過敏性紫癜發(fā)病中樹突狀細胞與T輔助細胞分化失衡的關系

1、過敏性紫癜發(fā)病中樹突狀細胞與T輔助細胞分化失衡的關系陶紅，李秋，王莉，李翠萃，陽海平，張高福（400014 重慶 重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院腎臟免疫科，重慶 400014）【摘要】目的 探討樹突狀細胞(dendritic cells，DC)調(diào)控信號的異常與過敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura，HSP)發(fā)病中T輔助細胞分化失衡的關系。方法 分別采用散射比濁法、ELISA和流式細胞技術(shù)，檢測HSP患兒血漿中免疫球蛋白、血漿IL-4 、INF-和DC培養(yǎng)上清IL-12、IL-10水平及DC表面CD86、CD80、CD83、HLA-DR、CD-209的表達情況。結(jié)果 與對照組比較

2、，HSP組患兒：血漿免疫球蛋白IgA及IgE水平升高；血漿中TH2類細胞因子IL-4升高，TH1類細胞因子INF-降低；DC培養(yǎng)上清中IL-10升高，IL-12降低；DC表達CD86、CD83、HLA-DR水平升高，表達CD80水平降低，P0.05.。CD-209在兩組之間差異無統(tǒng)計學意義，P0.05.。結(jié)論 DC的抗原特異性信號、協(xié)同刺激信號和分化或極化信號三種調(diào)控信號的異常，與HSP患兒TH1/TH2失衡、免疫球蛋白合成異常密切相關?！娟P鍵詞】樹突狀細胞； T淋巴細胞；過敏性紫癜The relation of dendritic cell to the imbalance differen

3、tiation of T helper cell in pathogenesis of Henoch-Schonlein purpuraTAO Hong, LI Qiu, WANG Li, LI Cuicui, YANG Haiping, ZHANG Gaofu (Department of Kindey immunity ,the Childrens Hospital of Chongqing Medical University , Chongqing 400014,China)【Abstract】Objective Discussion the relation between the

4、abnormal regulation signals of dendritic cells(DC) and the dysimmunity of pathogenesis of Henoch-Schonlein purpura （HSP）. Methods Immunoglobulin Levels were detected by nephelometry assay in children with HSP . Inflammatory cytokines IL-4, INF- in blood plasma and IL-12, IL-10 in the supernatants of

5、 cultured DC were detected by ELISA. The count of CD86, CD80, CD83, HLA-DR, CD-209 expressed on DC were detected by cell flow cytometry. Results HSP group showed: The levels of plasma IgA and IgE were higher than the control group, IL-12 levels in the supernatants of cultured DC and INF- levels in t

6、he plasma were lower than the control group,IL-10 levels in the supernatants of cultured DC and IL-4 levels in the plasma were significantly increased than the control group. CD86, CD83, HLA-DR expressed on DC were significantly higher and CD80 was significantly lower than the control group, P0.05.

7、CD-209 of Two groups had no statistical significance, P>0.05. Conciusion The anomalies of antigenspecific signals, costimulatory signals and differentiation or polarization signal of DC might be involved in TH1/TH2 imbalance and synthesis of abnormal immunoglobulins in pathogenesis HSP.【Key words

8、 】 Dendritic cells; T lymphocytes; Henoch-Schonlein purpura Corresponding author：LI Qiu ，TelEmail：Liqiu809。過敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura,HSP)是兒童時期最常見的毛細血管變態(tài)反應性疾病，患兒體內(nèi)最主要的免疫功能紊亂為TH1/TH2失衡，TH0細胞向TH2細胞優(yōu)勢活化及免疫球蛋白產(chǎn)生異常等1，但其具體機制不詳。樹突狀細胞(dendritic cells,DC)是唯一能激活初始T淋巴細胞產(chǎn)生免疫應答的職抗原遞細胞，在自身免疫性疾病的

9、發(fā)生中起重要的作用。本研究模擬DC在外周血的成熟過程，試圖了解血清中免疫球蛋白濃度、輔助性T細胞亞群（TH）和DC免疫調(diào)控信號的關系，為進一步了解HSP的發(fā)病機制提供免疫學依據(jù)。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 臨床資料及分組 對照組20例為我院門診體檢的健康兒童，男：女=12:：8，年齡6歲14歲，平均7.5歲。HSP組患兒58例來自2008年6月至2009年3月我院腎臟免疫科住院患兒，男：女=38：:20，年齡3歲16歲，平均7.1歲（年齡及性別均無統(tǒng)計學意義，P0.05）。入選條件：以中華醫(yī)學會兒科腎臟學組2000年診斷標準為納入標準，均為急性期患兒，具有明確的病史和體征，采血前四周

10、未使用過激素和免疫抑制劑。1.1.2 試劑 rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-（美國R&D公司）；血漿免疫球蛋白（英國伯明翰公司）；IL-10、IL-4、INF-、IL-12因子EILSA試劑盒（北京生物晶美公司）；PE標記的鼠抗人CD86(鼠PE-IgG2b抗體為陰性對照) 、FITC標記的鼠抗人CD80(鼠FITC-IgG1為 【通信作者】李秋.電話Email：Liqiu809。陰性對照)、FITC標記的鼠抗人CD-209（鼠FITC-IgG2a為陰性對照）、PE標記的鼠抗人CD83（鼠PE-IgG1抗體為陰性對照)、PE標記的鼠抗人HLA-D

11、R（鼠PE-IgG2b抗體為陰性對照）單克隆抗體（美國Ebioscience公司）。1.2 方法1.2.1 DC的誘導和培養(yǎng) 取抗凝外周血5 ml(經(jīng)倫理委員會及家屬同意)，20 1500 r/min離心5 min，留取血漿1 ml，常規(guī)分離PBMC，用含10%特級胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細胞，細胞終濃度為2×106/mL。加入6孔培養(yǎng)板，每孔3 ml。放入37 , 50 ml/LCO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)3 h后，輕柔洗板一次，洗去未貼壁的細胞。按rhGM-CSF 1000 U /mLl、rh-IL-4 500 U/mLl終濃度加入細胞因子，隔日半量換液。培養(yǎng)過程中通過倒置顯

12、微鏡觀察細胞的生長情況。第五天加入rhTNF-200 U/ml，誘導其成熟，第七7天DC培養(yǎng)成熟，收集上清液300 l于- 80保存以備測2，3。余細胞用于形態(tài)學鑒定、流式細胞儀分析等。1.2.2 血漿免疫球蛋白A、G、M、E檢測 采用散射比濁法，操作按說明書進行。1.2.3 血漿IL-4 、INF-及DC培養(yǎng)上清IL-12、IL-10的檢測 用留取的血漿檢測IL-4、INF-，DC培養(yǎng)的上清檢測IL-12、IL-10水平，操作方法按試劑盒說明書進行。1.2.4 流式細胞儀分析DC 培養(yǎng)第7天的DC用0.01 mol/L PBS洗滌后，調(diào)整終濃度為1×105/mL的細胞懸液。各取10

13、0 Ll細胞懸液加入流式細胞儀測定管, 分別加入20 Ll PE標記鼠抗人CD86、FITC標記的鼠抗人CD80、FITC標記的鼠抗人CD-209（DC表面的特異性標志）、PE標記的鼠抗人CD83、PE標記的鼠抗人HLA-DR單克隆抗體（另各取100 ul加入相應的陰性對照）,混勻, 4 避光孵育30 min。用預冷PBS洗滌2次,重新懸浮細胞后，用流式細胞儀分析。1.2.5 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)以±s表示，通過SPSS11.5進行t檢驗，兩變量間相關分析采用直線相關分析法，P0.05為有統(tǒng)計學意義。2 結(jié)果2.1 DC的分離鑒定 2.1.1 形態(tài)學觀察 倒置顯微鏡下，培養(yǎng)第一1天細胞大

14、都呈圓形貼壁；第二2天部分懸浮，部分貼壁；第三3天細胞形態(tài)多變（圓形、多邊形、不規(guī)則形、逗號形等）見聚集現(xiàn)象且基本懸浮，體積增大，有毛刺樣突起；第五5天加入rhTNF-，第七7天細胞成熟，突起更加明顯，呈典型樹枝狀外形（圖1）。2.1.2 DC細胞數(shù)量觀察DC表面的特異性標志CD-209進行框選，結(jié)果示CD-209表達兩組間無統(tǒng)計學意義，P0.05，即兩組培養(yǎng)的DC細胞數(shù)量無差別（表1）。 圖 1培養(yǎng)7天的DC A普通光鏡（×40） B 電鏡（×2000）表1 DC表面CD-209的表達情況（ ±s，%，mean）組別nCD-209（Mean）對照組HSP組t值p

15、值205815.67±2.8915.21±2.570.440.052.2 HSP患兒血漿免疫球蛋白水平血漿免疫球蛋白IgA及IgE水平HSP組明顯高于對照組，P0.05；血漿IgG、IgM的水平兩組間無統(tǒng)計學意義，P0.05（表2）.。表2血漿免疫球蛋白A、G、M、E檢測的比較（ ±s，g/L）組別nIgAIgGIgMIgE對照組HSP組t值p值20581.27±0.512.75±0.23 2.440.059.12±3.038.75±4.19 0.390.051.25±0.661.49±1.250.560

16、.051.17±0.683.35±0.75 1.990.05注：免疫球蛋白A、G、M、E的對照值為本院免疫室建立。2.3 HSP患兒血漿產(chǎn)生TH1、TH2細胞因子情況 HSP患兒產(chǎn)生TH1類細胞因子INF-水平顯著低于對照組，TH2類細胞因子IL-4水平HSP組顯著高于對照組， P0.05（表3）. 表3 血漿IL-4、INF-及DC培養(yǎng)上清IL-10、IL-12的水平（ ±s，ng/L）組別n血漿IL-4血漿 INF-上清IL-10上清IL-12 對照組HSP組t值p值20585.69±2.7711.71±3.765.510.0137.16&

17、#177;7.2616.47±6.308.040.0121.53±7.0544.49±15.474.750.0114.03±3.925.52±1.945.080.012.4 HSP組DC培養(yǎng)上清IL-10、IL-12的檢測 HSP組DC培養(yǎng)上清中IL-10水平顯著高于對照組，IL-12水平顯著低于對照組，P0.05（表3）.。2.4 HSP患兒DC表面CD86、CD80、CD83、HLA-DR的表達情況 HSP組DC表面標志CD86、CD83、HLA-DR水平顯著高于對照組，CD80水平顯著低于對照組，P0.05.。（表4） 表4 DC表面CD

18、86、CD80、CD83、HLA-DR的表達情況（ ±s，%，mean）組別nCD86（%）CD80（%）CD83（%）HLA-DR（Mean）對照組HSP組t值p值205858.30±7.7286.86±5.27 10.59 0.0132.10±4.2326.16±6.06 3.16 0.0131.20±3.2346.30±7.34 6.81 0.0184.71±17.79115.65±16.83 4.57 0.012.6 HSP組DC培養(yǎng)上清中IL-12、IL-10水平與表面標志CD86、CD80、C

19、D83、HLA-DR表達及血漿IL-4、INF-相關性分析 HSP組DC培養(yǎng)上清中IL-10與血漿IL-4呈正相關（r=0.54，P0.05），IL-12與血漿INF-呈正相關（r=0.44，P0.05）。HSP組DC表面CD86、HLA-DR與血漿IL-4呈正相關（r=0.46，0.59，P0.05），CD80與INF-呈正相關（r=0.71，P0.01）。2.7 血漿免疫球蛋白與DC培養(yǎng)上清中IL-12、IL-10的相關性分析 DC培養(yǎng)上清IL-10濃度與IgA水平呈正相關（r=0.45，P0.05）。3 討論T細胞在機體免疫反應及炎癥反應過程中起著關鍵的作用。既往已有報道本病的發(fā)生與T細

20、胞功能異常、TH1/TH2失衡明顯相關。本研究結(jié)果顯示HSP患兒血漿免疫球蛋白IgA及IgE水平明顯高于對照組，患兒體內(nèi)的TH1型細胞因子INF-明顯降低，TH2型細胞因子IL-4明顯升高，表明HSP患兒體內(nèi)的確存在著免疫球蛋白合成異常及明顯的TH1/TH2細胞免疫應答失衡，與既往文獻報道一致1。生理狀況下,TH細胞分化由體內(nèi)功能最強的抗原遞呈細胞DC所調(diào)控。DC通過三3種信號通道協(xié)同調(diào)控TH細胞功能4、5,對TH1/TH2平衡分化起重要的作用。這三3種信號包括:抗原特異性信號（主要為DC表面高表達的MHC-類分子遞呈的外來抗原， HLA-DR為MHC-的特異性識別片段）、協(xié)同刺激信號（CD8

21、6、CD80是DC表面的最主要的共刺激分子，決定受抗原刺激的T細胞成為效應細胞，或進入無反應狀態(tài)。）和分化或極化信號（其中DC分泌的IL-12、IL-10的水平是影響TH細胞分化結(jié)果的最重要因素）5。HLA-DR、CD86 、IL-10是調(diào)節(jié)TH0細胞向TH2細胞分化的重要分子6、7;CD80 、IL-12則調(diào)節(jié)TH0細胞向TH1細胞分化7、8。從本研究結(jié)果可以看出,HSP病人的DC表面標志HLA-DR、CD86表達和DC分泌的IL-10均較對照顯著升高，均與血漿TH2型細胞因子IL-4呈正相關；而表面標志CD80的表達和IL-12的分泌明顯減少，二者與TH1型細胞因子INF-呈正相關，表明在

22、HSP發(fā)病過程中HLA-DR、CD86的異常表達以及IL-10的高分泌可能是誘導TH0細胞向TH2細胞過渡分化的重要因素；而CD80和IL-12降低同樣也是誘導TH0細胞向TH1細胞分化減少、導致TH1/TH2失衡的關鍵。該結(jié)果提示DC對TH細胞調(diào)控的三3條途徑即抗原特異性信號、協(xié)調(diào)刺激信號和分化或極化信號均出現(xiàn)了異常，這可能與HSP發(fā)生TH2細胞優(yōu)勢活化、TH1/TH2細胞功能失衡、機體免疫異常密切相關。綜上所述，樹突狀細胞調(diào)控信號的異常與過敏性紫癜免疫異常相關,但促使DC免疫功能異常的原因尚不清楚。在本研究中已發(fā)現(xiàn)HSP中成熟的DC較對照明顯增多（CD83為DC成熟的標志9）。只有成熟DC

23、才是發(fā)揮APC細胞免疫調(diào)控功能的重要效應細胞。那么,調(diào)節(jié)DC的發(fā)育、成熟及免疫應答的核轉(zhuǎn)錄因子NF-B10、11、12是否參與DC信號調(diào)控異常尚需進一步研究。【參考文獻】：1李秋,楊錫強,李永伯,等.過敏性紫癜T淋巴細胞功能狀態(tài)的研究J.中華兒科雜志,2001, 39（3）:157-159.2胡義杰，范士志，蔣耀光，等.人DeltaNp73基因修飾的樹突狀細胞抗瘤免疫學效應研究J.第三軍醫(yī)大學學報，2007，29(9):763-766.3陶忠芬，蔡永國 ，楊仕明，等. 樹突狀細胞掃描電鏡樣本制備方法J.第三軍醫(yī)大學學報，2005,27(12):1299-1300.4Lee JS, Kim SG

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