淺談高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定阿托伐他汀的血藥濃度

1、淺談高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定阿托伐他汀的血藥濃度         【摘要】目的 建立高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定阿托伐他汀血藥濃度的方法。方法 采用純乙腈超聲提取，高速離心沉淀蛋白后，以乙腈-乙酸銨緩沖液作為流動相，Phenomenex Luna 3 C18(2) 100 A (150×2.00mm 3m)反相色譜柱，在正離子模式下以電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜進行測定。結(jié)果 血漿中阿托伐他汀的線性范圍為0.1-20

2、 ng/mL，定量限為 0.1 ng/mL。方法回收率為 96%103%，日間 、日內(nèi)RSD 均小于6%。 結(jié)論 本方法簡單、靈敏、準(zhǔn)確，適用于阿托伐他汀人體血藥濃度的檢測。  【關(guān)鍵詞】阿托伐他汀  血藥濃度  高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）  阿托伐他汀鈣片是他汀類血脂調(diào)節(jié)藥，為3-羥基-3-甲基一戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑1，它能夠降低血漿膽固醇和脂蛋白水平，減少低密度脂蛋白的生成，臨床上用于家族性高膽固醇血癥、混合性高脂

3、血癥等癥。因其降脂作用強，副作用小，在高脂血癥，特別是高膽固醇血癥的治療中得到廣泛應(yīng)用。本文建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定血漿樣品中的阿托伐他汀，本法專靈敏度高、重現(xiàn)性好，樣品處理方法簡便?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。  圖1 阿托伐他汀的結(jié)構(gòu)式 Fig.1 Structure of Atorvastatin 1  實驗部分 1.1材料和試劑 阿托伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所；前處理所用乙腈為分析純，流動相的乙腈為色譜純（德國 MERCK）；實驗用水為超純水，由 Milli-Q系統(tǒng)制作（美國Mi

4、llipore公司）。 1.2液相色譜條件 液相色譜儀器為島津Prominence UFLC；色譜柱選用Phenomenex Luna 3 C18(2) 100 A (150×2.00mm  3m)；柱溫40；流動相：乙腈乙酸銨緩沖液（乙酸銨5mmolL、甲酸0.5（v/v）（體積比6：4），等度洗脫；進樣量10L；流速保持在0.3mL/min。 1.3質(zhì)譜條件 質(zhì)譜儀器為美國AB公司的API4000 Q-trap；電離方式：ESI（+）；選擇多重反應(yīng)監(jiān)（MRM）；電離電壓5500V，

5、輔助加熱溫度500，氣簾氣30psi，霧化氣3psi，碰撞氣：中等，離子源氣體1：50psi，離子源氣體2：60psi。阿托他汀在ESI（+）M+H+ 的MRM模式下的質(zhì)譜參數(shù)見表1。 1.4血漿樣品處理 精確量取血漿樣品0.5mL于10mL離心管中，準(zhǔn)確加入2.5mL乙腈，渦旋2min后，超聲10min，在 4500r/min轉(zhuǎn)速下離心5min。移取上清液用氮氣吹干，用1mL的50%乙腈水定容 ，過0.22m濾膜 ，供LC-MS-MS分析。 表1 阿托伐他汀在ESI（+）M+H+ 的MRM模式下的質(zhì)譜參數(shù) Table 1&

6、#160; Test parameters for Atorvastatin in MRM  定量離子對(quantitative ion pair) 2 結(jié)果與討論 2.1方法的線性范圍、 相關(guān)性及檢出限實驗 以在血漿空白樣品基體中六點添加標(biāo)準(zhǔn)品法制作校正曲線, 7點添加水平分別是0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL。按本文方法進行加標(biāo)回收試驗，結(jié)果表明，方法此范圍內(nèi)線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=

7、0.9998，當(dāng)信噪比S/N10時，定量下限LOQ為0.1 ng/mL。 2.2方法的精密度和回收率 取空白血漿，分別精確加入適量的阿托伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成濃度為0.2 ng/mL、2 ng/mL.10 ng/mL的血漿樣品各6份，按1.4步驟處理在同日內(nèi)重復(fù)測定5次，并連續(xù)5天測定，計算日內(nèi)、日間的精密度。得到的日內(nèi)精密度（RSD%）分別為2.62、3.11、1.97，日間精密度分別為3.55、5.65、4.98。阿托伐他汀0.2 ng/mL、2 ng/mL、10 ng/mL三個水平濃度的測定回收率結(jié)果見表2。 

8、;             表2  空白血漿阿托伐他汀的添加回收率和精密度(n=6) Table 2  Recoveries and precisions of Atorvastatin at different fortified levels (n=6) 2.3穩(wěn)定性試驗 取空白血漿精確加入適量的阿托伐他汀標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別配制成濃度為0.5ng/

9、mL和2 ng/mL血漿溶液，按“1.4”項下血漿處理方法操作，分別于0、2、4、8、10h時進行色譜分析，記錄峰面積。結(jié)果，RSD分別為3.56和4.14。表明樣品血漿溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定。 圖2阿托伐他汀在MRM條件下二種離子的譜圖 Fig.2 Two ion chromatograms of Atorvastatin in MRM 2.4實驗條件的優(yōu)化討論 試驗中比較了甲醇乙酸銨緩沖液、乙腈乙酸銨緩沖液、甲醇水和乙腈水3-6四種流動相體系，結(jié)果表明，以乙腈乙酸銨緩沖液作為流動相得到的峰型最好，出峰時間也較穩(wěn)定。

10、這可能由于水相中甲酸提高了待測物在ESI正離子電噴霧中的離子化效率，乙酸銨則使檢測物出峰時間較為穩(wěn)定。因此本文選擇用乙腈乙酸銨緩沖液作為流動相，得到的譜圖峰形的對稱、出峰時間和靈敏度均較理想（見圖2）。   參 考 文 獻 1趙冰.阿托伐他汀的臨床研究進展J. 中國藥房，2010,21(24):203-204. Plosker GL，Wagstaf AJFluvastatin：a review of its pharmaeology and use

11、0;in the management og hypereholesterolaemiaJDrugs, 1996, 51:433. 姜楠，楊永革，許雪廷，等. LC-MS-MS法測定人血漿中阿托伐他汀濃度J. 藥學(xué)實踐雜志 2 0 1 1, 2 9(1):15-17. 胡曉玲，李環(huán)德UPLC-MSMS法測定健康人血漿中的阿托伐他汀濃度及藥物代謝動力學(xué)研究J. 中南藥學(xué)，2008，6 (4)：400. Tatar S, Atma ca SDetermination of amlodipine in human plasma by