低劑量輻射增強(qiáng)小鼠胸腺細(xì)胞PKC亞型的表達(dá)

1、    低劑量輻射增強(qiáng)小鼠胸腺細(xì)胞PKC亞型的表達(dá)        摘要目的和方法：本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)研究了不同劑量X射線全身照射后4、12、24和48h，昆明小鼠胸腺細(xì)胞蛋白激酶C亞型表達(dá)的變化。結(jié)果：75mGy全身照射后PKC-、1、2表達(dá)均有增強(qiáng)，于照射后12h達(dá)峰值，PKC-、2于48h恢復(fù)至假照水平，PKC-1于48 h仍明顯增高。4Gy照射后，PKC-表達(dá)顯著下降。主題詞輻射劑量；蛋白激酶C；流式細(xì)胞術(shù)；胸腺 Increased expression of PKC

2、 isoforms in thymocytesafter WBI with low dose X-raysXIE Feng, GAO Shen, LIU Shu-ZhengNorman Bethune University of Medical Sciences, Changchun (130021)AbstractAIM and METHODS: Male Kunming mice were whole-body irradiated with 75 mGy or 4 Gy X-rays. The expressions of PKC (protein kinase C) isoforms

3、of thymic lymphocytes were analyzed by immuno-fluorescence flow cytometry with corresponding polyclonal antibodies at different time intervals after irradiation. RESULTS: The positive cells for PKC ，PKC 1 and 2 all increased after WBI with 75 mGy, reaching its peak 12 hours after WBI. The expression

4、s of PKC ，2returned to normal level, and the expression of PKC 2 still remained at a higher level than normal 48 hours after WBI with 75 mGy. The positive cells for PKC decreased 24 and 48 hours after WBI with 4 Gy. CONCLUSION: Low dose radiation can induce expression of PKC isoforns and promote sig

5、nal transduction of T lymphocytes.MeSHRadiation dosage; Protein kinase C; Flow cytometry; Thymocytes近幾年來，大量的實(shí)驗(yàn)使人們逐步認(rèn)識到低劑量輻射能夠引發(fā)一些高劑量輻射所致不同的生物效應(yīng)，已成為輻射研究領(lǐng)域的一個新的熱點(diǎn)。其作用機(jī)制正不斷被揭示1。就淋巴細(xì)胞信號傳遞系統(tǒng)而言，本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道75mGy X射線單次全身照射后，小鼠TCR/CD3的表達(dá)增強(qiáng)，c-fos,c-jun表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞內(nèi)Ca2i動員加快，PKC總活性增高2。對蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)亞型的研究尚未見

6、報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)，觀察低劑量照射后不同時間PKC-，PKC-1及PKC-2蛋白表達(dá)的變化，進(jìn)一步分析低劑量輻射對信號傳遞的影響。材料與方法一、實(shí)驗(yàn)動物：雄性昆明系小鼠20±2g，購于白求恩醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部。設(shè)75mGy、4Gy照射組和假照組，照射后4、12、24、48h斷頭處死小鼠取胸腺，制單細(xì)胞懸液。每組15只鼠，每3只小鼠的胸腺細(xì)胞混合為一樣本，即每組n=5。二、照射條件：Philips深部X射線全身照射(WBI)，電壓200kV，電流10mA，濾過板0.5mm銅，1.0mm鋁，球靶距50cm或212cm，總劑量為4Gy(劑量率0.287Gy/min)和75mGy(劑

7、量率12.5mGy/min)。三、熒光抗體標(biāo)記：PKC-，PKC-1及PKC-2多克隆抗體(Santa Cruz，美國)，羊抗兔IgG-FITC(Jackson,美國)，PMA(Sigma)。調(diào)單細(xì)胞懸液為1×107mL，(懸于含10%新生小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中)，然后加入PMA，終濃度為100nmol/L，于37，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2孵箱中培育，20min后用PBS洗二次，加第一抗體PKC-,PKC1，PKC2結(jié)果一、PKC-的表達(dá)：PKC-陽性細(xì)胞數(shù)在75mGy X射線照射后12h及24h明顯增加，而4Gy X射線照射后數(shù)量明顯下降，見表1。表175mGy與4Gy

8、X射線全身照射后胸腺細(xì)胞PKC-的表達(dá)Time after irradPercentage of PKC-a positive cellsSham75 mGy4 Gy4 h11.64±1.6113.38±2.259.98±1.5212 h13.90±2.1621.94±4.33*7.76±2.14*24 h10.86±1.5016.75±2.80*6.84±1.95*48 h10.10±2.3210.80±2.188.76±1.93*P0.01，vs sham 二、PKC-1

9、的表達(dá)：由表2可見75mGy X射線照射后4、12、24、48h，PKC-1表達(dá)均增強(qiáng)，12h達(dá)峰值。4Gy照射后胸腺細(xì)胞PKC-1的表達(dá)僅在24h稍降低，但差異不顯著。三、PKC-2的表達(dá)：由表3可見75mGy X射線照射后12h及24h PKC-2表達(dá)增強(qiáng)，48h恢復(fù)到假照水平。4Gy照射后4 h胸腺細(xì)胞PKC-2的表達(dá)稍有增高，其它時間呈降低趨勢，但均無明顯差異。表275mGy與4Gy X射線全身照射后胸腺細(xì)胞PKC-1的表達(dá)Tab 2The expression of PKC-1 in thymocytes at different time intervals after WBI w

10、ith 75mGy and 4Gy X-rays (<"9902061.jpg (723 bytes)" align=middle src="/med/cano/201003/20100310181322377.jpg" 13 17>±s，n=5)Time after irradPercentage of  PKC-2   positive  cellsSham75 mGy4 Gy4 h9.42±1.6112.34±1.37*9.74±5.0912 h9.74±1

11、.4625.60±7.36*9.50±3.2124 h8.45±1.3720.02±2.17*6.74±2.7848 h7.60±1.1014.01±2.54*9.72±1.44*P0.05，*P0.01，vs sham 表375mGy與4Gy X射線全身照射后胸腺細(xì)胞PKC-2的表達(dá)Tab 3The expression of PKC-2 in thymocytes at different time intervals after WBI with 75mGy and 4Gy X-rays (<"

12、;9902061.jpg (723 bytes)" align=middle src="/med/cano/201003/20100310181322377.jpg" 13 17>±s，n=5)Time after irradPercentage of  PKC-2   positive  cellsSham75 mGy4 Gy4  h11.26±0.9112.88±3.1914.28±2.9312 h12.56±2.0621.90±4.47*11.62

13、77;2.8424 h11.32±1.8616.63±2.40*9.72±1.4448 h9.54±1.649.22±2.598.70±1.54*P0.01，vs sham 討論各種細(xì)胞接受激素、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子和抗原等刺激時通過不同的信號傳遞通路引起細(xì)胞的功能表達(dá)。已知T淋巴細(xì)胞表面接受抗原或絲裂原作用后通過其TCR/CD3復(fù)合體誘導(dǎo)磷酸脂酶C的激活引起一系列酶促反應(yīng)，導(dǎo)致PKC的活化和Ca2的動員，隨后引起細(xì)胞內(nèi)的分子級聯(lián)反應(yīng)3，此中PKC活化誘導(dǎo)的蛋白磷酸化占有重要地位。PKC有多種亞型，各亞型顯示了不同的酶學(xué)特性及不同的組織

14、表達(dá)和特定的細(xì)胞內(nèi)定位4。目前已明確在動物組織中至少有10種PKC亞型5，分為三組，即傳統(tǒng)PKC(conventional PKCs,包括,)，Ca2非依賴性PKC(Ca2-independent PKCs,包括,)及選擇性PKC(alternative PKCs,包括,),其中較常見的為,三種。組織定位表明，,亞型主要分布于外周組織，而亞型主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，各種亞型有高度的同源性，其結(jié)構(gòu)可分為兩個功能區(qū)，具有催化活性的親水區(qū)和具有調(diào)節(jié)作用能同膜結(jié)合的疏水區(qū)。由于PKC能夠?qū)Χ喾N刺激作用反應(yīng)，可以催化多種靶蛋白發(fā)生磷酸化，因此在信號傳遞中起著樞紐作用。我室對脾臟組織和分離的脾T、B細(xì)胞勻

15、漿PKC總活性研究表明，75mGy全身照射后脾臟T淋巴細(xì)胞活性上升最快，B淋巴細(xì)胞活性上升較晚，分別于照射后12h及4d達(dá)峰值，均于照射后7d酶催化活性回降達(dá)對照值以下，提示細(xì)胞內(nèi)存在反饋機(jī)制，本研究對胸腺細(xì)胞PKC亞型研究表明，75mGy照射后，其PKC ,1,2亞型亦在12h達(dá)最高，而4Gy照射后僅有PKC表達(dá)顯著下降。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高、低劑量全身照射后胸腺細(xì)胞的PKC亞型表達(dá)的變化特點(diǎn)存在明顯的差別。不同劑量引起絕然不同的免疫反應(yīng)變化可能與此有關(guān)。PMA和其它佛波酯的作用被認(rèn)為是基于其與DG的結(jié)構(gòu)相似性，無論是體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)PMA都可以直接激活PKC。已有實(shí)驗(yàn)表明，PKC本身就是P

16、MA的受體6，PKC和PMA結(jié)合后大大增加酶對Ca2和磷酯的敏感性。低濃度的PMA(100nmol/L)就可引起PKC在生理Ca2濃度下被激活。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，低劑量全身照射后胸腺細(xì)胞中PKC可發(fā)生量和質(zhì)的變化，這些變化的發(fā)生可能與照射后TCR/CD3表達(dá)上調(diào)有關(guān)7。但低劑量照射后在PKC表達(dá)上升和Ca2i動員增強(qiáng)與TCR/CD3表達(dá)上調(diào)之間的變化性質(zhì)尚缺乏實(shí)驗(yàn)資料。因此還必須研究PKC上游的變化以闡明整個反應(yīng)過程各環(huán)節(jié)間的關(guān)系。作者單位：謝風(fēng)高申劉樹錚白求恩醫(yī)科大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院檢驗(yàn)科（長春130021）參考文獻(xiàn)1Rigaud O, Moustacchi E. Radioadaptation

17、for gene mutation and the possible molecular mechanisms of the adaptive response. Mutat Res 1996, 358:127.2劉樹錚，蘇旭，韓振波，等.低劑量輻射對T淋巴細(xì)胞游離鈣和蛋白激酶C的影響.中華醫(yī)學(xué)雜志，1994，74(8)：509.3Isakov N, Scholtz W, Altman A. Signal transduction and intracellular events in T-lymphocyte activation. Immunol Today, 1986, 7:271.4Bareggi R, Grill V, Zweyer M, et al. Distribution of the extended family of protein kinase C isoenzymes in fetal organs of mice: an immunohistochemical study. Cell Tissue Res, 1995, 280:617.5Nishizuka Y. Studies and prospectives of the protein kinase C family for cellular regu