淺論存活素siRNA表達質粒對化療藥物抑癌作用的影響

1、淺論存活素siRNA表達質粒對化療藥物抑癌作用的影響                 作者：李莉萍 ，羅超權，張志珍，梁念慈【摘要】  目的 探討存活素siRNA表達質粒(mU6/survivin質粒)對化療藥物抑癌作用的影響。方法 采用MTT法檢測mU6/survivin質粒與多種常規(guī)腫瘤化療藥物對乳腺癌MCF7細胞增殖的聯合作用。結果 比較單純化療藥物作用組的各相應濃度點，siRNA表達質粒mU6/survivin與化療藥物順鉑、環(huán)

2、磷酰胺、5氟尿嘧啶或秋水仙堿合用組對腫瘤細胞MCF7的細胞增殖抑制率均明顯提高，差異均有統計學意義(P0.01);對靶向DNA藥物如順鉑、環(huán)磷酰胺和5氟尿嘧啶的抗癌性能具有顯著的協同增強作用(二者合用效應Q值均1)，但對靶向微管的藥物秋水仙堿沒有相加作用(Q值1)。結論 在解除腫瘤細胞中存活素功能的基礎上進行藥物化療，可能是腫瘤的一個新的可行方向。 【關鍵詞】  存活素;siRNA;質粒;化療藥物     Abstract: Objective To study the influence of survivin siRNA expr

3、ession plasmid on antitumor role of chemotherapeutic drugs. Methods The combined role of mU6/survivin plasmid and several chemotherapeutic drugs in the proliferation of MCF7 cells was determined by MTT method. Results The combined use of mU6/survivin plasmid and cisplatin, cyclophosphamide, 5fluorou

4、racil or colchicine resulted in significant inhibition of MCF7 cells compared with the single use of mU6/survivin plasmid or chemotherapeutic drugs (P0.01). The synergistic effect was observed in the combination of pmU6/survivin and cisplatin, cyclophosphamide and 5fluorouracil (Q1) other than colch

5、icine (Q1). Conclusion The combination of chemotherapy and survivin deprival may be a novel regimen for cancer patients.Key words: surviving; siRNA; plasmid; chemotherapeutic drug腫瘤手術切除結合化學藥物的細胞毒性治療仍然是當今腫瘤治療的主要手段，順鉑、環(huán)磷酰胺、5氟尿嘧啶(5Fu)和秋水仙堿都是廣泛應用于臨床實踐的常規(guī)腫瘤化療藥物，但其藥效并不總是理想，腫瘤治療后伴隨而來的耐藥或多藥耐藥性(MDR)更是治療過程中難以

6、克服的障礙。存活素特異性地表達于腫瘤細胞中，臨床數據顯示，存活素表達高低與腫瘤患者的存活率相關1。我們針對存活素基因設計和克隆的mU6/ Survivin siRNA表達質粒，能高效地剔降乳腺癌MCF7細胞中的存活素mRNA以及蛋白質的表達。本實驗運用該質粒剔降乳腺癌細胞MCF7中存活素的表達，之后施以化學毒性藥物進行治療，觀察順鉑、環(huán)磷酰胺、5Fu和秋水仙堿在存活素被沉默之后的抗癌效果。1 材料和方法1.1 試劑空載體mU6pro由美國Michigan大學Dave Turner博士惠贈; ProFection 哺乳類轉染系統購自Promega公司; 5Fu(99%)、環(huán)磷酰胺(99%)、秋水

7、仙堿(99.6%)購自南京學子醫(yī)化研發(fā)中心;順鉑注射液(1 mg/mL)由江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司生產;乳腺癌細胞MCF7為本科室保存。1.2 細胞培養(yǎng)和轉染MCF7細胞生長于含15 %小牛血清、0.5 U/mL胰島素、100 U/mL青霉素、100 g/mL鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，置37，5% CO2飽和濕度孵箱內孵育。細胞轉染采用磷酸鈣法，操作按ProFection哺乳類轉染系統(Promega)試劑盒說明書進行。pEGFPN1和mU6/survivin質粒以13的比例共轉染MCF7細胞，在60 mm培養(yǎng)皿上轉染3 g mU6/survivin質粒, 熒光顯微鏡檢測細胞表達綠

8、色熒光蛋白EGFP的效率來確定轉染效率均超過80%，空載體mU6pro轉染細胞作為空白對照。1.3 腫瘤化療藥物增敏性實驗將細胞接種到60 mm培養(yǎng)皿中，轉染mU6/survivin質?；騧U6pro空載體12 h后，0.25%胰酶消化，按0.5×104/孔接種于96孔板，在37、5% CO2下培養(yǎng)24 h，分別加入DMSO或終濃度為10、20、40、80和160 g/L的順鉑、環(huán)磷酰胺、5Fu、秋水仙堿，繼續(xù)培養(yǎng)24 h, MTT法檢測細胞增殖情況。每孔加入10 L 5 g/L MTT ，繼續(xù)溫育4 h，然后加入100 L DMSO，裂解細胞15 min，酶標儀讀取光密度值OD57

9、0nm/450nm。按下列公式細胞增殖抑制率：B=對照組OD值，A=實驗組OD值，抑制率=(1A/B)×100%。合用效應用Q值來表示，Q值=實測合并效應/期望合并效應=實測抑制率/(EA+EBEA×EB)，EA、EB分別代表質粒、化療藥物單獨作用時的抑制率。Q值1為拮抗，Q值=1為相加，Q值1為增強。單純藥物作用組轉染空載體mU6pro+藥物，單純質粒作用組轉染mU6/survivin質粒+DMSO，藥物質粒合用組轉染mU6/survivin質粒+藥物。1.4 DNA瓊脂糖電泳檢測DNA裂解實驗轉染mU6/survivin質粒36 h后，加入濃度為20 g/L的不同的腫瘤

10、化療藥物,如順鉑、環(huán)磷酰胺、5Fu或秋水仙堿等，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細胞，PBS洗3次，加50 L細胞裂解液(1 % NP40,20 mmol/L EDTA, 50 mmol/L TrisHCl pH 7.5)處理10 s，1500 g離心5 min，獲得上清，重復裂解1次，合并上清。加10 L 10 % SDS，2 L 10 g/LRNase A,37水浴2 h, 加4 L 20 g/L蛋白酶K,56 水浴2 h,隨后加70 L 10 mmol/L NH4Ac,600 L無水乙醇沉淀DNA，4 條件下15000 g離心15 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，照相。1.5 統計學處理計量數

11、據用(±s)%表示，Students test確定組間統計學意義，以P0.05為差異有統計學意義。2 結果2.1 mU6/Survivin質粒增強順鉑對MCF7細胞的細胞毒性結果見表1。順鉑單藥能有效地抑制MCF7細胞的生長，并隨著順鉑濃度升高，其細胞增殖抑制率逐漸升高。當它與mU6/Survivin質粒合用時，比較順鉑單藥組各對應濃度點，其細胞增殖抑制率明顯增大，差異均具有統計學意義(P0.01);與mU6/Survivin單質粒組的細胞增殖抑制率相比較，其細胞增殖抑制率明顯增大(P0.01)。計算mU6/Survivin質粒與不同濃度的順鉑的二者合用效應Q值，所有對應濃度點的Q值

12、均1，具有協同增強作用。DNA電泳結果顯示mU6/Survivin質粒在MCF7細胞中對順鉑誘導的DNA裂解沒有影響。表1 siRNA表達質粒mU6/Survivin加強順鉑對MCF7細胞的生長抑制 與順鉑單藥組對應的各濃度點比較：*P0.01;與pmU6/survivin單質粒組比較：P0.01。2.2 mU6/Survivin質粒增強環(huán)磷酰胺的抑癌作用結果見表2。在本實驗采用的濃度范圍內，環(huán)磷酰胺單藥組對MCF7細胞的生長抑制不明顯。但當與mU6/survivin質粒合用時，比較環(huán)磷酰胺單藥組各對應濃度點，其細胞增殖抑制率明顯增大(P0.01);與mU6/Survivin單質粒組的細胞增殖

13、抑制率(21.16±1.60)%相比較，其細胞增殖抑制率明顯增大，差異具有統計學意義(P0.01)。計算mU6/Survivin質粒與不同濃度環(huán)磷酰胺的二者合用效應Q值，所有對應濃度點的Q值均1，具有增強協同作用。DNA電泳結果顯示mU6/Survivin質粒在MCF7細胞中對環(huán)磷酰胺誘導的DNA裂解沒有影響。2.3 mU6/Survivin質粒增強5Fu的抑癌作用結果見表3。5Fu單藥能有效地抑制MCF7細胞的生長。當5Fu與mU6/Survivin質粒合用時，比較5Fu單藥組各對應濃度點，其細胞增殖抑制率明顯增大(P0.01);與mU6/Survivin單質粒轉染組的細胞增殖抑制

14、率相比較，其細胞增殖抑制率明顯增大(P0.01)。計算mU6/Survivin質粒與不同濃度5Fu的二者合用效應Q值，除10 g/L濃度點外，其余各濃度點Q值均1，具有協同增強作用。DNA電泳結果顯示mU6/Survivin質粒在MCF7細胞中對5Fu 誘導的DNA裂解沒有影響。表2 siRNA表達質粒mU6/Survivin加強環(huán)磷酰胺對MCF7細胞的生長抑制與環(huán)磷酰胺單藥組對應的各濃度點比較：*P0.01;與pmU6/survivin單質粒組比較：P0.01。 表3 siRNA表達質粒mU6/Survivin加強5Fu對MCF7細胞的生長抑制與5Fu單藥組對應的各濃度點比較：*P0.01;

15、與pmU6/survivin單質粒組比較：P0.01。表4 siRNA表達質粒mU6/Survivin加強秋水仙堿誘導的MCF7細胞的生長抑制 與秋水仙堿單藥組對應的各濃度點比較：*P0.01;與pmU6/survivin單質粒組比較：P0.01。2.4 mU6/Survivin質粒對秋水仙堿的腫瘤細胞增殖抑制結果見表4。秋水仙堿單藥能有效地抑制MCF7細胞的生長。當它與mU6/Survivin質粒合用時，比較秋水仙堿單藥組各對應濃度點，其細胞增殖抑制率明顯增大(P0.01);與mU6/Survivin單質粒組的細胞增殖抑制率相比較，其細胞增殖抑制率明顯增大(P0.01)。然而，計算mU6/S

16、urvivin質粒與不同濃度秋水仙堿的二者合用效應Q值時發(fā)現，在本實驗采用的濃度范圍內，所有對應濃度點的Q值均1，顯示出它們的合用不但沒有加合作用，反而具有一定程度的拮抗作用。DNA電泳結果則顯示mU6/Survivin質粒在MCF7細胞中促進秋水仙堿誘導的DNA裂解(圖1)。3 討論順鉑、環(huán)磷酰胺、5Fu和秋水仙堿都是廣譜的抗腫瘤化療藥物。順鉑是一種鉑金屬化合物，能與DNA鏈中鳥嘌呤發(fā)生交聯，使DNA形成鏈內和鏈間交叉聯結，破壞DNA功能45。環(huán)磷酰胺是一種烷化劑，其需先經分解為活化形式磷酰胺氮芥才有抑癌活性。磷酰胺氮芥與DNA鏈交叉連結，導致DNA的改變或斷裂而破壞DNA功能，阻礙DNA復

17、制。5Fu是RNA鏈中重要組成部分尿嘧啶的類似物，取代尿嘧啶參與DNA的合成。秋水仙堿則是一種微管蛋白結合劑，阻遏微管蛋白聚合，而微管蛋白在細胞有絲分裂紡錘體組裝中扮演重要角色。DNA復制和有絲分裂是細胞周期過程中的關鍵步驟。面對化療藥物造成的破壞，出于自我保護需要，腫瘤細胞第一反應是要盡可能修復缺陷，維護其基因組的完整性。通過改變藥物引起的損傷DNA的修復能力，破壞凋亡信號通路，改變與腫瘤耐藥相關蛋白和酶的表達等等方式，對化療藥物治療產生耐藥從而使化療效果下降。例如，大約40%的乳腺癌患者表達藥物載體蛋白Pgp, Pgp的表達升高誘導某些化療藥物的耐藥性，是一種典型的多藥耐藥蛋白。又如，順鉑

18、誘導存活素 mRNA和蛋白質增加，可能與其腫瘤耐藥相關。但如果損傷實在無法修復，腫瘤細胞的第二反應則是動員相關機制誘導細胞實行死亡程序。         相關顯示，存活素表達與腫瘤放療化療耐受相關，化療藥物后存活素表達水平明顯升高10。存活素及其家族在多藥耐受細胞中過表達11，調節(jié)存活素表達可以影響Pgp的穩(wěn)定性和活性12。本實驗結果顯示，siRNA表達質粒mU6/survivin剔降MCF7細胞中存活素的表達，對靶向DNA合成復制和損傷后修復的藥物如順鉑、環(huán)磷酰胺和5Fu的抗癌活性具有顯著的加強作用，可見，降低和

19、逆轉腫瘤細胞中存活素的過表達，可能意味著降低了腫瘤細胞的抗藥性能，使腫瘤化療藥物的細胞毒性得到了充分體現。與此同時，存活素調節(jié)腫瘤細胞的分裂和凋亡13,其siRNA誘導凋亡或使細胞對藥物或死亡配體/受體誘導的凋亡敏感14，增強腫瘤對放療的敏感性15，抑制腫瘤細胞的侵襲性16，部分逆轉腫瘤的惡性表征。本課題組的結果還顯示，mU6/survivin能誘導腫瘤細胞多核化和核巨型化，導致細胞裂亡17。由此可見，mU6/survivin沉默MCF7細胞中存活素的表達，啟動和引導腫瘤細胞執(zhí)行各種死亡通路，可能是其增強腫瘤化療藥物抗癌效果的作用機制之一。有報道顯示，存活素過表達通過影響微管動力學和抑制凋亡提

20、高對微管靶向藥物的耐受性18。本結果顯示，剔降MCF7細胞中存活素的表達，雖然從表面數值看來，秋水仙堿抑癌效果比單藥或單純質粒作用要強一些，但二者藥效不具加合性。也就是說，存活素表達缺失不能增強癌細胞MCF7對秋水仙堿細胞毒性的敏感度，奇怪的是，這種缺失卻增強了秋水仙堿誘導的MCF7癌細胞DNA裂解的涂布現象。由此看來，mU6/survivin對秋水仙堿抗癌作用的影響不能單從短期作用的細胞毒性角度得以精確分析和反映，或許存活素 siRNA 對微管靶向藥物的影響來得更慢一些?？偠灾?，siRNA表達質粒mU6/survivin使腫瘤對化療藥物誘導的細胞毒性更加敏感。在應用siRNA 干擾等技術解

21、除腫瘤細胞中存活素的功能的基礎上，進行腫瘤化療藥物治療，可以成為未來腫瘤治療學的一個方向。本實驗的數據可以為腫瘤治療新方法新概念的建立提供實驗依據?！疚墨I】  1 Yamashita S, Masuda Y, Kurizaki T, et al. Survivin expression predicts early recurrence in earlystage breast cancer J. Anticancer Res, 2007, 27(4C):28032808. 李莉萍, 梁念慈, 羅超權. 存活素siRNA表達質粒的構建及其對MCF 7細胞周期和增殖的調控J. 癌癥,

22、2004, 23(7):742 748. 金正均.合并用藥中的相加J.藥報, 1980, 1 (1): 7076. Martin L P, Hamilton T C, Schilder R J. Platinum resistance: the role of DNA repair pathwaysJ. Clin Cancer Res, 2008, 14(5): 12911295. Heffeter P, Jungwirth U, Jakupec M, et al. Resistance against novel anticancer metal compounds: differences

23、 and similaritiesJ. Drug Resist Updat, 2008, 11(12):116. Coley H M. Mechanisms and strategies to overcome chemotherapy resistance in metastatic breast cancerJ. Cancer Treat Rev, 2008, 34(4): 378390. Wyatt M D, Wilson D M 3rd. Participation of DNA repair in the response to 5fluorouracil J. Cell Mol L

24、ife Sci, 2008. Epub ahead of print Bhattacharyya B, Panda D, Gupta S, et al. Antimitotic activity of colchicine and the structural basis for its interaction with tubulinJ. Med Res Rev , 2008, 28(1):155183. Ikeguchi M, Liu J, Kaibara N. Expression of survivin mRNA and protein in gastric cancer cell line (MKN45) during cisplatin treatmentJ. Apoptosis, 2002, (1):2329.10 Ferrario A, Rucker N, Wong S, et al. Survivin, a member of the inhibitor of apoptosis family,is induced by photodynamic therapy and is a target for improving treatment response J. Canc