日本乙型腦炎病毒NS1基因及其疫苗的研究進(jìn)展.docx

1、doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2012.12.007日本乙曜腦炎痛囂nsiSB設(shè)其is苗的mm王鳳，湯建元，李春蕉，曾智聃,甘振磊,劉建，郝飛（貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院貴州貴陽(yáng)550025）摘要：日本乙型腦炎是由日本乙型腦炎病毒引起的嚴(yán)重的人畜共患傳染病。乙型腦炎病毒的三種糖基化蛋白PrM、E和NS1是其主要免疫保護(hù)性抗原，其中PrM和E蛋白是日本乙型腦炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，其結(jié)構(gòu)和相關(guān)疫苗研究的報(bào)道較多。NS1蛋白是日本乙型腦炎病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，其主要參與病毒復(fù)制的早期階段，推測(cè)可能參與病毒組裝和釋放?？烧T導(dǎo)補(bǔ)體依賴性溶細(xì)胞反應(yīng)，不能產(chǎn)生中和抗體，能誘發(fā)機(jī)體在非中和性抗體

2、存在的情況下產(chǎn)生保護(hù)性免疫。在接種乙腦病毒的細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞表面及上清液中均含有大量的NS1蛋白。對(duì)小鼠接種NS1蛋白或NS1蛋白特異性抗體，均能讓小鼠產(chǎn)生對(duì)乙腦病毒感染的保護(hù)性免疫作用。本文主要就乙型腦炎病毒非結(jié)構(gòu)基因NS1及其免疫疫苗的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為其更進(jìn)一步深入研究JEVNS1基因及其相關(guān)疫苗奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵伺：日本乙型腦炎病毒;NS1基因；相關(guān)疫苗StudyofJapaneseEncephalitisVirusNSIGeneandItsVaccineWangFengrTangDeyuan,LiChunyan,ZengZhiyong,GanZhenlei,LiuJian,HaoFe

3、i(DepartmentofAnimalScience,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou,550025)Abstract:JapaneseencephalitisisaseriouszoonosisdiseasecausedbyJapaneseencephalitisvirus.Threeglycosylationprotein(PrM,E,andNSI)ofJapaneseencephalitisvirusarethemainimmuneprotectiveantigen.PrMandEproteinarethestructureproteinofJapan

4、eseencephalitisvirus;Therearemanyreportsabouttheirstructureandvaccineresearch.NSlproteinisthenon-stmchireproteinofJEV,itisinvolvedintheearlystagesofviralreplication,anditmayalsobeinvolvedinvirusassemblyandrelease.NSIproteindoesn'thaveneutralizationantigenicepitope;Ttcaninducecomplement-dependent

5、cytolyticreactionandinducebodyproduceprotectiveimmuneinthepresenceofnon-neutralizingantibodiesconditions.LargeamountsofNSIproteinexistedinJEVcellculturesupernatant,cellsurfaceandintracellular.MicecanproduceaprotectiveimmuneeffectforJapaneseencephalitisvirusbyinoculatedNSIproteinorpassiveinputNSIprot

6、ein-specificantibodies.ThispapermainlyfocusontheresearchprogressofJEVNSIgeneanditsvaccines,solaythefoundationforfurtherstudyofJEVNSIgeneanditsvaccine.Keywords:JEV;NS1gene;correlationvaccine日本乙型腦炎（Japaneseencephalitis,JE）簡(jiǎn)稱乙腦，是由乙型腦炎病毒（Japaneseencephalitisvirus,JEV,乙腦病毒）經(jīng)蚊蟲(chóng)傳播引起的嚴(yán)重的人畜共患傳染病。該病主要侵犯患病動(dòng)物或人

7、的丘腦、脊髓、角細(xì)胞、大腦皮質(zhì)和小腦，引起嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。動(dòng)物感染JEV后的有30%的會(huì)死亡，存活下來(lái)的50%的動(dòng)物會(huì)留下神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥叫WHO（組織）已將JE列為重點(diǎn)防控的傳染病。JE主要在亞洲流行，在我國(guó)除少數(shù)省份外全國(guó)各地均有JE流行,不僅對(duì)人畜的健康造成極大的危害，還對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成極大地經(jīng)濟(jì)損失，被我國(guó)衛(wèi)生部門列為乙類傳染病。澳大利亞和關(guān)島地區(qū)由于近年來(lái)全球氣候的變暖，乙型腦炎的流行區(qū)域也在不斷擴(kuò)大而出現(xiàn)乙腦病例。目前對(duì)于JE尚無(wú)特效治療方法,因此預(yù)防JE的發(fā)生非常重要，而疫苗又是控制JE發(fā)生的最佳手段，盡管我國(guó)生產(chǎn)的SA14-14-2弱毒活疫苗在預(yù)防人的日本乙型腦炎的發(fā)生起到了

8、重要的作用，但活疫苗畢竟是一種活的微生物，有可能出現(xiàn)毒力反強(qiáng)、帶毒、排毒、垂直傳播、核酸重組等現(xiàn)象，因此，尋求穩(wěn)定、安全及新型的日本乙型腦炎疫苗，已經(jīng)成為近年的研究熱點(diǎn)。1乙型腦炎病毒NS1基因結(jié)構(gòu)與功能日本乙型腦炎病毒(JEV)基因組全長(zhǎng)約為11Kb,為單股正鏈RNA,其基因組包含5,端非編碼區(qū)(5'-NCR)和3,端非編碼區(qū)(3，-NCR)及一個(gè)大小約10.3Kb的單一開(kāi)放閱讀框(ORF),該ORF幾乎跨越整個(gè)基因組，無(wú)亞基因組結(jié)構(gòu)。單一開(kāi)放閱讀框編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白：衣殼蛋白(C)、前膜/膜蛋白(PrM/M)和外膜糖蛋白(E),以及7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、

9、NS4A、NS4B、NS5),各基因順序?yàn)椋?'-C-PrM/M-E-NSl-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3，。其中NS1是一個(gè)含高甘露糖分泌型糖蛋白，分子量約為40kDa,由于在130位和207位存在N-連接糖鏈，因此在感染細(xì)胞內(nèi)其實(shí)際分子量為46kDa左右。在感染細(xì)胞的高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，E蛋白和NS1蛋白形成一種穩(wěn)定的復(fù)合物，其半衰期長(zhǎng)，共同滯留一段時(shí)間后，附著于感染細(xì)胞表面，且不被分泌到細(xì)胞外去，該復(fù)合物并不是前體蛋白的不完全水解而是在病毒復(fù)制周期中產(chǎn)生的一種非特異性異聚蛋白，沒(méi)有生物學(xué)功能。Mason等用E.coli來(lái)表達(dá)乙型腦炎病毒抗原，實(shí)驗(yàn)表明

10、在乙型腦炎病毒感染的細(xì)胞中，NS1蛋白以NS1，和NS1兩種形式存在,NS1和NSV在N末端具基金項(xiàng)目：2006年貴州省高層次人才科研條件特助經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目資助(編號(hào):TZJF-2006年01號(hào))。貴州2011年農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目資助號(hào):酷科合NY字(2011)3013號(hào)。作者簡(jiǎn)介：王鳳(1985-)，女，碩士研完生在讀，主要從事動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)專業(yè)°通訊作者：湯德元(1964-),男，教授，博士，士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物傳染病和中西善醫(yī)結(jié)合教學(xué)科研工作。有相同的序列,NS1，在C末端還存在一段由基因組的NS2a基因編碼的高度疏水的氨基酸序列,NSP的形成機(jī)制目前還不清楚。NS1和NS1，

11、的二聚體存在于JEV感染的細(xì)胞液和單層細(xì)胞中，該二聚體不耐熱耐SDSoHomodimer認(rèn)為NS1以二聚體形式出現(xiàn)是乙腦病毒感染的一個(gè)特點(diǎn)。Hamand同等用重組桿狀病毒表達(dá)NS1,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外的NS1二聚體自由存在或與膜相互作用形成復(fù)合物。NS1是乙型腦炎病毒主要的抗原成分之一，其具體功能目前還不夠清楚,推測(cè)其與膜功能相關(guān)，可能參與乙型腦炎病毒復(fù)制、組裝和釋放囹。它不組成毒粒，具有補(bǔ)體結(jié)合活性，但沒(méi)有血凝抑制活性和中和活性，在沒(méi)有中和抗體的條件下,NS1可誘生依賴于抗體的Fc片段的保護(hù)力。有研究顯示NS1表達(dá)質(zhì)?？杉ぐl(fā)CTL反應(yīng)，再者NS1基因和及其表型具有高度同源性，因此NS1基因可作為RT

12、-PCR檢測(cè)和亞單位疫苗研究的材料。因?yàn)镹S1可使宿主產(chǎn)生保護(hù)性免疫而沒(méi)有抗體依賴性增強(qiáng)(ADE)作用，因此NS1作為亞單位疫苗比滅活疫苗更有優(yōu)勢(shì)叫2乙型腦炎病毒NS1蛋白相關(guān)疫苗的研究2.1乙型腦炎梅毒NS1基因亞單位疫苗亞單位疫苗指用表達(dá)的蛋白制成的疫苗，其優(yōu)點(diǎn)是不含核酸物質(zhì),安全。E蛋白和NS1蛋白是乙腦病毒的主要免疫原性蛋白，因此,E基因和NSI基因是乙腦亞單位疫苗的候選基因。徐宏山等6L采用RT-PCR法擴(kuò)增JEVSA14-14-2株NS1和E蛋白基因片段，分別克隆入原核表達(dá)載體pET-30a(+)和pET-32a(+),構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30NSl和pET-32E,轉(zhuǎn)化大腸桿

13、菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE分析目的蛋白的表達(dá)形式及表達(dá)水平。兩種蛋白經(jīng)親和層析純化后.Westernblot鑒定其反應(yīng)原性。通過(guò)小鼠主動(dòng)和被動(dòng)保護(hù)力試驗(yàn)及豚鼠病毒血癥試驗(yàn)，檢測(cè)兩種蛋白的免疫原性。結(jié)果酶切及測(cè)序證明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確;表達(dá)的重組NS1和E蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分別約為40000和47000,均以包涵體形式表達(dá)；純化的重組NS1和E蛋白的濃度分別為160.7|i”mL和380pg/mL,均具有良好的反應(yīng)原性;小鼠主動(dòng)和被動(dòng)保護(hù)力試驗(yàn)表明兩種蛋白均有保護(hù)活性;豚鼠病毒血癥試驗(yàn)顯示，NS1蛋白免疫豚鼠后能明顯抑制病毒血癥的產(chǎn)生。李波等啊根據(jù)GenBank中

14、提供的乙型腦炎病毒SA14-14-2株全基因序列設(shè)計(jì)引物,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄及巢式PCR方法擴(kuò)增目的片段，測(cè)序后連接pET282a(+)載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-NSl,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后，利用IPTG誘導(dǎo)獲得高效表達(dá)。結(jié)果擴(kuò)增出了1300bp的基因片段，與預(yù)期大小一致，測(cè)序后經(jīng)Blast驗(yàn)證與已發(fā)表乙型腦炎病毒SA14-14-2株NS1蛋白基因序列同源性為100%,成功克隆至表達(dá)載體PET282a(+)并獲得高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物分子量約為45kD,Westernblot分析表明該表達(dá)產(chǎn)物具有良好抗原性,該表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定高效表達(dá)及其抗原特異性為乙腦的診斷試劑開(kāi)發(fā)提供了依據(jù)。此外他還利用

15、生物信息學(xué)的方法對(duì)該蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和功能分析，信號(hào)肽序列預(yù)測(cè)結(jié)果表明該蛋白含有一個(gè)信號(hào)肽序列,為分泌性蛋白，有多個(gè)蛋向激酶磷酸化位點(diǎn)，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中與磷酸化與去磷酸化有關(guān)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)含有豐富的環(huán)形、螺旋和折疊區(qū)。NS1蛋白是在細(xì)胞表面合成的一次跨膜糖蛋白，由信號(hào)肽序列引導(dǎo)，分泌至細(xì)胞外.執(zhí)行相關(guān)生物學(xué)功能，含有兩個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)胞內(nèi)區(qū)其大部分氨基酸序列及活性中心位于胞外區(qū)。乙型腦炎病毒NS1蛋白因可誘生中和抗體而使其在診斷試劑的研發(fā)和疫苗研究中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。研究表明,JEV的多種表達(dá)蛋向及其特定的多肽片段對(duì)于乙腦疫苗的研發(fā)具有很大的潛力。2.2乙型腦炎病毒NS1基因重組活栽體疫苗重組

16、活載體疫苗是以弱病毒為載體，插入多個(gè)或一個(gè)靶病毒的抗原基因重組而成的疫苗。MeCown等罔將JEVNS1基因插入桿狀病毒表達(dá)載體構(gòu)成重組桿狀病毒，將其表達(dá)的特異性重組蛋白免疫C57/B小鼠，經(jīng)強(qiáng)毒攻擊后有70%的小鼠獲得保護(hù)，而非免疫的C57/B小鼠經(jīng)強(qiáng)毒攻擊后僅有30%的小鼠獲得保護(hù)，由此可見(jiàn),重組蛋白可刺激小鼠產(chǎn)生保護(hù)性抗體。徐高原仞等將JEVNS1基因插入到中間轉(zhuǎn)移載體pUSK中構(gòu)建重組pUSK-NSl中間轉(zhuǎn)移表達(dá)質(zhì)粒。將pUSK-NSl與偽狂犬病毒Ea株TK2/gG2/LacZ+基因組共轉(zhuǎn)染IBRS-2細(xì)胞，經(jīng)空斑純化后獲得JEVNS1基因重組偽狂犬病毒株TK2/gG2/NSl+o研究

17、結(jié)構(gòu)表明，重組偽狂犬病毒能表達(dá)JEVNS1蛋白。該重組偽狂犬病毒可作為偽狂犬病和JEV的雙價(jià)基因工程疫苗毒株。彭麗英，汪明應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增出日本乙型腦炎病毒(JEV)的NS1基因，通過(guò)SalI/EcoRI雙酶切后把該基因插入到經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的穿梭質(zhì)粒pDC315中。重組穿梭質(zhì)粒經(jīng)過(guò)雙酶切和PCR鑒定后進(jìn)行測(cè)序.序列測(cè)定正確。將獲得的重組穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后獲得重組腺病毒。PCR鑒定及間接ELISA檢測(cè)的結(jié)果證明所構(gòu)建的重組腺病毒成功地表達(dá)了JEVNS1蛋白。這一結(jié)果為基因工®疫苗的研制及JEV抗體的檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。Konishi等【明研制了能表達(dá)乙型腦炎

18、病毒NS1非結(jié)構(gòu)蛋白的重組NYVAC疫苗，接種豬后產(chǎn)生血凝抑制抗體(HI)和中和抗體，加強(qiáng)免疫后，可抵抗JEV強(qiáng)毒攻擊，不產(chǎn)生病毒血癥©Kanesa-thasan等時(shí)比較了NYVAC-JEV和ALVAC-JEV活載體疫苗，結(jié)果顯示NYVAC-JEV和ALVAC-JEV均可誘導(dǎo)人體產(chǎn)生中和抗體，但由于體內(nèi)已有的痘苗病毒抗體可抑制重組活載體疫苗的抗體應(yīng)答，導(dǎo)致AL-VAC-JEV抗體應(yīng)答較差。目前為止人類還不了解病毒的自然發(fā)生及變異機(jī)理,也就無(wú)法控制重組病毒的未來(lái)走向，一旦將重組病毒投入自然界中，其生物學(xué)特征有可能改變，演變出對(duì)人畜有害的晚前毒。另外,由于以病毒為基礎(chǔ)的載體存在抗體免疫應(yīng)

19、答問(wèn)題，所以乙腦病毒的抗原基因插入痘病毒載體所得到的重組活載體疫苗不能保護(hù)已免疫或感染活載體相應(yīng)病毒的動(dòng)物。因此目前重組活載體疫苗的實(shí)用價(jià)值和安全性倍受爭(zhēng)議。2.3乙型腦炎羯毒NS1基因核酸疫苗核酸疫苗又稱DNA疫苗,是將編碼病毒抗原基因插入真核表達(dá)載體上，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒，將其導(dǎo)入動(dòng)物機(jī)體，在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)通過(guò)其轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生對(duì)該病毒抗原的免疫保護(hù)。目前與乙型腦炎病毒核酸疫苗研究有關(guān)的乙型腦炎病毒基因主要集中于PrM基因、E基因以及NSI基因等。Lin等1131用乙型腦炎病毒PrM/E.NSl基因的cDNA經(jīng)皮下接種于小鼠體內(nèi)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用PrM/EcDNA免疫小鼠經(jīng)強(qiáng)毒攻擊

20、后70%的小鼠獲得保護(hù)，而用NS1cDNA免疫的小鼠經(jīng)強(qiáng)毒攻擊后90%的小鼠獲得保護(hù)。對(duì)照組,用pcDNA免疫的小鼠經(jīng)強(qiáng)毒攻擊后也有40%的小鼠獲得保護(hù)，由此可知真核表達(dá)載體有非特異性免疫佐劑作用。在NS1cD-NA免疫的小鼠體內(nèi)沒(méi)有檢測(cè)到中和抗體，但在補(bǔ)體參與條件下,NS1cDNA對(duì)乙型腦炎感染的細(xì)胞有很強(qiáng)的溶細(xì)胞作用。有研究表明,NS1可在細(xì)胞表面表達(dá)并分泌大量的同型二聚體,NS1，卻不能，且NS2A會(huì)下調(diào)NS1基因疫苗的效果，因此，用NST的cDNA免疫小鼠經(jīng)強(qiáng)毒的攻擊后沒(méi)有保護(hù)作用。無(wú)論對(duì)小鼠免疫抗NS1單克隆抗體，還是NS1非結(jié)構(gòu)蛋白,都能證明乙型腦炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1足夠引發(fā)保護(hù)

21、性免疫并具有激發(fā)保護(hù)性免疫的表位。早期許多學(xué)者以痘苗病毒、Sindbis病毒和桿狀病毒等重組病毒為活載體的研究結(jié)果表明，乙型腦炎病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1對(duì)宿主產(chǎn)生保護(hù)作用的水平并不高。導(dǎo)致這種差異原因可能是由于使用不同毒株的NS1序列或不同的表達(dá)系統(tǒng)。也可能是非結(jié)構(gòu)蛋白NS1在病毒載體的存在下只能作為很弱的免疫原；另外,在NS2A的一些多余序列存在的情況下，NS1也不能產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與過(guò)去對(duì)登革熱的研究結(jié)果相吻合，即在登革熱病毒NS1加上15%的NS2A序列條件下，重組痘苗病毒含登革熱病毒NS1經(jīng)不住登革熱病毒的攻擊時(shí)。使用核酸疫苗進(jìn)行免疫能消除在活疫苗制備中存在的抗原所致的免

22、疫應(yīng)答，且不用顧慮感染因子所帶來(lái)的諸多問(wèn)題，還能夠誘導(dǎo)廣泛的細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生高水平保護(hù)14免城體。但核翰斐苗效力的好壞也取決于許多因素，如抗原自身的特性、免疫途徑、是否使用佐劑或使用佐劑的類型等,所以現(xiàn)在人們對(duì)影響核酸疫苗效力的各種因素展開(kāi)了研究。如果核酸疫苗潛在的安全性和接種方法能夠得到解決和改進(jìn),將具有很大的開(kāi)發(fā)潛力和應(yīng)用前景。同時(shí)JEV核麼螂的開(kāi)發(fā)和利用也將會(huì)有廣闊的前景。目前評(píng)價(jià)日本乙腦疫苗的免疫抗體效價(jià)均依據(jù)產(chǎn)生中和抗體水平,這對(duì)弱毒疫苗是不夠全面的,因此要準(zhǔn)確檢測(cè)不同活疫苗的免疫效價(jià)，還需要建立抗NS1非結(jié)構(gòu)蛋白抗體和其他細(xì)胞免疫的檢測(cè)技術(shù)。由于日本乙腦滅活疫苗在體內(nèi)不復(fù)制

23、,不產(chǎn)生NS1，免疫后缺乏NS1抗原誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致其免疫原性較活疫苗差。NS1疫苗的優(yōu)點(diǎn)在于它不產(chǎn)生抗體依賴性增強(qiáng)作用,是理想的候選亞單位疫苗。黃病毒NS1基因及其表型具有高度同源性，其核酸序列可用于包括JEV在內(nèi)的7種黃病毒，因此NS1疫苗有可能成為一種通用的黃病毒亞單位疫苗。相信不斷出現(xiàn)的重組JEVNS1蛋白，將很可能作為亞單位疫苗在不同動(dòng)物模型中進(jìn)行免疫效力評(píng)價(jià)。BGY參考文獻(xiàn)：1SolomonT.DungNM.KneenR,etal.JapaneseencephalitisJJ.NeuroNeurosurgPsychiatry,2000.68:405-415.2JMasonPW.

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