REACH法規(guī) 第五卷譯稿-23

1、C.15 魚在胚胎期和幼苗期的短期毒性實(shí)驗(yàn)1 方法這個(gè)短期的毒性實(shí)驗(yàn)是重復(fù) OECD TG 212（1998）上的。1 引言這個(gè)魚在胚胎期和幼苗期的短期毒性實(shí)驗(yàn)是一個(gè)將生命從受精卵到幼苗期這段時(shí)間暴露在危險(xiǎn)中的短期實(shí)驗(yàn)。在胚胎期和幼苗期沒有飼料提供，而實(shí)驗(yàn)將這樣終止，但是幼苗仍將從卵囊中繼續(xù)培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)打算劃定在測定的特殊時(shí)期和種類中足以致死的和非致死的化學(xué)物質(zhì)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)將提供許多有用的信息包括：a、是一座架在致死和非致死間的橋梁；b、可以作為一個(gè)對(duì)不完全初期生物時(shí)期或慢性毒物的審查性實(shí)驗(yàn)；c、對(duì)在某處耕作技術(shù)還未充分發(fā)展到可以包括內(nèi)部生長到內(nèi)部飼養(yǎng)改變時(shí)期的物種做測定?？赡苷J(rèn)為只有混合魚生命

2、循環(huán)中所有周期的實(shí)驗(yàn)才可能對(duì)慢性毒物對(duì)魚的影響作出一個(gè)準(zhǔn)確的評(píng)估，而且那些在生命各時(shí)期方面減少的暴光度可能會(huì)減少敏感度而因此低估了慢性毒物。為此預(yù)計(jì)胚胎期和幼苗期實(shí)驗(yàn)特別是在一些高親脂性化合物及有特殊毒性效果的化學(xué)物質(zhì)方面不如全程生命實(shí)驗(yàn)敏感。盡管如此，可能在2個(gè)實(shí)驗(yàn)中有一些不特殊的有麻醉效果的物質(zhì)在敏感性上有更微小的差異（1）。在發(fā)表這個(gè)實(shí)驗(yàn)之前，這種胚胎-幼苗期實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)多以一種叫Danio rerio的淡水魚（硬骨魚，鯉科，普通名稱斑馬魚）。更多關(guān)于這個(gè)系列的實(shí)驗(yàn)演示的詳細(xì)指導(dǎo)在附件1中給出。這個(gè)并未避開使用其他可用的經(jīng)驗(yàn)（表格1）。1 定義最低觀測影響濃度（LOEC）：是一種被觀測物質(zhì)

3、在對(duì)比于對(duì)照實(shí)驗(yàn)有明顯影響（當(dāng)p<0.05）的情況下在測定的最低濃度。無觀測影響濃度（NOEC）：是實(shí)驗(yàn)濃度中低于LOEC的濃度。 實(shí)驗(yàn)原理胚胎和幼苗期的魚被暴露在一系列不同濃度的溶有實(shí)驗(yàn)物質(zhì)的水中。在草案中，可能要在半穩(wěn)態(tài)實(shí)驗(yàn)和流動(dòng)法實(shí)驗(yàn)中做出一個(gè)選擇。而這個(gè)選擇取決于實(shí)驗(yàn)物質(zhì)的性質(zhì)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)始于將受精卵放入實(shí)驗(yàn)擴(kuò)展槽中而終于在任一實(shí)驗(yàn)擴(kuò)展槽中的卵黃被幼蟲全部同化之前或饑餓死亡率超出對(duì)照之前。將致死和非致死影響與對(duì)照實(shí)驗(yàn)對(duì)比、評(píng)估，并測出LOEC和NOEC。相互地，也可以用回歸分析來估計(jì)濃度而導(dǎo)致的百分比影響（即：LC/Ecx，這里x定義為影響百分比）。 實(shí)驗(yàn)物質(zhì)信息一個(gè)精確的毒性實(shí)驗(yàn)

4、結(jié)果能更好的顯示出一系列對(duì)實(shí)驗(yàn)的選擇，是可利用的。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以用在選擇早期生命實(shí)驗(yàn)中可處理的實(shí)驗(yàn)濃度范圍。還要知道實(shí)驗(yàn)物質(zhì)在水中的溶解性（包括在實(shí)驗(yàn)用水中的溶解性）和實(shí)驗(yàn)物質(zhì)的飽和蒸汽壓。在一個(gè)已知的、精確實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告并且限量探測的實(shí)驗(yàn)方案中一個(gè)可靠的物質(zhì)定量分析方法是有效的。結(jié)構(gòu)公式，物質(zhì)的純度，在水中和光照下的穩(wěn)定性，Pka，Pow以及預(yù)備生物降解的結(jié)果都是有用的信息。 實(shí)驗(yàn)的有效性對(duì)一個(gè)有效的實(shí)驗(yàn)，應(yīng)當(dāng)遵循以下幾點(diǎn)：所有對(duì)照實(shí)驗(yàn)中相關(guān)的繼續(xù)存活的受精卵及相關(guān)在僅溶的容器中的量不少于附件、中所定義的限制；在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中溶解的氧氣濃度必須在空氣飽合含量的60%100%之間；在實(shí)驗(yàn)擴(kuò)展槽或整

5、個(gè)實(shí)驗(yàn)中任何連續(xù)幾天時(shí)間水溫變化不超過±，并且在一系列實(shí)驗(yàn)中指定的溫度范圍內(nèi)（附件2、3）。1.實(shí)驗(yàn)方法描述實(shí)驗(yàn)擴(kuò)展槽可以使用任何玻璃或其他任何化學(xué)惰性容器。容器的尺寸應(yīng)大至足夠允許滿足投放比率（見章節(jié)）。要求實(shí)驗(yàn)擴(kuò)展槽在實(shí)驗(yàn)地區(qū)的某一隨機(jī)位置。當(dāng)存在實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)誤差時(shí)，一個(gè)對(duì)每個(gè)分步驟處理方式的分步驟預(yù)想對(duì)完全隨機(jī)方案是有好處的，并能夠進(jìn)行適當(dāng)控制。分步驟，如使用，要注意隨后的數(shù)據(jù)處理，而實(shí)驗(yàn)擴(kuò)展槽要小心防備以外打擾。 魚品種的選擇可接受的魚的品種在表格1A中已給出。這里不能避免使用其他種類（例如：在表格1B中所列出的），但實(shí)驗(yàn)步驟上可能不得不提供更好的實(shí)驗(yàn)條件來適應(yīng)實(shí)

6、驗(yàn)步驟。在這種條件下實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告出了選擇的基本原則和實(shí)驗(yàn)方法。養(yǎng)殖魚種類的選擇關(guān)于養(yǎng)殖魚種類的細(xì)節(jié)可在OECD TG 210和參考文獻(xiàn)（2）、（3）、（4）、（5）、（6）中找到。 胚胎和幼苗的處理在主容器中，胚胎和幼苗是暴露在外的，在小點(diǎn)的容器中在側(cè)面和底部安裝網(wǎng)使得容器里允許實(shí)驗(yàn)的水流動(dòng)。那些計(jì)劃好的懸浮在臂狀物上的小容器使得容器上下?lián)u動(dòng)會(huì)產(chǎn)生不狂暴的水流流過小容器，但總能保持有機(jī)體浸沒在水中。在使用一個(gè)虹吸系統(tǒng)。鮭魚的受精卵被放在有足夠幼魚孵化后離開的孔的網(wǎng)或架子上。巴斯德移液管的用處是適當(dāng)?shù)貙⑴咛ズ陀酌缫频桨敕€(wěn)態(tài)實(shí)驗(yàn)中并每日都重復(fù)（見章節(jié)1.6.6）。在大容器中放有卵的格子或網(wǎng)是卵的容

7、器。這些限制可以在幼苗孵化后移除，但要保留一些以阻止魚逃跑。如果有需要遷移幼苗，它們就不能暴露在空氣中且網(wǎng)不應(yīng)用來將魚從卵容器中放出來（對(duì)于一些易碎種類如鯉魚，這個(gè)警告不必要）。對(duì)于這個(gè)遷移而安排的時(shí)間隨種類而改變而且遷移并不一定是必要的。對(duì)半穩(wěn)態(tài)技術(shù)，如必要也可使用燒杯或淺底容器，并在其底部上方裝一個(gè)紗網(wǎng)且比燒杯底略微提高一點(diǎn)。如果這組容器足夠滿足裝樣要求，那遷移胚胎和幼苗是沒必要的。 水類似列在附件4的符合可接受的稀釋物的化學(xué)性質(zhì)的任何水和那些在附件2、3中描述的可以且可能好的展示實(shí)驗(yàn)效果的水都是合適的實(shí)驗(yàn)用水。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中水的性質(zhì)要不變。而pH則只能在單位內(nèi)波動(dòng)。為保證稀釋水不會(huì)不正

8、當(dāng)?shù)赜绊憣?shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（例如與實(shí)驗(yàn)物質(zhì)生成配位化合物），或反之影響繁殖用的卵的演示。在不同區(qū)間取樣進(jìn)行分析。重金屬（如Cu、Pb、Zn、Hg、Cl、Ni）、主要的陰離子、陽離子（如Ca2+、Mg2+、K+、Cl-、SO42-）、農(nóng)藥（如全部含磷、含氯的有機(jī)物）、全部含碳有機(jī)物和懸浮的土壤的含量都要準(zhǔn)備好。例如每3個(gè)月測定一次以保證稀釋水的性質(zhì)是不變的。如能證明水質(zhì)至少一年保持不變，測定可以不必太頻繁，周期可長一些（如每6個(gè)月一次）。 實(shí)驗(yàn)溶液選擇濃度的實(shí)驗(yàn)方法是由繁殖溶液的稀釋來決定的。單純地通過機(jī)械方式（如攪拌機(jī)和超聲波）簡單的混合或搖動(dòng)實(shí)驗(yàn)物質(zhì)可以更好地為繁殖溶液做準(zhǔn)備。飽和柱（溶解柱）可用

9、來完成一個(gè)濃縮的繁殖溶液。盡可能地避免使用溶劑或分散劑（溶解藥劑）。盡管如此，在一些情況下也可用該類物質(zhì)制備適合繁殖的合適濃度的儲(chǔ)備液，的例如丙酮、乙醇、甲醇、DMF、和三甘醇二甲醚都是較好的溶劑。而cremophor RH40、Tween 80、0.01%甲基纖維素和HCO40是較好的分散劑。當(dāng)使用易為生物分解的藥劑（如丙酮）和那些在流通實(shí)驗(yàn)中因易揮發(fā)而導(dǎo)致細(xì)菌組合出問題的藥劑時(shí)要特別注意。當(dāng)使用一種溶解劑的時(shí)候，它絕對(duì)不能對(duì)魚的生存構(gòu)成威脅或產(chǎn)生在早期生命時(shí)期可觀測到的不利影響。盡管如此，在使用類似材料時(shí)盡可能避免產(chǎn)生任何影響。對(duì)半穩(wěn)態(tài)技術(shù)，要進(jìn)行2個(gè)不同的重復(fù)步驟(i)要么為新的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

10、干凈的容器并在不接觸空氣條件下將生存的卵和幼苗從原來的舊溶劑中遷移到新容器；(ii)要么將有機(jī)體保持在容器中同時(shí)換一定比例（不少于3/4）的實(shí)驗(yàn)用水。更新的頻率取決于實(shí)驗(yàn)物質(zhì)的穩(wěn)定性但每天換水是必要的。如果通過初步穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)物質(zhì)濃度再更新期間不能穩(wěn)定（即：超出標(biāo)準(zhǔn)濃度80%120%的范圍或低于80%），則考慮使用流通法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。無論如何，在水更新操作要小心，以免壓迫幼苗。對(duì)流通性實(shí)驗(yàn)，需要一個(gè)能持續(xù)分配、稀釋繁殖溶液的系統(tǒng)（如測量泵，比例稀釋器，飽和系統(tǒng)）來制備一系列濃度的展開槽。繁殖溶液和稀釋水的流速要在每日不同時(shí)間段控測并且在全部實(shí)驗(yàn)中變化不超過10%。一個(gè)合適的流速要求在24小時(shí)

11、中流過至少5個(gè)實(shí)驗(yàn)展開槽（2）。17 測定步驟魚在胚胎期和幼苗期的短期毒性實(shí)驗(yàn)演示中的有效信息在文獻(xiàn)中可查得。一些例子可在文獻(xiàn)（7）、（8）、（9）中查得。 暴露條件 持續(xù)時(shí)間這個(gè)實(shí)驗(yàn)最好在卵受精后30分鐘內(nèi)開始。在胚盤分裂初期或胚囊初期前后將胚胎浸入實(shí)驗(yàn)溶液。對(duì)于大量獲得的卵不可能在受精后立刻開始實(shí)驗(yàn)。推遲實(shí)驗(yàn)會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)的敏感度。這個(gè)實(shí)驗(yàn)應(yīng)在受精后8小時(shí)開始。在暴露期幼苗禁止喂食。實(shí)驗(yàn)終止于任一幼蟲將卵黃完全吸收光為止或餓死率超出對(duì)照之前。持續(xù)的時(shí)間長短取決于使用的材料種類。在附件2、3中給出了可接受的持續(xù)時(shí)間。裝樣在實(shí)驗(yàn)開始前受精卵的數(shù)量應(yīng)當(dāng)足以達(dá)到統(tǒng)計(jì)要求。它們應(yīng)隨機(jī)分

12、布在整個(gè)系統(tǒng)中。并且30個(gè)受精卵，平均分配到至少3個(gè)同樣的實(shí)驗(yàn)擴(kuò)展槽中，應(yīng)當(dāng)使用在每一濃度而裝樣比率（每份實(shí)驗(yàn)溶液的生物量）應(yīng)當(dāng)足夠低到可以溶解的氧氣濃度在通風(fēng)環(huán)境下至少保持占60%ASV（美國標(biāo)準(zhǔn)）。對(duì)流通法來說，裝樣比率不超過24小時(shí)0.5g/L，而且要求無論何時(shí)對(duì)溶液說不超過5g/L。光照和溫度光照時(shí)間和實(shí)驗(yàn)水溫要適合所實(shí)驗(yàn)的種類（附件2、3），使用溫控儀的目的是，它可以在附加實(shí)驗(yàn)容器上使用。1.7.2 實(shí)驗(yàn)濃度一般地，要求5組實(shí)驗(yàn)物質(zhì)濃度間隔恒定在不超過3.2。在選擇實(shí)驗(yàn)濃度的范圍時(shí)，要考慮相關(guān)的LC50對(duì)光照時(shí)間的曲線。在一些條件下，少于5個(gè)濃度如一些限制實(shí)驗(yàn)或一個(gè)更狹

13、小的濃度區(qū)間的用處是適當(dāng)?shù)?。如果少?個(gè)濃度，則要提供理由。物質(zhì)濃度要高于96小時(shí) LC50或100mg/L，低于任何一個(gè)則無須測定。在測定中水中物質(zhì)高于它們?nèi)芙舛葎t不予實(shí)驗(yàn)。當(dāng)使用一種溶劑（或分散劑）（見章節(jié)1.6.6）時(shí)，它的最終濃度不應(yīng)該高于0.1mg/L并且應(yīng)在所在實(shí)驗(yàn)容器中保持一致。1.7.3 對(duì)照實(shí)驗(yàn)稀釋水的對(duì)照實(shí)驗(yàn)（適當(dāng)濃度）和如有關(guān)的溶劑含量（盡量重復(fù)）的對(duì)照實(shí)驗(yàn)應(yīng)當(dāng)在除實(shí)驗(yàn)進(jìn)程之外時(shí)進(jìn)行。1.7.4化學(xué)分析中測定和測量的頻率在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)物質(zhì)的濃度是由規(guī)定的區(qū)間來決定的。在半穩(wěn)態(tài)實(shí)驗(yàn)中，希望實(shí)驗(yàn)物質(zhì)的濃度浮動(dòng)在標(biāo)準(zhǔn)范圍20%上下（即：在80%120%范圍內(nèi)；見章節(jié) 1

14、.4和1.6）。最低限度要求在新準(zhǔn)備的和即將更新時(shí)的最高和最低實(shí)驗(yàn)濃度要在至少3個(gè)不同分開的場合進(jìn)行分析（即：再更新準(zhǔn)備和在更新時(shí)，要對(duì)相同溶液的試樣進(jìn)行分析）。對(duì)于那些實(shí)驗(yàn)物質(zhì)濃度無法預(yù)計(jì)是否在正常范圍內(nèi)20%（在實(shí)驗(yàn)物質(zhì)穩(wěn)定的基礎(chǔ)上），就必須在新準(zhǔn)備的和即將更新時(shí)的最高和最低實(shí)驗(yàn)濃度進(jìn)行分析，但要保證同一種方法（即：整個(gè)實(shí)驗(yàn)至少平等的在3個(gè)平分的區(qū)間）。更新開始時(shí)實(shí)驗(yàn)物質(zhì)濃度的測量需要在重復(fù)的容器內(nèi)每次測量濃度。測量在分開的7天內(nèi)進(jìn)行。要求實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果建立在精確的濃度上。盡管如此，如果有適當(dāng)證據(jù)證明，溶液內(nèi)實(shí)驗(yàn)物質(zhì)濃度很好的穩(wěn)定在標(biāo)準(zhǔn)的或?qū)嶒?yàn)全程初濃度的20%，那實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可以在標(biāo)準(zhǔn)或精確

15、的初始值上得出。對(duì)流通性實(shí)驗(yàn)，對(duì)半穩(wěn)態(tài)實(shí)驗(yàn)所描述的類似采樣方式是合適的（但這種情況下“舊的”溶液的測量方法是不適用的）。盡管如此，如果實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間大于7天，在第一周增加采樣場合的數(shù)量（如每3組）來保證實(shí)驗(yàn)濃度穩(wěn)定是適當(dāng)?shù)?。樣品要被離心或過濾（如用孔徑0.45µm）。盡管如此，然而無論離心還是過濾都不能將實(shí)驗(yàn)物質(zhì)中非生物適用部分分開，樣品也不必受這些條件約束。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，溶解的氧氣，pH，溫度要在所在容器中精確測量，對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的溫度和最高濃度的容器中總硬度和鹽濃度也要精確測量。至少，溶解的氧氣和鹽濃度要測量3次（開始，中間，結(jié)束）。在半穩(wěn)態(tài)實(shí)驗(yàn)中，溶解的氧氣要更精確的測量，最好在每次

16、更新水前后或至少1周1次。硬度則每次實(shí)驗(yàn)測一次。溫度應(yīng)天天測量且最好在至少1個(gè)實(shí)驗(yàn)容器中繼續(xù)控測。1.7.5 觀測 胚胎生長期盡可能證明胚胎期（如胚囊期）在開始就暴露在實(shí)驗(yàn)物質(zhì)中。這樣做是為了更好的保養(yǎng)好卵樣品。而幼生期的例子及描述的文獻(xiàn)可在文獻(xiàn)（2）、（5）、（10）、（11）查找到。 孵化和繼續(xù)生存孵化和繼續(xù)生存的觀測每天至少記錄一次，而在實(shí)驗(yàn)初期（在前3個(gè)小時(shí)則每30分鐘）提高觀察頻率是可取的，而在一些情況下幸存時(shí)間比死亡數(shù)目更有意義（如：有劇烈毒性影響時(shí)）。死去的胚胎和幼苗一旦腐爛就要迅速移除。在移除死亡個(gè)體時(shí)要千萬小心，別碰到附近的卵和幼苗或?qū)ζ湓斐晌锢頁p

17、傷，死亡標(biāo)準(zhǔn)依不同生命階段而改變：對(duì)卵： 特別是早期，早期的半透明著色的明顯損失和改變，由蛋白質(zhì)凝固或沉淀導(dǎo)致的白色渾濁（不透光）物。對(duì)胚胎：身體移動(dòng)的終止和心跳消失，及半透明胚胎上有不透光的一系列污點(diǎn)出現(xiàn)對(duì)幼苗：靜止不動(dòng)或呼吸消失，心跳停止或中央神經(jīng)系統(tǒng)有白色不透光污點(diǎn)出現(xiàn)或缺乏對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)。 異常跡象大量幼魚在身體上的色素沉著反常，而卵黃吸收期有足夠的取決于實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間和描述的反常現(xiàn)象的性質(zhì)所取得區(qū)間被記錄下來。應(yīng)當(dāng)對(duì)那些自然出現(xiàn)的反常的胚胎和幼苗小心觀察，也應(yīng)記下對(duì)照實(shí)驗(yàn)中那些規(guī)則的百分比次序。反常的動(dòng)物死后應(yīng)從容器中移除。 反常行為在由實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間所決定

18、的足夠區(qū)間中，那些反常，如換氣過度、不協(xié)調(diào)的游動(dòng)和不正常的休眠要記錄下來。這些影響，盡管數(shù)量不同，在觀察時(shí)可以增加致死數(shù)據(jù)的說明即提供了實(shí)驗(yàn)物質(zhì)的毒性反應(yīng)信息。 長度在實(shí)驗(yàn)結(jié)束，要測量每個(gè)個(gè)體長度。標(biāo)準(zhǔn)長、股長或全長均可。如果尾鰭腐爛或鰭上有腐蝕，可使用標(biāo)準(zhǔn)長度。一般地，在一個(gè)運(yùn)行良好的實(shí)驗(yàn)中，重復(fù)對(duì)照實(shí)驗(yàn)時(shí)長度的系數(shù)變化應(yīng)小于20%。 重量在實(shí)驗(yàn)結(jié)束，要測量每個(gè)個(gè)體重量。干重（在60下24小時(shí)）比濕重好。一般地，在一個(gè)運(yùn)行良好的實(shí)驗(yàn)中，重復(fù)對(duì)照實(shí)驗(yàn)時(shí)重量的系數(shù)變化應(yīng)小于20%。以下這些項(xiàng)目將在一些或全部用來作統(tǒng)計(jì)分析：累積死亡率；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后健康幼苗數(shù)；開始孵化和孵

19、化結(jié)束的時(shí)間（即：在每個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中有90%孵化）；每天孵化幼苗數(shù)；實(shí)驗(yàn)殘存者的長度（和重量）；畸形或反常現(xiàn)象的幼苗數(shù)量；展示出反常行為的幼苗數(shù)量。2. 數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理因方法要求考慮實(shí)驗(yàn)方法的改變?nèi)鐚?shí)驗(yàn)擴(kuò)展槽的數(shù)量、濃度的數(shù)量、受精卵的數(shù)量和參數(shù)的測定，所以要求一位統(tǒng)計(jì)員既計(jì)劃實(shí)驗(yàn)又分析實(shí)驗(yàn)。由于方案中一些適當(dāng)?shù)倪x擇，特定的關(guān)于統(tǒng)計(jì)步驟的指導(dǎo)這里不再給出。如果LOEC/NOEC會(huì)被預(yù)估，那對(duì)于每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)采用不同的分析方法或偶爾的表格法來變化的進(jìn)行分析是必要的。為了對(duì)個(gè)體濃度和對(duì)照實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果做倍數(shù)比較，可以使用Dunnett的方法（12）、（13）。其他例子也是合適的

20、（14）、（15）。使用ANOVA的可觀察影響的大小或其它步驟（即實(shí)驗(yàn)的能力）應(yīng)當(dāng)被預(yù)測好并實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告。要注意不足所有在章節(jié)中列出的觀察項(xiàng)目適合用ANOVA做統(tǒng)計(jì)分析。例如實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)累積致死率和健康幼苗數(shù)量要用概率法分析。如果LC/Ecx被預(yù)先估測。合適的曲線，如類似的計(jì)算曲線，適合于使用統(tǒng)計(jì)方法如最小二乘法或非線性最小二乘法的數(shù)據(jù)?？梢源_定曲線參數(shù)以明確LC/Ecx并且可以直接指出它的明顯錯(cuò)誤。而這可以非常容易計(jì)算出LC/Ecx周圍的置信限。除非有更好的選擇不同置信水平的原因，應(yīng)引用雙側(cè)置信95%。適當(dāng)?shù)牟襟E能更好的提供一個(gè)評(píng)估缺乏擬合的重要性，可以使用適當(dāng)曲線的圖解法?；貧w

21、分析對(duì)章節(jié)所有觀察物均使用。2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明要告訴在實(shí)驗(yàn)溶劑中以分析方法的水平限制下的測量的毒物濃度。對(duì)在溶解物質(zhì)的水的上方的濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告說明也要詳細(xì)給出。2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告必須包括下列信息：2.3.1實(shí)驗(yàn)物質(zhì)物理性質(zhì)和相關(guān)的物理-化學(xué)性質(zhì)；化學(xué)鑒別數(shù)據(jù)，包括純度及對(duì)合適的實(shí)驗(yàn)物質(zhì)定量分析的方法；2.3.2實(shí)驗(yàn)種類學(xué)名，血統(tǒng)，親代魚類的數(shù)目（即實(shí)驗(yàn)中有多少母魚用來提供所要求的卵），來源，受精卵的收集和隨后的利用。2.3.3實(shí)驗(yàn)條件習(xí)慣上的實(shí)驗(yàn)步驟（例如：半穩(wěn)態(tài)實(shí)驗(yàn)，流通法，受精到實(shí)驗(yàn)的時(shí)間段，裝樣等等）；實(shí)驗(yàn)方案（例如：實(shí)驗(yàn)擴(kuò)展槽的數(shù)目，重復(fù)次數(shù)

22、，每次重復(fù)胚胎數(shù)）；繁殖溶液的準(zhǔn)備方法和更新的頻率（溶質(zhì)及其濃度在使用時(shí)必須給出）；標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)濃度，測量值，測量方法和明確的容器及方法上的測量誤差，如果實(shí)驗(yàn)物質(zhì)溶解在水中的濃度小于已測的，要提供涉及到測量實(shí)驗(yàn)濃度的測量方法。溶劑水的性質(zhì)：pH，硬度，堿度，溫度，水中溶解的氧氣的濃度，殘余氯元素的級(jí)別（如已測），所有含碳有機(jī)物，懸浮的土壤，實(shí)驗(yàn)環(huán)境的含鹽量和其他可測定的物質(zhì)；容器水的性質(zhì)：pH，硬度，溫度，水中溶解的氧氣的濃度；2.3.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果從實(shí)驗(yàn)物質(zhì)穩(wěn)定性初步得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果所有可接受的可對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)魚種證明（附件2、3）；每日胚胎和幼蟲死亡率/幸存者和全部的死亡率/生還率數(shù)據(jù)；孵化天數(shù)和

23、孵化數(shù)目的數(shù)據(jù)；重量和長度的數(shù)據(jù)；畸形發(fā)生率及其描述；統(tǒng)計(jì)分析和數(shù)據(jù)處理；對(duì)使用ANOVA分析的實(shí)驗(yàn)，對(duì)每個(gè)預(yù)估反應(yīng)在p=0.05時(shí)的LOEC和NOEC，包括使用的統(tǒng)計(jì)步驟的描述和那些初查出影響的程度的跡象；對(duì)用回歸分析的實(shí)驗(yàn)，LC/Ecx和置信區(qū)間和適合計(jì)算的曲線模型。3參考文獻(xiàn)：(1) Kristensen P. (1990) Evaluation of the Sensitivity of Short Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the C

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39、 trout(9)(16) 虹鮭Danio rerioZebrafish(7)(17)(18) 斑馬魚Cyprinus caprioCommon carp(8)(19) 鯉魚Oryzias LatipesJapanese ricefish/medaka(20)(21)PimepHaLes promeLasFathead minnow(8)(22)表格 1B 一些其它文獻(xiàn)曾用過的種類淡水咸水Carassius auratus金魚Menidia peninsuLae潮水 最好的牛腿肉(23)(24)(25) Lepomis macrochirus淺藍(lán)色食用大太陽魚CLupea harengus鯡魚

40、（24）（25）Gadus morhua鱈 (24)（25）Cyprinodon variegatus紅鱸 鯉科小魚(23)(24)(25) 附件 1在一個(gè)毒性測定對(duì)胚胎及 SACFRY 的表現(xiàn)方面的指導(dǎo)引言斑馬魚起源于印度 Coromandel 海岸高速流動(dòng)的河流中。它是鋰魚家族一類通常的水族館魚，有關(guān)它培育和照料方式的信息能在熱帶魚的權(quán)威參考書中查到。LaaLe曾研究過它在漁場研究方面的理論和應(yīng)用（1）。魚體長度很少超過 45 毫米。魚體是圓柱形并帶有7到9條深藍(lán)色的斑紋，與銀色相間，這些斑紋延伸到尾部至尾鰭處。 背部是橄欖綠色。雄性較雌性個(gè)體為小。而雌性更帶銀色的，且腹部更大, 顯然這有

41、利于產(chǎn)卵。成魚能夠忍受溫度， pH 和水硬度的較大變動(dòng)。 然而,為了使魚體健康而產(chǎn)出高質(zhì)量的卵,應(yīng)提供最佳的生存條件。在發(fā)情期間雄魚四處找尋雌魚然后以頭對(duì)著雌魚, 這樣當(dāng)卵產(chǎn)下后便已受精。卵是透明的，且彼此是相互獨(dú)立的, 當(dāng)它們沉到底部時(shí)就有可能被父母吃掉。產(chǎn)卵受陽光影響。如果早晨陽光足夠的話,雌魚通常會(huì)在黎明之后的幾小時(shí)就產(chǎn)卵。每只雌魚一次可產(chǎn)下幾百粒卵，每兩次產(chǎn)卵間隔一個(gè)星期。親代魚的情況,繁殖及早期發(fā)育階段選擇適當(dāng)數(shù)量健康的魚，然后讓這些魚在條件適宜的水中(例：附4)生活，要求在預(yù)計(jì)的產(chǎn)卵期前必須生活至少2周以上。這批魚在本次研究以前必須至少產(chǎn)過一次卵。魚群的密度在此期間不得超過1克每升

42、。在有規(guī)律的換水或是水體凈化可以允許種群密度高一點(diǎn)。培養(yǎng)箱的溫度應(yīng)該維持在25±2，并提供各種各樣的魚食，例如，適當(dāng)?shù)纳唐沸愿墒澄?，或是新鮮的 hatched Arthemia, chironomids(搖蚊),Daphnia（水蚤），白色蚯蚓(Enchytraeids)。兩個(gè)過程在下面有所描述, 這導(dǎo)致有一批健康的受精卵以保證測定：8條雌魚和16條雄魚同放在一個(gè)包含50升已稀釋培養(yǎng)液的桶里,避免受陽光直射且盡可能不受打擾的保持至少48個(gè)小時(shí)。在開始測定的前一天下午把一個(gè)產(chǎn)卵托盤放在魚缸的底部。這個(gè)產(chǎn)卵托盤由plexi-glass(聚異丁烯酸樹脂)或其它合適的材料組成一個(gè)框架，5到7

43、cm高，一個(gè)2到5mm的粗糙的網(wǎng)連到頂部，同時(shí)一個(gè)10到30微米的網(wǎng)在底部。大量由解開的尼龍繩組成的產(chǎn)卵樹附在那個(gè)粗糙的網(wǎng)上。當(dāng)魚已被留在黑暗中12個(gè)小時(shí)之后，一束微弱的光線就會(huì)導(dǎo)致開始產(chǎn)卵。產(chǎn)卵后二到四個(gè)小時(shí)，移開產(chǎn)卵托盤并收集產(chǎn)的卵。產(chǎn)卵托盤作用在于可以防止父母吃掉卵同時(shí)使收集這些卵變得容易。這些產(chǎn)卵的魚在用于本次實(shí)驗(yàn)前必須至少已產(chǎn)過一次卵。在預(yù)產(chǎn)期前至少兩周把5到10條雄魚和雌魚隔離放置。5到10天后，雌魚的腹部變大而且可以看到它們的生殖器乳頭。雄魚則沒有乳頭。產(chǎn)卵就在這個(gè)底部裝有偽裝網(wǎng)（如上所說）的產(chǎn)卵缸內(nèi)進(jìn)行。這個(gè)產(chǎn)卵缸裝滿了作為溶劑的水，因此在底部網(wǎng)以上的水深為5到10cm在預(yù)產(chǎn)期

44、前一天把一條雌魚和兩條雄魚放在缸里面，控制水溫在最適合溫度再高一度。屏蔽所有的光線并把缸放在盡量不受打擾的地方。早上的一絲光線就會(huì)誘發(fā)產(chǎn)卵。2到4小時(shí)后，移開魚并收集卵。如果卵的需求量很大，一條雌魚產(chǎn)的不夠多的話，就應(yīng)該同時(shí)培養(yǎng)幾個(gè)產(chǎn)卵缸。通過記錄這些優(yōu)于測定（數(shù)量和質(zhì)量）的成功產(chǎn)卵經(jīng)歷，這些有著高產(chǎn)卵成功率的雌魚就會(huì)被挑選出來飼養(yǎng)。這些卵會(huì)被轉(zhuǎn)移到一個(gè)由玻璃管（內(nèi)徑不小于4mm)組成的測定容器里,并提供一個(gè)柔和的抽氣球。在測定容器內(nèi)的水要盡可能的少。卵密度比水的大因此會(huì)下沉而落出管子，此時(shí)要小心注意不讓卵（以及幼蟲）接觸空氣。在這些卵中作抽樣微型試驗(yàn)來保證在這第一個(gè)發(fā)育的階段里面所有卵都是一

45、樣好的。對(duì)這些卵不準(zhǔn)消毒。在受精后的24小時(shí)里卵的死亡率是最高的，一般會(huì)達(dá)到5%到40%。如果卵腐敗就代表受精或發(fā)育失敗。一批卵的質(zhì)量看起來似乎是由雌魚決定的，因?yàn)橐恍┐启~總是產(chǎn)下高質(zhì)量的卵，而另一些卻相反。同樣發(fā)育率和孵化率也是因雌魚不同而異。成功的受精卵以及卵黃囊幼蟲發(fā)育得好，一般可達(dá)到90%。在25攝氏度時(shí)受精卵會(huì)孵化3到5天然后卵黃囊會(huì)在受精后的約13天里被吸收。Hisaoka 和 BattLe（2）曾對(duì)胚胎的發(fā)育作過詳細(xì)的定義。從卵和發(fā)育幼蟲的透明度可以看出哪些會(huì)發(fā)育成為魚以及哪些會(huì)發(fā)育為畸形。大約在產(chǎn)卵后4小時(shí)，未受精的卵就可以從受精卵中區(qū)別出來（3）。因?yàn)檫@個(gè)原因，卵和幼蟲會(huì)被放

46、置到一個(gè)小容量的測定器皿里面，這樣就可以用顯微鏡來觀察。早期發(fā)育階段的試驗(yàn)條件，在附錄2里列出。理想的試驗(yàn)環(huán)境的pH值和水硬度分別是7.8和250 mg CaCO3/L 。計(jì)算和統(tǒng)計(jì)建議分兩步進(jìn)行。第一，死亡率，畸形發(fā)育和孵化時(shí)間應(yīng)被統(tǒng)計(jì)分析。然后，在那些對(duì)上述統(tǒng)計(jì)項(xiàng)沒有任何影響的濃度上，魚體的平均長度可以通過統(tǒng)計(jì)求出。這個(gè)步驟是可取的，因?yàn)槎舅乜梢杂羞x擇性的殺死小魚，延遲孵化時(shí)間并使畸形魚量增大，因此導(dǎo)致平均魚體長度的測量值偏差。此外，每次測量的魚數(shù)目相同，這樣也保證了統(tǒng)計(jì)數(shù)值的有效性。LC50 及 EC50 定義平安生存下來卵和幼蟲的百分比和修正后的死亡率符合 Abbott 公式(4)：其

47、中 修正后的存活率 試驗(yàn)中集中觀察到的存活率C 控制下的存活率如果可能的話, 在試驗(yàn)結(jié)束的時(shí)候LC50 已被一個(gè)適當(dāng)?shù)姆椒Q定。如果在EC50 的統(tǒng)計(jì)中試驗(yàn)的畸形率與期望值差不多，可在StepHan(5)中得到指導(dǎo)。LOEC 和 NOEC估計(jì)一個(gè)客觀的卵和 sac-fry試驗(yàn)是為了與受控的非零集中相比較，即決定了LOEC.因此多方面的比較方式應(yīng)被采用。參考文獻(xiàn)(1) Laale H.W. (1977) The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) inFisheries Research. A Literature Revie

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