生化分離工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、生化分離工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)菌株的優(yōu)化培養(yǎng)菌株的優(yōu)化培養(yǎng)總總DNA或或RNA的抽提的抽提PCR或或RT-PCR擴(kuò)增目的基因擴(kuò)增目的基因乙醇沉淀回收線性化片斷乙醇沉淀回收線性化片斷大腸桿菌表達(dá)載體大腸桿菌表達(dá)載體pET-28酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5 挑取轉(zhuǎn)化子并抽提質(zhì)粒驗(yàn)證表達(dá)質(zhì)粒挑取轉(zhuǎn)化子并抽提質(zhì)粒驗(yàn)證表達(dá)質(zhì)粒(PCR及酶切驗(yàn)證及酶切驗(yàn)證)檢索感興趣的基因檢索感興趣的基因（katB為例）為例）直直接接優(yōu)優(yōu)化化并并合合成成連連T載測(cè)序載測(cè)序結(jié)構(gòu)解析結(jié)構(gòu)解析重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)挑取重組子挑取重組子, 用菌落用菌落PCR方法驗(yàn)證方法驗(yàn)證IPTG誘導(dǎo)促使目的

2、大量蛋白表達(dá)誘導(dǎo)促使目的大量蛋白表達(dá)細(xì)胞破碎及蛋白抽提細(xì)胞破碎及蛋白抽提目標(biāo)蛋白的純化目標(biāo)蛋白的純化蛋白質(zhì)濃度測(cè)定蛋白質(zhì)濃度測(cè)定-Bradford法法目標(biāo)蛋白的鑒定目標(biāo)蛋白的鑒定Western blotting結(jié)晶結(jié)晶本次試驗(yàn)內(nèi)容本次試驗(yàn)內(nèi)容lHis-Tag系統(tǒng)vpMAL系統(tǒng)katBfabZkatB是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)的過(guò)氧化氫酶，其催化細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫分解，保護(hù)細(xì)胞組織，防止膜脂過(guò)氧化。在菌體中常以四聚體的形式存在。大腸桿菌fabZ基因編碼3-羥基脂酰ACP脫氫酶，是大腸桿菌脂肪酸代謝途徑中的必須基因，該基因的突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞的死亡。背景資料背景資料目的基因目的基因 fab

3、Z基因：474bp；蛋白，酶切后MBP標(biāo)簽42.5kDa katB 基因：1467bp；蛋白背景資料背景資料表達(dá)載體表達(dá)載體vpMAL-c2系列的載體帶有malE信號(hào)序列，能使融合蛋白穿過(guò)細(xì)胞膜。Imidazole（咪唑） 競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系背景資料背景資料組氨酸和組氨酸和Ni-NTA系統(tǒng)原理示意圖系統(tǒng)原理示意圖pMALMBP標(biāo)簽 SDS（十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子表面活性劑。它能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，包裹蛋白，掩蓋電荷差異和形狀區(qū)別，使得電泳速率只與分子量有關(guān)。 聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺 (Acr) 和交聯(lián)劑N，N亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑作用下，聚合交聯(lián)而成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠，

4、并以此為支持物進(jìn)行電泳。引發(fā)劑是過(guò)硫酸銨(APS)，催化劑是四甲基乙二胺（TEMED）。背景資料背景資料聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE)原理原理 聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯胺凝膠作為載體的一種區(qū)帶電泳，根據(jù)電荷差異和分子大小不同來(lái)分離蛋白質(zhì)。濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng)和和分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 有些蛋白質(zhì)由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們?cè)趲€基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此，對(duì)于這一類蛋白質(zhì)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對(duì)分子量。 丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺均為神經(jīng)毒劑，對(duì)皮膚有刺激作用

5、。因此必須小心操作，不得吸入和接觸皮膚，聚合完全聚丙烯酰胺凝膠無(wú)毒。電泳前確保玻璃杯下面的氣泡去除干凈！ 一一 、接種、接種系統(tǒng)系統(tǒng)His-Tag系統(tǒng)系統(tǒng)pMAL系統(tǒng)系統(tǒng)菌株編號(hào)B.t97-27JH022宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)大腸桿菌DH5目的基因katBfabZ培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基接種量2%（4ml）2%（4ml）加入抗生素Kan（200ul）Amp（200ul)按2%的接種量將兩種菌株分別加入到含抗生素的LB培養(yǎng)基中,做好標(biāo)記（寫清組號(hào)、基因信息、抗性）。表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)His-TagpMAL目的基因katBfabZ培養(yǎng)溫度3737轉(zhuǎn)速200 rpm200 rpm適宜狀態(tài)O

6、D600=0.6OD600=0.5所需時(shí)間4 h4 h加入IPTG的終濃度0.2 mM(80 l)0.3 mM(120 l)二、誘導(dǎo)二、誘導(dǎo)注：在加入IPTG之前，搖勻菌液并各取1ml于1.5ml的離心管中，做好標(biāo)記（組號(hào)，基因名）記作“誘導(dǎo)前”，放于離心管板中，于-20保存。配試劑將超凈臺(tái)內(nèi)PA瓶中剩余的菌液用槍吸取200l于1.5ml離心管中，10000rpm離心1min，棄上清(可用槍將上清吸盡)。加入200l的無(wú)菌水洗滌菌體上殘留的培養(yǎng)基，10000rpm離心1min，棄上清，然后重懸于40l滅過(guò)菌的去離子水中，100煮沸15min。10000rpm離心1min，取上清5l作為菌落PC

7、R的模板。三、菌液三、菌液PCR PCR （驗(yàn)證目的基因已轉(zhuǎn)入宿主菌中（驗(yàn)證目的基因已轉(zhuǎn)入宿主菌中）H2O8l10XPCRbuffer2.5ldNTP2.0l上游引物(F)1l下游引物(R)1lTaq酶0.5l模板5l總體積20llPCR體系lPCR程序955min9535s5530s7240s/90s7210min255minCycle 30注：陽(yáng)性對(duì)照(將模板換成1 l質(zhì)粒)； 陰性對(duì)照（將模板換成5 l H2O）； 不用重復(fù)，PCR管上做好標(biāo)記！瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳1.制備0.8%瓊脂糖凝膠(已配好)。2.膠板制備:將干凈的膠板放入膠槽中，并在固定位置放好梳子。再將配好的瓊脂糖凝

8、膠在微波爐里充分融化，冷卻到65左右后小心地倒入膠槽內(nèi)。室溫靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子。將膠板放入電泳槽中，添加1TAE電泳緩沖液至沒(méi)過(guò)膠板1-2為止。3.加樣:將PCR后的樣品和與LoadingBuffer充分混勻后加入膠孔中。每加完一個(gè)樣品，應(yīng)更換一個(gè)槍頭，以防污染。4.電泳:打開電源進(jìn)行電泳（電壓80V）。約30min后，停止電泳。5.電泳完畢后，取出凝膠用溴化乙錠（EB）染色。6.觀察照相:在紫外燈下觀察并用拍照保存。將加入誘導(dǎo)劑后的菌液再放入37，200rpm的搖床中誘導(dǎo)培養(yǎng)4-5小時(shí)后收集菌體。基因基因katBfabZ沉淀（離心管對(duì)應(yīng)配平）8000rpm離心5min8000

9、rpm離心5min收菌棄上清，沉淀用15mlbindingbuffer重懸棄上清，沉淀用15mlcolumnbuffer重懸保存2020注：在離心沉淀之前搖勻菌液取1ml于的離心管中，做好標(biāo)記（組 號(hào)，基因名）記作“誘導(dǎo)后” 放在第八組的離心管板上。離心時(shí)用天平嚴(yán)格配平（差異在0.02 g之內(nèi))！四、收菌四、收菌五、裂解細(xì)胞五、裂解細(xì)胞將冷凍保存的細(xì)胞團(tuán)在室溫下解凍，冰上破碎至菌液成澄清（200-300w超聲610s-10s，約20min）,天平嚴(yán)格配平后10000*g，4，離心20min。上清取1ml于離心管中，作標(biāo)記為“上清”沉淀用1ml對(duì)應(yīng)的buffer（his-tag為bindingb

10、uffer，pMAL為columnbuffer）重懸后，保存在的離心管中，標(biāo)記為“沉淀”。系統(tǒng)系統(tǒng)His-Tag系統(tǒng)系統(tǒng)pMAL系統(tǒng)系統(tǒng)柱子類型Ni-NTA柱直鏈淀粉柱充電（裝滿NISO4，溫和搖動(dòng)后自然沉降）操作方法3次bindingbuffer平衡3次columnbuffer平衡堵住下端后上樣（10ml）靜止5min，盛接流出液后再上樣，重復(fù)兩次上樣（10ml）靜止5min，盛接流出液后再上樣，重復(fù)兩次收集最后一次穿透液，取1ml于1.5ml離心管中，標(biāo)記“穿透”收集最后一次穿透液，取1ml于1.5ml離心管中，標(biāo)記“穿透”washbuffer水洗，直到用100%TCA檢測(cè)沒(méi)有白色沉淀為止

11、，一般45次3次Columnbuffer水洗，直到用100%TCA檢測(cè)沒(méi)有白色沉淀為止Elutionbuffer洗滌（每加1ml用1.5ml離心管收集)共收集7管Columnbuffer+10mM麥芽糖的溶液洗滌（每加1ml用1.5ml離心管收集)共收集7管六、蛋白純化六、蛋白純化系統(tǒng)系統(tǒng)His-Tag系統(tǒng)系統(tǒng)pMAL系統(tǒng)系統(tǒng)操作步驟Elutionbuffer洗滌2次buffer+10mM麥芽糖的溶液洗滌2次加入20%乙醇保存加入20%乙醇保存酶切去除標(biāo)簽注：收集到的蛋白做好標(biāo)記后須在冰上保存，避免其失活pMAL系統(tǒng)系統(tǒng)MBP標(biāo)簽的切除標(biāo)簽的切除從A595最大的幾管(一般是第二、第三管)取80

12、l用于蛋白酶FactorXa的酶解。在80l洗脫液中取15l保存在pcr管中，作為酶切對(duì)照。剩下的65l加入3l的FactorXa后混勻，室溫下反應(yīng)2h。分分別在、別在、1h、2h取樣取樣15 l。注：每次取樣做好標(biāo)記后，將樣品放于-20保存第 1步：2倍體積 6M 鹽酸胍，醋酸 第 2步：2倍體積水 第 3步：1倍體積 2% SDS（注意低溫容易析出） 第 4步：1倍體積 25%乙醇 第 5步：1 倍體積 50%乙醇 第 6步：1 倍體積 75%乙醇 第 7步：5 倍體積 100%乙醇 第 8步：1倍體積 75%乙醇 第 9步：1倍體積 50%乙醇 第 10步：1倍體積 25%乙醇 第 11

13、步：1倍體積水 第 12步：5倍體積 100mM EDTA，pH8.0 第 13步：3倍體積水 由于 EDTA處理后仍可有少量蛋白未能完全釋放，建議在純化不同蛋白時(shí)應(yīng)另?yè)Q HisBind 樹脂。樹脂的再生樹脂的再生當(dāng)柱流速明顯下降，或樹脂在使用離子化緩沖液處理之后沒(méi)能顯示深藍(lán)綠色，則樹脂需要更徹底的清洗處理。分離膠（分離膠（12%)濃縮膠濃縮膠(5%)ddH2O3.5 ml 2.33 ml 30%丙烯酰胺4 ml 0.67 ml 分離膠-buffer2.5 ml 不加濃縮膠-buffer不加1 ml 10%APS50 l30 l10%SDS50 l30 lTEMED10 l10 l總體積10

14、ml 4 ml 七、配制七、配制SDS-PAGESDS-PAGE注意：梳子厚度與膠板厚度要配套！注意：梳子厚度與膠板厚度要配套！ 八、八、SDS-PAGESDS-PAGE電泳電泳l點(diǎn)樣順序：誘前、誘后、沉淀、上清、穿透液、W1、W終、E1、E2、E3、酶切后l點(diǎn)樣前：所有的樣品點(diǎn)樣前都要沸水浴15分鐘使蛋白質(zhì)完全變性。一般的點(diǎn)樣量為10-20ul。(記錄點(diǎn)樣順序記錄點(diǎn)樣順序)l點(diǎn)樣完畢后即可開始電泳，先以80伏電壓跑15-20分鐘，蛋白質(zhì)通過(guò)積層膠后，更換到120伏，待溴酚藍(lán)接近分離膠底部后停止電泳，取下膠板，小心撬開膠板割取分離膠，放入染色皿中，加入一定染色液（沒(méi)過(guò)膠面即可）。置于搖床上染色3小時(shí)左右。l染色完畢后，回收染色液，加入脫色液，搖床脫色數(shù)次，最后一次可以過(guò)夜脫色。1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用牛血清白蛋白（BSA)配置成 各濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。（2）考馬斯亮藍(lán)G-250染料試劑：稱100mg考馬斯亮藍(lán)G-250 溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用蒸 餾水稀釋至1L。九、蛋白濃度測(cè)定九、蛋白