測(cè)序技術(shù)回顧與第三代測(cè)序技術(shù)展望

1、測(cè)序技術(shù)回顧與第三代測(cè)序技術(shù)展望摘要：DNA測(cè)序技術(shù)是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的重要的實(shí)驗(yàn)手段。幾十年來(lái)，測(cè)序技術(shù)發(fā)展飛快，本文簡(jiǎn)述了測(cè)序技術(shù)的發(fā)展歷程，詳述了以單分子測(cè)序和基因組光學(xué)圖譜技術(shù)為代表的第三代測(cè)序技術(shù)。關(guān)鍵詞：DNA測(cè)序技術(shù)；單分子測(cè)序；基因組光學(xué)圖譜技術(shù)The sequencing technology review and the third-generation sequencing future perspective Abstract：DNA sequencing technology is one of most important experiment methods in

2、 molecular biology field. For several decades, sequencing technology has been developing quickly. In the paper, it briefly introduces the development process of sequencing technology, and recommends the single molecule sequencing technology and Optical mapping solutions in detail, which are the repr

3、esentatives of the third generation sequencing technology.Key words：DNA sequencing; Single-molecule sequencing; Optical mapping solutions1953年Watson和Crick揭示了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)1，這大大激勵(lì)了人們對(duì)DNA序列的探索。于是DNA測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，是現(xiàn)代分子生物學(xué)中重要的實(shí)驗(yàn)手段。DNA測(cè)序技術(shù)及伴隨產(chǎn)生的基因操縱技術(shù)它極大地推動(dòng)了生命科學(xué)的發(fā)展 23 ?，F(xiàn)介紹DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展歷史及第三代測(cè)序技術(shù)中兩個(gè)代表性的技術(shù)單分子測(cè)序和基因組光學(xué)圖譜

4、技術(shù)。一、DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展歷史DNA測(cè)序技術(shù)迄今經(jīng)歷了三代的發(fā)展。DNA測(cè)序技術(shù)成熟于上世紀(jì)70年代中后期，隨后的20多年第一代測(cè)序技術(shù)測(cè)出了不少簡(jiǎn)單的小型基因組。1990年提出人類基因組計(jì)劃（Human Genome Project ,HGP），逐步誕生了高通量第二代測(cè)序技術(shù)。近年來(lái)，單分子等第三代測(cè)序技術(shù)開始出現(xiàn)，也預(yù)示著測(cè)序技術(shù)將應(yīng)用更廣，測(cè)序的成本越低45。1.1第一代測(cè)序技術(shù)1975年Sanger和Coulson發(fā)明了“Plus and Minus”（俗稱“加減法”）測(cè)定DNA序列6；1977年Maxam and Gilbert發(fā)明了化學(xué)降解法測(cè)序7；1977年Sanger引入d

5、dNTP（雙脫氧核苷三磷酸），發(fā)明了著名的雙脫氧鏈終止法8。雙脫氧鏈終止法有效控制了化學(xué)降解法中化學(xué)毒素和同位素的危害，在隨后的二十多年得到很好的應(yīng)用。這些技術(shù)及在此基礎(chǔ)上發(fā)展的相關(guān)技術(shù)統(tǒng)稱為第一代測(cè)序技術(shù)。（Stephan C Schuster Next-generation sequencing transforms todays biology）第一代測(cè)序技術(shù)在人類基因組計(jì)劃中有了極大作用與發(fā)展 9。1.2 第二代測(cè)序技術(shù) 隨著人類基因組計(jì)劃的完成，人們開始進(jìn)入后基因組時(shí)代（post-genomic era）。科學(xué)家逐步測(cè)出多種生物的序列，傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)已經(jīng)無(wú)法滿足高通量和高效率的大規(guī)模

6、基因組測(cè)序，第二代DNA測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing）就誕生了10。第二代測(cè)序技術(shù)主要有Roche公司應(yīng)用焦磷酸測(cè)序原理的454測(cè)序技術(shù)及454基礎(chǔ)上的GS FLX、GS Junior測(cè)序平臺(tái)11；Illumina公司應(yīng)用合成測(cè)序原理的新一代Solexa Genome Analyzer測(cè)序平臺(tái)，ABI公司使用連接技術(shù)的Solid測(cè)序平臺(tái)。第二代測(cè)序技術(shù)實(shí)現(xiàn)了高通量、高效率、高準(zhǔn)確度的測(cè)序大大降低了測(cè)序的成本，DNA測(cè)序可以向個(gè)人測(cè)序發(fā)展。第二代測(cè)序技術(shù)很好應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）的研究，對(duì)探索

7、人類的遺傳及基因病有極大的意義9。1.3 第三代測(cè)序技術(shù)然而在遺傳學(xué)中，成千上萬(wàn)的基因組需要測(cè)出及分析，高通量的二代技術(shù)還是面臨成本高、效率低、準(zhǔn)確度不是很高等的難題，第三代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)開始嶄露頭角。第三代測(cè)序技術(shù)主要有Helicos公司開發(fā)的單分子測(cè)序、Complete Genomics公司對(duì)人類大型基因組研究中最新技術(shù)12、OpGen公司的Optical Mapping Solutions測(cè)序等。二、單分子測(cè)序(Single-molecule sequencing單分子測(cè)序1989年被J. H. Jett等提出來(lái)的13。單分子測(cè)序在近些年來(lái)發(fā)展迅速， Timothy D. H.等使用了單分

8、子測(cè)序的測(cè)序方法測(cè)定了M13病毒的基因組14，Doron Lipson等使用單分子測(cè)序的方法研究了Saccharomyces cerevisiae DBY746的轉(zhuǎn)錄組15。Helicos公司開發(fā)了新型的單分子測(cè)序儀16。Helicos公司單分子測(cè)序儀的技術(shù)原理是利用合成測(cè)序理論，將樣本DNA數(shù)以百萬(wàn)的單鏈分子綁定在該儀器特有的、沒有背景熒光的玻璃表面，通過(guò)加入熒光標(biāo)記的核苷酸(一次加入4種核苷的1種和聚合酶到單分子陣列中，核苷酸會(huì)結(jié)合到DNA分子上特異性結(jié)合的位點(diǎn)上。用激光激發(fā)結(jié)合在DNA分子上的熒光標(biāo)記的核苷酸，使標(biāo)記物發(fā)出熒光，相機(jī)以15ms速度快速掃描整個(gè)陣列，檢測(cè)特異性結(jié)合到DNA片

9、斷上的熒光堿基。在此之后，結(jié)合的核苷酸對(duì)會(huì)被移動(dòng)除去，然后，通過(guò)重復(fù)加入標(biāo)記的核苷酸來(lái)重復(fù)這一過(guò)程16。2.2單分子測(cè)序步驟單程單分子測(cè)序（single-pass sequencing）（見圖1）1 將DNA雙鏈解開成單鏈，在3端加上標(biāo)記的多聚A尾(poly A tail，再用末端轉(zhuǎn)移酶封閉3端。2 3端與固定在儀器表面的基因組模板寡核苷酸的5端以共價(jià)鍵的形式雜交。3通過(guò)所提取的基因組模板合成測(cè)序的位點(diǎn)。4 在測(cè)序儀器玻璃表面加入被標(biāo)記的堿基和DNA聚合酶的混合液，堿基自然延長(zhǎng)，使用647nm的熒光下對(duì)Cy5直接掃描成像。5 使用化學(xué)方法對(duì)去除堿基中的染料標(biāo)記。6 加入新的標(biāo)記的堿基和DNA聚

10、合酶使反應(yīng)繼續(xù)循環(huán)下去。圖1：?jiǎn)纬虇畏肿訙y(cè)序圖2：雙程單分子測(cè)序（見圖2）在單程單分子測(cè)序中，DNA樣品是與儀器玻璃表面的固定的寡核苷酸相雜交。DNA復(fù)制的時(shí)候，其共價(jià)連接的模板也同時(shí)復(fù)制，在模板的末端提供引物序列。這個(gè)引物序列用于合成法測(cè)序。一個(gè)測(cè)序反應(yīng)后，合成鏈解開，一個(gè)新的引物雜交上去，進(jìn)行第二次測(cè)序。2.3 單分子測(cè)序的優(yōu)勢(shì)單分子測(cè)序減少了試劑的使用，測(cè)序成本價(jià)格大大降低，使得人的基因組測(cè)序低于1000美元慢慢走向可能。此處Helicos公司還有一個(gè)優(yōu)勢(shì)，就是它不需要擴(kuò)增建立DNA庫(kù)，從而切斷數(shù)據(jù)結(jié)果中潛在錯(cuò)誤的來(lái)源。三、基因組光學(xué)圖譜系統(tǒng)(Optical Mapping Soluti

11、onsPhil Latreille等利用光學(xué)圖譜研究了X. nematophila基因組，完成了基因組的組裝17。OpGen公司在近年開發(fā)了一種新型的光學(xué)圖譜技術(shù)18。3.1光學(xué)圖譜技術(shù)原理18這種光學(xué)圖譜技術(shù)是一個(gè)利用單個(gè)DNA分子基因組限制性內(nèi)切酶圖譜快速生成高分辨率、有序的全基因組限制性內(nèi)切酶圖譜的方法。該技術(shù)提供了一種從純菌株或混合樣品中全面了解細(xì)菌、酵母或真菌的基因組結(jié)構(gòu)的方法。這一技術(shù)方法的優(yōu)勢(shì)在于能夠提供有序、高分辨率的多于100個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)/ 數(shù)MB的圖譜，而不需要進(jìn)行耗時(shí)和耗力的基因組測(cè)序。3.2光學(xué)圖譜技術(shù)的實(shí)驗(yàn)步驟181 提取DNA從微生物細(xì)胞中提取高分子量的D

12、NA(High molecular weight ,HMW DNA。將微生物細(xì)胞包埋在低熔點(diǎn)的瓊脂糖中，用裂解液進(jìn)行處理。再將裂解液完全洗凈，在70下溶解瓊脂糖，使用-瓊脂糖酶釋放出HMW DNA。樣品的預(yù)處理隨微生物樣品不同而異。2 DNA固定與消化基因組DNA以單分子的形式固定在帶電的光學(xué)基質(zhì)上，再使用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化。將制備HMW DNA載入微流體光學(xué)芯片的陣列孔道中。基因組DNA以單個(gè)DNA分子的形式固定在長(zhǎng)的平行的陣列中，固定的DNA依然保持其原有的靜電屬性。DNA被限制性內(nèi)切酶處理，切得的限制性酶片段按DNA原來(lái)的順序保持不變。3.染色與組裝將基因組DNA進(jìn)行染色、掃描、計(jì)算、

13、組裝一系列工作，作出全基因組限制性內(nèi)切酶酶切圖譜。消化的DNA使用熒光染料染色，再置于全自動(dòng)的熒光顯微觀察儀采集數(shù)據(jù)。OpGen公司配套的圖像分析軟件測(cè)量每個(gè)DNA分子限制性內(nèi)切酶片段的大小和順序，光信號(hào)轉(zhuǎn)化成數(shù)字信號(hào)生成單個(gè)DNA分子的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)圖譜。通過(guò)DNA分子限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)圖譜相互重疊的部分拼接得到全基因組限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)圖譜光學(xué)圖譜。4. 分析應(yīng)用OpGen的“MapSolver”光學(xué)圖譜軟件，可以比較不同的基因組的遺傳變異，完成高分辨率的流行病學(xué)分析和加快基因組測(cè)序工作的完成。3.3光學(xué)圖譜技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用該技術(shù)擁有很大的優(yōu)點(diǎn)：1.不用擴(kuò)增 ；2.無(wú)需PCR反應(yīng)

14、； 3.不需基因組抽提的試劑； 4.不需末端配對(duì)的文庫(kù)； 5.不用具有序列信息； 6.強(qiáng)大的分析軟件 基因組光學(xué)圖譜技術(shù)在比較基因組學(xué)、流行病學(xué)、食品安全、菌種質(zhì)量監(jiān)控、全基因組序列拼接、菌株分型等有重要應(yīng)用。展望隨著HGP的實(shí)施與完成，DNA測(cè)序技術(shù)得到了飛躍的發(fā)展，在科技迅速發(fā)達(dá)的當(dāng)今社會(huì)，新的測(cè)序技術(shù)提出的周期也越來(lái)越短。越來(lái)越多的生物全基因組的成功測(cè)序，也極大的推動(dòng)了遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等的理論研究，也促進(jìn)了基因組信息在臨床醫(yī)學(xué)中應(yīng)用。測(cè)序技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)就是不斷發(fā)展，創(chuàng)造更為科學(xué)、廉價(jià)、更高效率的測(cè)序技術(shù)，使得其更好應(yīng)用在臨床應(yīng)用中。但是隨著個(gè)人基因圖譜時(shí)代的來(lái)臨，同樣測(cè)序技術(shù)也面對(duì)

15、很多挑戰(zhàn)，比如隱私問題，基因圖譜是個(gè)人的隱私，如何保證在治療過(guò)程中被泄露或是被他人改變基因圖帶來(lái)很多的負(fù)面問題。伴隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，整個(gè)社會(huì)的道德方面也要同時(shí)處理好才能使測(cè)序更好的造福人類。參考文獻(xiàn)1A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature.1953, 171:737-738. 2 Venter J. C. et al. The Sequence of the Human Genome. Science.2001,291:1304 -13513 Lander E. S. et al. Initial sequencing and ana

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