸鈉，可中和之餘氯量約為5 mg/L）。 (二)飲用水及飲用水水源採(cǎi)樣方法，請(qǐng)依據(jù)環(huán)保署公告方法，飲用水水質(zhì)採(cǎi)樣方法自來(lái)水系統(tǒng)（W101）、監(jiān)測(cè)井地下水採(cǎi)樣方法（W103），及河川、湖泊及水庫(kù)水質(zhì)採(cǎi)樣通則（W104）執(zhí)行採(cǎi)樣。 (三)冷卻水塔採(cǎi)樣：運(yùn)行中之冷卻水塔，採(cǎi)集滴落之水樣。無(wú)運(yùn)轉(zhuǎn)之冷卻水塔，則將無(wú)菌容器及採(cǎi)樣袋沉入水面下約10公分逕行採(cǎi)樣，但應(yīng)避免採(cǎi)集過(guò)多的沉積物。 (四)採(cǎi)樣前應(yīng)清潔手部，再行採(cǎi)水樣，所採(cǎi)水樣應(yīng)具有代表性。 (五)運(yùn)送時(shí)水樣溫度應(yīng)維持在小於10且不得凍結(jié)，而實(shí)驗(yàn)室內(nèi)保存溫度應(yīng)維持在4 ± 2。 (六)水樣應(yīng)於

25、採(cǎi)樣後24小時(shí)內(nèi)完成水樣塗抹步驟（七、步驟(三)），並置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 (七)若採(cǎi)樣時(shí)有吸入含退伍軍人菌水霧之虞者，宜佩戴適當(dāng)呼吸防護(hù)具。 七、步驟 (一)水中退伍軍人菌含量高，直接以活性碳酵母萃取物選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)，水中退伍軍人菌含量低則應(yīng)先行濃縮，因?yàn)樗畼訚舛任粗?，一般建議水樣先進(jìn)行濃縮，濃縮方式可以濾膜法或離心法實(shí)施，水樣濁度高應(yīng)以離心法進(jìn)行水樣濃縮。 、 濾膜法：過(guò)濾前水樣必須劇烈搖晃25次以上，以使樣品充分混合均勻。以無(wú)菌鑷子夾起無(wú)菌濾膜，放在無(wú)菌過(guò)濾裝置之有孔平板上，小心將漏斗固定，將過(guò)濾裝置接上抽氣幫浦。加入適量無(wú)菌蒸餾水，以測(cè)定過(guò)濾設(shè)備是否裝置妥當(dāng)。取適量水樣進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)

26、濾後再以2030 mL之無(wú)菌稀釋液【五、(十一)、或、】沖洗漏斗，沖洗過(guò)濾後，解開真空裝置，將漏斗移開，儘速以無(wú)菌鑷子取出過(guò)濾後之濾膜置於離心管內(nèi)（亦可將濾膜以無(wú)菌剪刀剪成碎片後置入離心管），加入適量無(wú)菌稀釋液使成10倍濃縮水樣，並確認(rèn)液體能全部覆蓋濾膜，以試管震盪器劇烈震盪35分鐘，懸浮液即為10倍過(guò)濾濃縮後之樣品。 、 離心法：取適量水樣加入離心管內(nèi)，以6000 g離心10分鐘以上，或以3000 g離心30分鐘以上，上清液應(yīng)以吸管吸取丟棄，不可將離心管以倒置之方式去除上清液，上清液取完後加入適量無(wú)菌稀釋液使成10倍濃縮水樣，以試管震盪器劇烈震盪，使離心沉澱物（pellet）均勻分布於溶液中

27、，懸浮液即為離心法10倍濃縮後之樣品。 (二)水樣經(jīng)濃縮後，非退伍軍人菌之微生物也一併被濃縮，微生物彼此競(jìng)爭(zhēng)及抑制的情況下，雜菌將會(huì)影響退伍軍人菌之生長(zhǎng)，所以應(yīng)先將濃縮水樣進(jìn)行酸處理去除雜菌，再以活性碳酵母萃取物選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)。酸處理之做法：取1份上述（七、(一)、濾膜法）或（七、(一)、離心法）之10倍濃縮水樣，加1份HCl-KCl酸性緩衝液，在室溫下作用35分鐘，酸處理後之樣品應(yīng)立即塗抹於活性碳酵母萃取物選擇性培養(yǎng)基中。 (三)取0.1 mL原液（上述七、(二)之10倍濃縮酸處理水樣），或10倍序列稀釋各稀釋度之水樣，滴在BCYE選擇性培養(yǎng)基中，將無(wú)菌之彎曲玻璃棒放在培養(yǎng)基上，再用手

28、或旋轉(zhuǎn)桌（turn table）旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿至水樣均勻分佈於培養(yǎng)基表面。水樣皆需進(jìn)行二重複。 (四)倒置培養(yǎng)皿於二氧化碳培養(yǎng)箱中，在2.55.0% CO2，36 ± 1下，培養(yǎng)5 ± 2天（培養(yǎng)期間應(yīng)於培養(yǎng)箱底部放置水盤，以提供培養(yǎng)環(huán)境必要之溼度）。 (五)培養(yǎng)完成後應(yīng)以解剖顯微鏡進(jìn)行菌落觀察，典型菌落圓形邊緣平滑、白色或白灰色半透明具毛玻璃外觀，但有些菌株呈藍(lán)白、藍(lán)灰、藍(lán)綠、藍(lán)紅、淡綠、淡紅或棕色菌落。在波長(zhǎng)365 nm的紫外燈下觀察，有些菌株產(chǎn)生藍(lán)綠色自發(fā)螢光，有些菌株產(chǎn)生藍(lán)白色、紅色自發(fā)螢光，具有上述特徵之菌落均屬退伍軍人菌疑似菌落（Legionella-like or

29、ganisms），應(yīng)進(jìn)行半胱胺酸需求試驗(yàn)。 (六)半胱胺酸需求試驗(yàn)：首先用無(wú)菌接種環(huán)挑取疑似菌落，以三區(qū)（或四區(qū)）劃線之方式接種於BCYE培養(yǎng)基，進(jìn)行純化，倒置培養(yǎng)皿於二氧化碳培養(yǎng)箱中，在2.55.0% CO2，36 ± 1下，培養(yǎng)48 ± 3小時(shí)，觀察菌落之顏色及外觀判定是單一菌株後，取一個(gè)菌落劃線於不含半胱胺酸之BCYE培養(yǎng)基（可以血液瓊脂培養(yǎng)基代替不含半胱胺酸之BCYE培養(yǎng)基），培養(yǎng)條件同純化培養(yǎng)，結(jié)果陽(yáng)性退伍軍人菌株應(yīng)於BCYE 培養(yǎng)基生長(zhǎng)，且不含半胱胺酸之BCYE培養(yǎng)基（或血液瓊脂培養(yǎng)基）不生長(zhǎng)。陽(yáng)性菌株需再進(jìn)行改良式革蘭氏染色及直接螢光抗體染色檢驗(yàn)確認(rèn)。 (七)

30、改良式革蘭氏染色 、抹片製作：挑取BCYE培養(yǎng)基上之疑似菌落，於載玻片上製成薄抹片，風(fēng)乾並過(guò)火數(shù)次固定。 、初染：將已固定之抹片，用結(jié)晶紫染劑染1分鐘，水洗5秒鐘。 、媒染：加革蘭氏碘液媒染劑（Gram iodine）染1分鐘，水洗5秒鐘。 、脫色：用脫色劑洗至不再有紫色褪出，數(shù)秒即可，水洗5秒鐘。 、複染：用碳酸複紅染劑染30秒鐘，水洗5秒鐘。 、自然風(fēng)乾。 、以光學(xué)顯微鏡鏡檢，觀察是否為革蘭氏陰性桿菌，無(wú)莢膜、不產(chǎn)孢子、短胖型或長(zhǎng)絲型。 (八)直接螢光抗體檢驗(yàn)法 、抹片製作：以無(wú)菌棉花棒或無(wú)菌接種環(huán)挑取若干單一菌落，溶於1%福馬林中，製成濃度為McFarland No.1的懸浮液（約3 &

31、#215; 108 CFU/mL），將菌液滴入螢光染色專用玻片之圓圈內(nèi)，吸去多餘菌液，自然風(fēng)乾並過(guò)火固定。 、螢光抗體染色   先以多價(jià)抗體及陰性對(duì)照組抗體進(jìn)行篩選，若多價(jià)抗體篩選為陽(yáng)性反應(yīng)，且陰性對(duì)照組抗體篩選為陰性反應(yīng)時(shí)，再以合適之單一抗體進(jìn)行確認(rèn)。 ()製備對(duì)照組抗原：將對(duì)照組抗原劇烈搖晃混勻後，滴入螢光染色專用玻片之圓圈內(nèi)，吸去多餘菌液，自然風(fēng)乾並過(guò)火固定。可與菌株抹片同時(shí)製作。 ()將多價(jià)抗體共軛物或單一抗體共軛物滴至每個(gè)樣品及相對(duì)應(yīng)之對(duì)照組抗原。每個(gè)樣品皆須進(jìn)行一個(gè)陰性對(duì)照組。 ()室溫作用20分鐘。 ()用磷酸鹽緩衝液輕輕沖洗以除去未鍵結(jié)之抗體或?qū)⒉Ｆ肓姿猁}緩衝液泡

32、15分鐘。 ()用蒸餾水沖洗，自然風(fēng)乾。 ()加一滴封片膠，蓋上蓋玻片，圓圈中應(yīng)避免有氣泡產(chǎn)生，以免妨礙鏡檢。 ()以螢光顯微鏡鏡檢，先用低倍物鏡（10X）觀察，見到標(biāo)的菌株後再轉(zhuǎn)至高倍（40X），可再以100X油鏡確認(rèn)結(jié)果。、結(jié)果判定：由鏡檢中可見到退伍軍人菌為單一桿狀，同時(shí)出現(xiàn)非常亮的螢光（34），則認(rèn)定為陽(yáng)性結(jié)果。2以下之螢光強(qiáng)度，則判定為陰性反應(yīng)。 退伍軍人菌細(xì)胞壁螢光強(qiáng)度定義4 菌體被染上非常耀眼之黃綠色3 亮黃綠色 2 可觀察到但是有點(diǎn)模糊之染色 1 可觀察到但是很微弱之染色 沒有任何菌體出現(xiàn)黃綠色但是可能出現(xiàn)黃褐色之背景值 (九)乳膠凝集試驗(yàn) 、取出相關(guān)乳膠試劑回溫。將乳膠懸浮液

33、劇烈振盪充份混合均勻。 、在凝集試驗(yàn)紙卡之四個(gè)圓圈內(nèi)一角各滴一滴乳膠試劑（latex reagent）（四瓶分滴四個(gè)圓圈中）。 、在四個(gè)圓圈中另一角各加入一滴磷酸鹽緩衝液，注意不要碰到乳膠試劑。 、使用接種環(huán)挑出可疑菌落（至少1 mm，若菌落太小則2個(gè)或多個(gè)）各與磷酸鹽緩衝液混合均勻。若待檢測(cè)之分離株為絲狀且粘稠則以接種環(huán)挑選410個(gè)相似菌株置入含0.4 mL 0.85%生理食鹽水試管（或微量離心管）中，以振盪器劇烈混合5秒鐘後取1滴使用（不必再加磷酸鹽緩衝液）。 、用接種環(huán)或牙籤將圓圈內(nèi)兩種液體混合均勻，塗布於整個(gè)圓圈內(nèi)。 、將試驗(yàn)紙以圓形旋轉(zhuǎn)方式輕輕搖勻一分鐘。 、觀察凝集結(jié)果以判定血清型

34、別。若藍(lán)色乳膠粒子在一分鐘內(nèi)凝集且對(duì)照組（control latex）的圓圈內(nèi)無(wú)凝集反應(yīng)即判為陽(yáng)性，陽(yáng)性結(jié)果表示所偵測(cè)的菌落含有該種血清型抗原。若藍(lán)色乳膠粒子在一分鐘以上仍沒有凝集反應(yīng)且維持均勻藍(lán)色懸浮液，即判為陰性。 、嗜肺性退伍軍人菌第1型試驗(yàn)（Legionella pneumophila serogroup 1 test）、嗜肺性退伍軍人菌第214型試驗(yàn)（Legionella pneumophila serogroup 2 - 14 test）及退伍軍人菌屬其他菌種試驗(yàn)（Legionella species test）均為陰性之菌落，應(yīng)進(jìn)一步以直接螢光抗體試驗(yàn)（七步驟(八)），進(jìn)行退伍軍

35、人菌屬（非嗜肺性退伍軍人菌）其他菌種之檢測(cè)，均為陰性才能判定為非退伍軍人菌菌落。 、實(shí)驗(yàn)完畢之凝集試驗(yàn)紙卡應(yīng)以高溫高壓滅菌處理。 八、結(jié)果處理 (一)退伍軍人菌陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：將七、(五)退伍軍人菌疑似菌落，經(jīng)半胱胺酸需求試驗(yàn)、革蘭氏染色及直接免疫螢光抗體檢驗(yàn)或乳膠凝集試驗(yàn)，均符合退伍軍人菌陽(yáng)性反應(yīng)之結(jié)果，即判定為退伍軍人菌。 (二)每一培養(yǎng)皿之退伍軍人菌疑似菌落，依據(jù)菌落形態(tài)、顏色及自發(fā)螢光加以歸類，每一類至少挑選3個(gè)菌落（不足3個(gè)菌落者全選），進(jìn)行八、(一)陽(yáng)性判定，依挑選菌落數(shù)之陽(yáng)性比例，回推計(jì)算該類陽(yáng)性菌落數(shù)【備註3】。 某一類退伍軍人菌陽(yáng)性菌落數(shù)疑似菌落數(shù) × (三)加總每一

36、類之陽(yáng)性確認(rèn)菌落數(shù)，即為該培養(yǎng)皿之退伍軍人菌總數(shù)。 (四)以含30至300個(gè)菌落之同一稀釋度的兩個(gè)培養(yǎng)皿計(jì)算其菌落數(shù)，二重覆的兩個(gè)培養(yǎng)皿菌落數(shù)相加計(jì)算其平均值，單位以菌落數(shù)（CFU）/ mL )表示，計(jì)算公式如下： 退伍軍人菌濃度（CFU / mL） ÷ 10 × 2 ÷ 10 × 2 X、Y代表D稀釋度的兩個(gè)培養(yǎng)皿之菌落數(shù) D代表10倍濃縮水樣的稀釋度 (五)培養(yǎng)皿之菌落數(shù)不在30至300個(gè)菌落之間時(shí)，則依菌落數(shù)實(shí)際數(shù)目以下列方式處理： 、若原液及各稀釋水樣中僅有一個(gè)稀釋度的一個(gè)培養(yǎng)皿菌落數(shù)在30至300個(gè)之間，則以上述公式計(jì)算之。 、若原液培養(yǎng)皿中均

37、無(wú)菌落生長(zhǎng)，則菌落數(shù)以小於1（1）表示；若僅原液有菌落產(chǎn)生且少於30個(gè)，亦應(yīng)計(jì)數(shù)菌落數(shù)。 、若各培養(yǎng)皿之菌落數(shù)均不在30至300個(gè)之間，則選取最接近300個(gè)菌落數(shù)之同一稀釋度的兩個(gè)培養(yǎng)皿以上述公式計(jì)算。 (六)數(shù)據(jù)表示：未檢出表示計(jì)算所得之菌落數(shù)小於1，以1表示；菌落數(shù)小於100時(shí)，以整數(shù)表示（小數(shù)位數(shù)四捨五入），菌落數(shù)大於 100 以上時(shí)，只取兩位有效數(shù)字，例如菌落數(shù)為142時(shí)以1.4 × 102表示之，菌落數(shù)155時(shí)以1.6 × 102表示之，菌落數(shù)為18900時(shí)以1.9 × 104 表示。 (七)檢測(cè)紀(jì)錄須註明採(cǎi)樣時(shí)間、培養(yǎng)起始及終了時(shí)間、培養(yǎng)基名稱、培養(yǎng)溫

38、度及各稀釋度的原始數(shù)據(jù)等相關(guān)資料。 九、品質(zhì)管制 (一)微生物採(cǎi)樣人員及檢測(cè)人員應(yīng)具備微生物基本訓(xùn)練及知識(shí)。 (二)每批次採(cǎi)樣時(shí)，應(yīng)進(jìn)行運(yùn)送空白。 (三)每批次或每十個(gè)水樣需進(jìn)行試劑空白實(shí)驗(yàn)。 (四)用於結(jié)果計(jì)算之二重複數(shù)據(jù)，其對(duì)數(shù)差異值不可超出精密度管制參考範(fàn)圍（計(jì)算方式參考環(huán)境微生物檢測(cè)通則細(xì)菌（NIEA E101），除非二重複之菌落數(shù)均小於20。 (五)為確保培養(yǎng)基的品質(zhì)，應(yīng)使用市售商品化之培養(yǎng)基進(jìn)行配備，不可依據(jù)藥品成分自行調(diào)配。每批次新製備的培養(yǎng)基（活性碳酵母萃取物培養(yǎng)基及活性碳酵母萃取物選擇性培養(yǎng)基），應(yīng)以陽(yáng)性菌株【如Legionella pneumophila（BCRC 1785

39、4）】進(jìn)行測(cè)試，確認(rèn)培養(yǎng)出來(lái)的微生物菌落大小及數(shù)量，與先前使用的培養(yǎng)基一致（同一樣品使用前後兩批培養(yǎng)基分別進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果之對(duì)數(shù)差異值應(yīng)落於精密度管制參考範(fàn)圍內(nèi)）。另活性碳酵母萃取物選擇性培養(yǎng)基每季應(yīng)再以陰性控制菌株【如Staphylococcus epidermidis（BCRC 10785）】測(cè)試，以確保添加之抗生素仍有藥效（沒有失效）。 (六)本方法培養(yǎng)所得之細(xì)菌可能具有感染性，檢測(cè)後之培養(yǎng)基及器皿應(yīng)經(jīng)高溫高壓滅菌處理。 十、精密度及準(zhǔn)確度   略 十一、參考資料 (一)衛(wèi)生署疾病管制局。傳染病標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法手冊(cè)，2006。 (二)Allegheny County Health D

40、epartment, Pittsburgh , Pennsylvania. Approaches to prevention and control Legionella infection.1997. (三)APHA. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21st Edition, Section 9260 J. Legionella. American Public Health Association, Washington, D.C., 2005. (四)AS/NZS 3896. WatersExa

41、mination for legionellae including Legionella pneumophila. Australian/New Zealand Standard TM. 1998. (五)ISO 11731. Water qualityDetection and enumeration of Legionella. International Organization for Standardization, Switzerland. 1998. (六)Mietzner, S. M. and Stout, J. E. Laboratory Detection of Legi

42、onella in Environmental Samples. Clinical Microbiology Newsletter Vol. 24, No. 11. p8185. Special Pathogens Laboratory, Pittsburgh Veterans Affairs Hearth Care System, Pittsburgh, Pennsylvania. 2002. (七)TA, A. C., STOUT, J. E., YU, V. L., and WAGENER, M. M. Comparison of Culture Methods for Monitoring Legionella Species in Hospital Potable Water Systems and Recommendations or Standardization of Such Methods. Journal of Clinical Microbiology Vol. 33, p 21182123. Veterans Affairs Medical Center and University of