國產(chǎn)球囊導(dǎo)管制作大鼠主動(dòng)脈損傷血管內(nèi)膜增生模型及特性的研究

1、國產(chǎn)球囊導(dǎo)管制作大鼠主動(dòng)脈損傷血管內(nèi)膜增生模型及特性的研究         09-01-30 09:27:00     作者：吳露，張偉，鄧常青    編輯：studa20【摘要】  目的 探討國產(chǎn)2.0 F球囊導(dǎo)管取代進(jìn)口球囊導(dǎo)管致大鼠主動(dòng)脈損傷血管內(nèi)膜增生模型的特點(diǎn)及可行性。方法 采用國產(chǎn)2.0 F球囊導(dǎo)管建立大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮剝脫模型，分別采用組織形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)方法，觀察大鼠血管內(nèi)皮剝脫后內(nèi)膜增生情況及血管平滑肌細(xì)胞(

2、VSMC)表型標(biāo)志基因SM-肌動(dòng)蛋白(SM-actin)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)及型膠原(collagenI)的表達(dá)活性。結(jié)果 采用國產(chǎn)球囊導(dǎo)管反復(fù)3次剝脫大鼠胸腹主動(dòng)脈，與假手術(shù)組作比較，術(shù)后7 d模型組血管內(nèi)膜增生不明顯，SM-actin及PCNA表達(dá)也均不明顯；術(shù)后14 d內(nèi)膜增生較明顯，SM-actin及PCNA表達(dá)均明顯增強(qiáng)；術(shù)后21 d內(nèi)膜呈進(jìn)行性彌漫性增生，SM-actin表達(dá)仍明顯增高，但PCNA表達(dá)不明顯。模型組7、14、21 d collagen表達(dá)與假手術(shù)組比較，差異均無顯著性意義(P0.05)。結(jié)論 國產(chǎn)2.0 F球囊導(dǎo)管致大鼠主動(dòng)脈損傷后，術(shù)后1421 d出現(xiàn)明顯

3、的血管內(nèi)膜增生引起血管再狹窄，其內(nèi)膜增生主要是由于血管平滑肌細(xì)胞增殖所致。表明國產(chǎn)2.0 F球囊導(dǎo)管損傷血管后可取得與進(jìn)口2F Fogarty球囊導(dǎo)管同樣的效果。 【關(guān)鍵詞】  球囊導(dǎo)管；血管平滑肌細(xì)胞；形態(tài)計(jì)量學(xué)；SM-肌動(dòng)蛋白；增殖細(xì)胞核抗原；型膠原；大鼠    To investigate the characteristics and feasibilities of intimal hyperplasia model induced by domestic-made 2.0 balloon catheter in place of import

4、ed balloon catheter in rats with aortal lesion. Methods The rat model of aortal endothelial denudation was established with domestic balloon catheter; and the intimal hyperplasia after vessel endothelial denudation and the active expression of SM-actin, PCNA and Collagen were analyzed with immunohis

5、tochemistry and histomophorlogical methods respectively. Results Compared with sham operated group, the intimal hyperplasia in the group redenuded arterial endothelium by domestic balloon catheter was not obvious and the expressions of SM-actin and PCNA were also not obvious after 7 days; then, hype

6、rplasia began to be observed obviously, and the expression of both SM-actin and PCNA were obvious very much after 14 days; and the diffuse hyperplasia was progressive but the expression of SM-actin was still not obvious after 21 daysThe difference of Collagenexpression between model group and sham o

7、perated group was not statistic significance（P>0.05）. Conclusions The vessel restenosis is caused after de-endothelialization from 14 to 21 days, in which the hyperplasia is mainly resulted by proliferation of vascular     經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)(percutaneous transluminal coronary angioplas

8、ty, PTCA)能明顯減輕心血管疾病的癥狀，給患者帶來福音。但術(shù)后的再狹窄(restenosis, RS)發(fā)生率仍然居高不下，影響了PTCA的遠(yuǎn)期療效。球囊擴(kuò)張后再狹窄的發(fā)生機(jī)制包括血管彈性回縮，損傷部位血栓形成，血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)積聚等1，這些都是PTCA后再狹窄重要的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。目前，有關(guān)防治PTCA后再狹窄的發(fā)生發(fā)展是心血管疾病領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。由于進(jìn)口的球囊導(dǎo)管價(jià)格十分昂貴，且很難匹配應(yīng)用于小動(dòng)物模型，為建立可靠、價(jià)廉的方法，我們采用國產(chǎn)2.0 F球囊導(dǎo)管取代進(jìn)口的球囊導(dǎo)管，建立大鼠主動(dòng)脈損傷血

9、管內(nèi)膜增生模型，并對(duì)該模型的特點(diǎn)及可行性進(jìn)行了研究。    1 材料與方法    11  材料    111  動(dòng)物  健康雄性SD大鼠18只，體質(zhì)量300350 g，由湖南省衛(wèi)生防疫站實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第20010號(hào)；    112  球囊導(dǎo)管  球囊由天津中拓乳膠科技發(fā)展有限公司提供；導(dǎo)管（51/2注射針改裝）由河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生物化學(xué)室溫進(jìn)坤教授、韓梅教授惠贈(zèng)。國產(chǎn)2.0 F球囊導(dǎo)管由球囊和導(dǎo)管

10、組裝而成：將2 cm長的球囊套在導(dǎo)管一端，在導(dǎo)管出水孔的上下兩個(gè)楔形槽分別用細(xì)絲線扎緊；導(dǎo)管另一端連接16號(hào)注射針并固定好。球囊導(dǎo)管準(zhǔn)備好后，在尾端注入生理鹽水充盈球囊(黃豆大小)，回縮自如即可(見圖1)。    113  試劑  增殖細(xì)胞核抗原(The proliferating cell nuclear antigen，PCNA)免疫組化染色試劑盒、兔抗大鼠型膠原多克隆抗體、兔抗大鼠SM-actin多克隆抗體、DAB顯色試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供， SP-9001免疫組化染色試劑盒、多聚賴氨酸由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，

11、其他試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。    1.2  方法    12.1  動(dòng)物模型的建立方法及分組  SD大鼠以水合氯醛麻醉后，作頸部正中切口，手術(shù)暴露及游離左頸總動(dòng)脈11.5 cm，遠(yuǎn)心端結(jié)扎，在左頸總動(dòng)脈近心端用動(dòng)脈夾阻斷后，于頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端剪一“V”形切口，插入國產(chǎn)2.0 F球囊導(dǎo)管，仔細(xì)操縱導(dǎo)管越過主動(dòng)脈弓入胸，下至腹主動(dòng)脈，深度約為67 cm。自導(dǎo)管尾端注入生理鹽水0.40.6 mL充盈球囊，使球囊膨脹至回拉時(shí)有較明顯的阻力感，保持阻力一致回拉導(dǎo)管至主動(dòng)脈弓處，如此重復(fù)3次，旋轉(zhuǎn)180°使

12、球囊轉(zhuǎn)至血管腔的另一面，依上法再重復(fù)3次，充分剝脫內(nèi)皮。完成后撤出導(dǎo)管，結(jié)扎左頸總動(dòng)脈近心端血管以止血，逐層縫合肌肉、皮下層及皮膚層。術(shù)后腹腔注射青霉素(PNC)20萬單位消炎抗菌，連用3 d。將動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型7 d組、模型14 d組和模型21 d組。假手術(shù)組只進(jìn)行手術(shù)操作，不插入球囊損傷。分別于術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)取損傷部位胸主動(dòng)脈段進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及SM-actin、PCNA及collagen免疫組化檢測(cè)。    1.22  形態(tài)學(xué)及血管形態(tài)學(xué)計(jì)量指標(biāo)的測(cè)定  大鼠麻醉后，放血處死，打開胸腔，在內(nèi)皮剝脫段相同部位取血管1 cm，4多聚甲

13、醛固定24 h，乙醇梯度脫水，石蠟垂直定向包埋，每段血管間斷均勻切片810張后，常規(guī)HE染色。每只大鼠標(biāo)本不同時(shí)間點(diǎn)各隨機(jī)取3片進(jìn)行光鏡觀察、照相和圖像分析。按組織學(xué)劃分，內(nèi)彈力膜以內(nèi)為內(nèi)膜，內(nèi)彈力膜與外彈力膜之間為中膜。以MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分別測(cè)量外彈力膜內(nèi)面積、內(nèi)彈力膜內(nèi)面積、管腔面積、外彈力膜周徑、內(nèi)彈力膜周徑以及管腔周徑。并在此基礎(chǔ)上計(jì)算出中膜面積(外彈力膜內(nèi)面積-內(nèi)彈力膜內(nèi)面積)、內(nèi)膜面積(內(nèi)彈力膜內(nèi)面積-管腔面積)、中膜厚度(外彈力膜周徑-內(nèi)彈力膜周徑)/2、內(nèi)膜厚度(內(nèi)彈力膜周徑-管腔周徑)/2、內(nèi)膜面積增生比率內(nèi)膜面積/(內(nèi)膜面積+中膜面積)×100、內(nèi)膜厚度增生比率內(nèi)膜厚度/(內(nèi)膜厚度+中膜厚度)×100、內(nèi)膜中膜面積比、內(nèi)膜中膜厚度比。    12.3  免疫組織化學(xué)檢測(cè)  分別對(duì)SM-actin、 PCNA及collagen進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，鏡下觀察相關(guān)抗原的表達(dá)變化，以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)信號(hào)。每個(gè)指標(biāo)在假手術(shù)組、模型7 d組、模型14 d組和模型21 d組都設(shè)立一個(gè)陰性對(duì)照