清毒片、養(yǎng)正片對(duì)白血病細(xì)胞uPA活性影響的研究

1、清毒片、養(yǎng)正片對(duì)白血病細(xì)胞uPA活性影響的研究    【摘要】  目的觀察中藥清毒片、養(yǎng)正片對(duì)白血病細(xì)胞uPA活性的影響。方法SD大鼠24只，隨機(jī)分為4組：空白組用生理鹽水，清毒片組用清毒片，養(yǎng)正片組用養(yǎng)正片灌胃,化療組用阿糖胞苷腹腔注射，觀察含藥血清對(duì)HL60 uPA活性的影響。結(jié)果與空白對(duì)照組相比較，阿糖胞苷和清毒片、養(yǎng)正片藥物血清對(duì)HL60細(xì)胞培養(yǎng)液上清中uPA的活性都有一定程度的影響，而以阿糖胞苷含藥血清降低uPA活性的效果較好。結(jié)論清毒片、養(yǎng)正片的臨床治療作用可能與其降低患者體內(nèi)白血病細(xì)胞uPA活性表達(dá)水平的作用有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】&#

2、160; 清毒片；養(yǎng)正片；白血病；HL60；uPA Abstract： ObjectiveWe observed the effect of Qingdupian and Yangzhengpian on the uPA expression in leukemia cells.Method248 SD rats weigh (210±20)g,half male and half female,divided into 4 groups randomly: blank control（0) group,Qingdupian（Q) group，Yangzhengpian（Y) gro

3、up and Chemotherapy(H) group.Blank control group were fed physiological saline,Q group were fed Qingdupian juice,Y group fed with Yangzhengpian juice,twice a day,3.5 days.H group were injected Arac through peritoneum,once a day,4 times in all.Draw blood of rats 12 hours after the last feed,extract t

4、he serum,and store the serum at 4.Treat the cells with RPM1640 containing 10% every kind of serum for 48 hours,precipitate the cells;the supernatant fluid was collected respectively for ELISA essay to test the activity of uPA.ResultThe laboratory research showed that all the serum had inhibitive eff

5、ect on uPA activity of the supernatant fluid of HL60 cells,and Arac containing serum had the best effect on declining uPA activity.ConclusionSuggest the clinical therapeutic effect of Qingdupian and Yangzhengpian be related to its declining effect on uPA activities of leukemia cells. Key words: Qing

6、dupian;Yangzhengpian;Leukemia;HL60;uPA 1  實(shí)驗(yàn)材料 1.1  實(shí)驗(yàn)材料  清潔級(jí)SD大鼠24只（購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），人早幼粒白血病細(xì)胞株HL60（購自中山醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），清毒片、養(yǎng)正片生藥飲片各1劑(購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院),10%胎牛血清（購自杭州四季青公司），完全RPMI1640培養(yǎng)液(sigma 公司產(chǎn)品)，uPA活性檢測(cè)ELISA試劑盒（Chemicon International,Inc.產(chǎn)品），計(jì)數(shù)板，蓋玻片，96孔板，加樣槍，可處理吸頭，一次性注射器，試管，Ep管，玻璃毛細(xì)管，灌

7、胃針頭，血分析用抗凝管、燒杯等。 1.2  實(shí)驗(yàn)儀器  倒置顯微鏡（Olympus產(chǎn)品），細(xì)胞培養(yǎng)箱（NAPCO Series 5400 CO2 Incubator），-20冰箱（HUALING BCD268WA）、離心機(jī)（上海產(chǎn)TDL5型），電熱恒溫水溫箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），全自動(dòng)酶標(biāo)儀(BIORAD Model 3550)，干燥皿，解剖臺(tái)，高壓鍋，電爐等。 2  實(shí)驗(yàn)方法 2.1  分組與用藥  將清毒片、養(yǎng)正片生藥飲片用水煎濃縮法處理備用。制備清毒片、養(yǎng)正片藥物血清(在廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行)。分組：清潔級(jí)SD大鼠24只,體重

8、210±20g，雌雄各半，隨機(jī)分為4組：空白（O）組，清毒片（Q）組，養(yǎng)正片（Y）組，化療（H）組。方法參照中藥血清藥理相關(guān)文獻(xiàn)1。    各組分別用相應(yīng)藥物灌胃3.5d，2次/d。用藥如下：O組用生理鹽水2ml，Q組用清毒片口服液2 ml（9g/kg），Y組用養(yǎng)正片口服液2ml（10g/kg），H組用阿糖胞苷1ml（17.85mg/kg）腹腔注射，1次/天，共用4次。于最后一次灌胃后12 h將大鼠用乙醚麻醉，毛細(xì)玻璃管雙眼球后動(dòng)脈取血2ml置抗凝管中。將樣本3000rpm/min離心10min取血清1 ml，置56滅活30min，4冷藏備用。給藥方法及

9、劑量參照血清藥理有關(guān)研究文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用藥劑量換算表232.2  細(xì)胞培養(yǎng)  人早幼粒白血病細(xì)胞株HL60，用完全RPMI1640培養(yǎng)液加10%胎牛血清培養(yǎng)，置37，5%CO2培養(yǎng)箱，35d換液1次，倒置顯微鏡觀察，待細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛（達(dá)指數(shù)生長(zhǎng)期）后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)4。 2.3  含藥血清處理細(xì)胞1  取生長(zhǎng)良好的HL60細(xì)胞，離心后棄上清，用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋混勻，計(jì)數(shù)后按每孔200l，密度5000/孔（細(xì)胞濃度為2.5×104/L）鋪板，同步培養(yǎng)24h，每孔加入含各組含藥血清的RPMI1640培養(yǎng)液200l，使含藥血清的濃度為10%，每

10、個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,刺激48 h后分別沉淀各組細(xì)胞，取上清液進(jìn)行uPA活性的ELISA檢測(cè)。 2.4  細(xì)胞uPA活性的ELISA測(cè)定（根據(jù)試劑盒說明書操作）  向96孔反應(yīng)板中分別加入40ul uPA含藥血清樣本、空白對(duì)照上清液或uPA陽性對(duì)照,添加足夠的去離子水使總體積為160l。然后按試劑盒說明書進(jìn)行操作，終止反應(yīng)后立即在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上405nm波長(zhǎng)讀取光密度值。 2.5  統(tǒng)計(jì)分析  以u(píng)PA活性測(cè)定試劑盒中所提供的6個(gè)濃度的uPA陽性標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，各濃度標(biāo)準(zhǔn)品所對(duì)應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定各濃度含藥血清組OD值所對(duì)

11、應(yīng)的uPA活性水平。運(yùn)用Excel統(tǒng)計(jì)軟件，采用計(jì)量資料的t檢驗(yàn)對(duì)各組藥物血清處理細(xì)胞上清的uPA活性對(duì)應(yīng)OD數(shù)值進(jìn)行比較。 3  實(shí)驗(yàn)結(jié)果    實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比較，阿糖胞苷、清毒片和養(yǎng)正片藥物血清對(duì)HL60細(xì)胞培養(yǎng)液上清中uPA的活性都有一定程度的影響，而以阿糖胞苷含藥血清降低uPA活性的效果最好，清毒片含藥血清次之。各組uPA活性對(duì)應(yīng)光密度值變化情況見下表1。 表1  清毒片、養(yǎng)正片藥物血清對(duì)uPA活性的影響（略） 與空白組對(duì)比，*P<0.05，與空白組對(duì)比，*P<0.01 4  討論 

12、60;  uPA是一種絲氨酸蛋白水解酶，參與纖溶過程。一些研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的白血病細(xì)胞中有纖溶活化劑（PAs）的高表達(dá)。用HL60細(xì)胞作為AL細(xì)胞的模型研究細(xì)胞周圍基質(zhì)降解，證實(shí)絲氨酸蛋白酶以尿激酶前體的形式存在，基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）前體的活化依賴于纖溶酶原活化劑/纖溶酶系統(tǒng)，并可被抑肽酶抑制，而MMP9只在HL60細(xì)胞存在的條件下檢測(cè)到。結(jié)果表明HL60細(xì)胞通過纖溶系統(tǒng)活化MMP9，而MMP9的活化促進(jìn)了基質(zhì)降解，增強(qiáng)了白血病細(xì)胞的侵犯能力5。AML患者TFPI、PAP值異常增高。治療后TF、TAT在AML患者中維持高水平；uPA、uPAR在未緩解者持續(xù)增高；出血嚴(yán)重者PAP

13、、uPA顯著升高。得出結(jié)論uPA、uPAR可作為部分AML預(yù)后判斷的指標(biāo)6。急性髓性白血?。ˋML）患者骨髓和血漿中uPA的濃度均高于正常人，并且發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞主要表達(dá)uPA，而不產(chǎn)生tPA7。    清毒片和養(yǎng)正片分別由清熱解毒及扶正固本的中藥組成，是廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科專家制定，并長(zhǎng)期用于各型白血病患者的中藥復(fù)方制劑。在臨床上，對(duì)于患者病情緩解和改善生存質(zhì)量起到了良好的作用。本實(shí)驗(yàn)研究從含藥血清作用方面，探討了清毒片、養(yǎng)正片在體外對(duì)人急性早幼粒白血病細(xì)胞系HL60生長(zhǎng)狀態(tài)及uPA活性的影響，以便與臨床研究結(jié)合起來，更好地解釋這兩種中藥治療AL的作用

14、。同時(shí)更深入地了解AL疾病變化狀態(tài)及中藥作用途徑。    通過uPA活性測(cè)定的ELISA實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)清毒片、養(yǎng)正片與阿糖胞苷含藥血清，均具有降低HL60細(xì)胞上清中uPA活性的作用。且隨著藥物濃度增加，uPA活性單位OD值逐漸下降，藥物濃度與uPA活性單位OD值二者呈正相關(guān)。清毒片、養(yǎng)正片對(duì)HL60細(xì)胞具有降低其產(chǎn)生uPA活性物質(zhì)的作用。提示這兩種藥物的藥效與其改變白血病細(xì)胞uPA活性的作用有關(guān)。 【參考文獻(xiàn)】  1 耿建國.真武湯對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞外基質(zhì)作用的實(shí)驗(yàn)研究J.中醫(yī)雜志，2001，41（11）：686687.2 楊彥芳，王玉芹.中藥復(fù)方血清藥理學(xué)方法規(guī)范化探討J.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2000,20(5): 380381.3 石巖，梅世昌.醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手冊(cè)M.中國農(nóng)業(yè)出版社，2130.4 章靜波.組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)M.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1091127.5 Devy L,Noel A,Baramova E,et al.Production and activation of matrix me