ATP生物熒光腫瘤體外藥敏檢測技術(shù)(ATP-TCA)的建立及其VIP

1、碩士研究生：傅軍碩士研究生：傅軍 導(dǎo)師：張偉導(dǎo)師：張偉 研究員研究員l第一部分：第一部分：ATP生物熒光腫瘤體外藥敏檢測技術(shù)概述生物熒光腫瘤體外藥敏檢測技術(shù)概述l第二部分：第二部分：ATP生物熒光腫瘤體外藥敏檢測技術(shù)及質(zhì)量生物熒光腫瘤體外藥敏檢測技術(shù)及質(zhì)量 l 標(biāo)準(zhǔn)的建立標(biāo)準(zhǔn)的建立l第三部分：第三部分：ATP-TCA技術(shù)的臨床應(yīng)用研究技術(shù)的臨床應(yīng)用研究研究背景研究背景l(fā) 化學(xué)治療是腫瘤的三大治療手段之一。近化學(xué)治療是腫瘤的三大治療手段之一。近3030年來，雖年來，雖然某些惡性腫瘤的化學(xué)治療有明顯改善，但多數(shù)腫瘤，然某些惡性腫瘤的化學(xué)治療有明顯改善，但多數(shù)腫瘤，特別是實(shí)體瘤療效仍不理想。這與腫瘤

2、存在個體差異性，特別是實(shí)體瘤療效仍不理想。這與腫瘤存在個體差異性，以及多重耐藥性等因素有關(guān)。以及多重耐藥性等因素有關(guān)。l 因此如何選擇有效藥物，進(jìn)行有的放矢的治療早已成因此如何選擇有效藥物，進(jìn)行有的放矢的治療早已成為化療界所關(guān)注的問題。為化療界所關(guān)注的問題。1. 主要的藥敏檢測方法及其主要的藥敏檢測方法及其存在的問題存在的問題藥敏檢測方法藥敏檢測方法存在問題存在問題 集落形成法集落形成法（HTCA） 標(biāo)本可評價(jià)率低，僅有4070。 實(shí)驗(yàn)周期長，需要2周以上 測試藥物種類和數(shù)量有限 操作繁瑣，難以標(biāo)準(zhǔn)化 陽性預(yù)測值較低，僅有4060四唑藍(lán)比色法四唑藍(lán)比色法 (MTT) 敏感性較差，最低僅能檢測5

3、00個細(xì)胞 量程較小，有效量程在2.0以內(nèi)細(xì)胞毒性差異染細(xì)胞毒性差異染色法色法 (DiSC) 可適用標(biāo)本類型不廣，目前僅用于血液腫瘤 人為判斷因素較大，難以推廣 標(biāo)本可評價(jià)率不高，僅有7080 陽性預(yù)測值較低，僅有7080胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷摻入法摻入法 (3H-TdR) 實(shí)驗(yàn)人員接觸放射，不利于健康 標(biāo)本可評價(jià)率不高，僅有7080 測試結(jié)果僅能反映少量處于增殖相的腫瘤細(xì)胞 對某些藥物的測試結(jié)果存在假陰性理想的藥敏檢測方法應(yīng)該理想的藥敏檢測方法應(yīng)該具備的條件具備的條件1. 操作簡便，可以標(biāo)準(zhǔn)化，便于推廣操作簡便，可以標(biāo)準(zhǔn)化，便于推廣2. 標(biāo)本可評價(jià)率高標(biāo)本可評價(jià)率高3. 檢測敏感、可靠、客

4、觀檢測敏感、可靠、客觀4. 具備產(chǎn)業(yè)化條件具備產(chǎn)業(yè)化條件敏感性好敏感性好可檢測最少可檢測最少1010個細(xì)胞。而其他技術(shù)則一般需要個細(xì)胞。而其他技術(shù)則一般需要500500個細(xì)胞以上個細(xì)胞以上可評價(jià)率高可評價(jià)率高標(biāo)本可評價(jià)率在標(biāo)本可評價(jià)率在90%90%以上以上快速檢測快速檢測完成完成ATPATP檢測僅需檢測僅需3030分鐘，而其它方法需分鐘，而其它方法需1 14 4小時(shí)的孵育時(shí)間小時(shí)的孵育時(shí)間量程寬量程寬 檢測線性范圍為檢測線性范圍為1010100000100000個細(xì)胞個細(xì)胞/ /孔（孔（9696孔培養(yǎng)板）孔培養(yǎng)板）精密度好精密度好變異系數(shù)（變異系數(shù)（CVCV）小于小于10%10%，在國家標(biāo)準(zhǔn)（

5、，在國家標(biāo)準(zhǔn)（10%10%）的范圍內(nèi)）的范圍內(nèi)結(jié)果準(zhǔn)確結(jié)果準(zhǔn)確整體預(yù)測值為整體預(yù)測值為86%86%檢測效率高檢測效率高同時(shí)動態(tài)檢測評估化療藥物同時(shí)動態(tài)檢測評估化療藥物6 6個劑量下對腫瘤的殺傷作用個劑量下對腫瘤的殺傷作用高通量檢測高通量檢測適合適合9696、384384、15361536孔板檢測分析孔板檢測分析自動化程度高自動化程度高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算機(jī)軟件自動分析，分析結(jié)果直觀可靠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算機(jī)軟件自動分析，分析結(jié)果直觀可靠穩(wěn)定性好穩(wěn)定性好 具備產(chǎn)業(yè)化條件具備產(chǎn)業(yè)化條件在有氧條件下在有氧條件下, , 熒光酶熒光酶（luciferaseluciferase）可以催化熒光素可以催化熒光素（lucife

6、rinluciferin）釋放出熒光（波長為釋放出熒光（波長為562562nmnm），同時(shí)同時(shí)ATPATP轉(zhuǎn)變成轉(zhuǎn)變成AMPAMP。所所釋放的熒光強(qiáng)度與胞內(nèi)釋放的熒光強(qiáng)度與胞內(nèi)ATPATP含量呈含量呈正正相關(guān)。相關(guān)。細(xì)胞死亡后，胞內(nèi)細(xì)胞死亡后，胞內(nèi)ATPATP迅速水解，而活細(xì)胞的迅速水解，而活細(xì)胞的ATPATP含量基含量基本恒定。因此所測得的熒光強(qiáng)度反映了活細(xì)胞的數(shù)量。本恒定。因此所測得的熒光強(qiáng)度反映了活細(xì)胞的數(shù)量。比較比較藥物系列濃度對培養(yǎng)細(xì)胞的不同抑制率，參照相應(yīng)藥物系列濃度對培養(yǎng)細(xì)胞的不同抑制率，參照相應(yīng)判斷指標(biāo)，從而判斷指標(biāo)，從而可以評估可以評估該化療藥物對腫瘤細(xì)胞的該化療藥物對腫瘤細(xì)

7、胞的殺傷殺傷效果效果。 ATP + Luciferin + O2 AMP + 2Pi + Photons +OxylaluciferinLuciferase熒光強(qiáng)度與活細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系熒光強(qiáng)度與活細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系1001000100001000001000000100000001020408015831262512502500500010000200004000080000細(xì)胞數(shù)量( 個/ 孔）熒光強(qiáng)度( R L U )r0 .99864. .技術(shù)技術(shù)TumorSingle Cell suspensionMechanical andenzymatical dissociationIncubatio

8、nfor 5-7 daysAddition of drugs/mediumATP-LuminescenceATP extractionand stabilizationSoftware EvaluationConstruction of dose-response plots5.適用腫瘤類型適用腫瘤類型 6.適用腫瘤標(biāo)本類型適用腫瘤標(biāo)本類型 神經(jīng)母細(xì)胞瘤神經(jīng)母細(xì)胞瘤 黑色素瘤黑色素瘤 甲狀腺癌甲狀腺癌 結(jié)直腸癌結(jié)直腸癌 乳腺癌乳腺癌 卵巢癌卵巢癌 胰腺癌胰腺癌 肉瘤肉瘤 胃癌胃癌 肺癌肺癌實(shí)體瘤標(biāo)本實(shí)體瘤標(biāo)本胸腹水胸腹水活檢淋巴結(jié)標(biāo)本活檢淋巴結(jié)標(biāo)本7. 國內(nèi)外研究歷史回顧國內(nèi)外研究歷史回顧時(shí)間

9、時(shí)間國家國家研究人研究人腫瘤類型腫瘤類型結(jié)論結(jié)論19881988年年美國美國SevinSevin BU, BU, PengPeng ZL ZL卵巢癌卵巢癌陽性預(yù)測值：陽性預(yù)測值：92%92%，陰性預(yù)測值：，陰性預(yù)測值：90%90%整體預(yù)測精確值：整體預(yù)測精確值：86%86%19901990年年日本日本JinushiJinushi K, K, HirabayashiHirabayashi胃癌胃癌預(yù)測精確性為預(yù)測精確性為88.9%88.9%19931993年年瑞士瑞士KoechliKoechli OR, OR, AvnerAvner BP BP乳腺癌乳腺癌陽性預(yù)測值：陽性預(yù)測值：90%90%，陰性

10、預(yù)測值：，陰性預(yù)測值：86%86%整體預(yù)測精確值：整體預(yù)測精確值：85%85%19951995年年美、英、德美、英、德三國協(xié)作三國協(xié)作AndreottiAndreotti PE PE CreeCree IA IA 順鉑耐受卵順鉑耐受卵巢癌巢癌整體預(yù)測精確值：整體預(yù)測精確值：92%92%19961996年年英國英國Cree IA, Cree IA, Kurbacher CMKurbacher CMIII/ IVIII/ IV期期乳腺癌乳腺癌整體預(yù)測精確值整體預(yù)測精確值：767619971997年年日本日本Kawamura H, Kawamura H, Ikeda KIkeda K胃腸道腫瘤胃腸道

11、腫瘤陽性預(yù)測值：陽性預(yù)測值：64%64%，陰性預(yù)測值：，陰性預(yù)測值：100%100%整體預(yù)測精確值：整體預(yù)測精確值：84%84%20002000年年美國美國Konecny G, Konecny G, Crohns CCrohns CFIGO FIGO 期期卵巢癌卵巢癌陽性預(yù)測值陽性預(yù)測值：66%66%，陰性預(yù)測值陰性預(yù)測值：89%89%敏感性敏感性：95%95%，特異性特異性：44%44%20002000年年德國德國Mollgard L, Mollgard L, Tidefelt UTidefelt U急性非淋巴急性非淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞白血病陽性預(yù)測值陽性預(yù)測值：86%86%，陰性預(yù)測值陰性預(yù)

12、測值：100%100%20012001年年美國美國OMeara AT, OMeara AT, Sevin BUSevin BU上皮性卵巢上皮性卵巢癌癌陽性預(yù)測值陽性預(yù)測值：83%83%，陰性預(yù)測值陰性預(yù)測值：56.5%56.5%ATP-TCA技術(shù)的臨床相關(guān)性研究結(jié)果技術(shù)的臨床相關(guān)性研究結(jié)果ATP-TCA與其它藥敏檢測方法的相關(guān)性與其它藥敏檢測方法的相關(guān)性ATP-TCAATP-TCA技術(shù)與技術(shù)與DiSCDiSC法的相關(guān)性法的相關(guān)性ATP-TCAATP-TCA技術(shù)與技術(shù)與MTTMTT法的相關(guān)性法的相關(guān)性8.目前先進(jìn)國家對該技術(shù)的評價(jià)目前先進(jìn)國家對該技術(shù)的評價(jià) 因此，ATP-TCA技術(shù)是目前最先進(jìn)的

13、體外藥敏技術(shù)，該技術(shù)敏感，可靠，具有極大的臨床應(yīng)用價(jià)值 lATP-TCA技術(shù)的核心試劑技術(shù)的核心試劑l 1. 熒光酶試劑熒光酶試劑l 熱穩(wěn)定性和發(fā)光效率均好的重組酶試劑保證檢測的敏感性和可熱穩(wěn)定性和發(fā)光效率均好的重組酶試劑保證檢測的敏感性和可l 靠性，滿足臨床實(shí)際工作的需要靠性，滿足臨床實(shí)際工作的需要l 2. 培養(yǎng)基培養(yǎng)基l 腫瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基支持腫瘤細(xì)胞生長增殖，促進(jìn)正常細(xì)胞腫瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基支持腫瘤細(xì)胞生長增殖，促進(jìn)正常細(xì)胞 死亡，從而保證藥敏檢測的腫瘤細(xì)胞特異性死亡，從而保證藥敏檢測的腫瘤細(xì)胞特異性 下面我將就這兩個核心試劑的研發(fā)匯報(bào)我所做的一些工作 熒光酶基因克隆、點(diǎn)突變、表達(dá)及純

14、化熒光酶基因克隆、點(diǎn)突變、表達(dá)及純化(2001,4(2001,42001,10)2001,10) 腫瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基配方篩選及優(yōu)化腫瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基配方篩選及優(yōu)化(2001,5(2001,52001,12)2001,12) 檢測技術(shù)核心試劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立檢測技術(shù)核心試劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立(2002,1(2002,12002,3)2002,3) 工作內(nèi)容及進(jìn)展工作內(nèi)容及進(jìn)展自熒火蟲體內(nèi)發(fā)光腺體提取熒光酶mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,PCR擴(kuò)增，克隆構(gòu)建重組質(zhì)粒PET22b-luc設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物，定點(diǎn)突變熒光酶第245和215位氨基酸序列將含點(diǎn)突變PET22b-luc導(dǎo)入原核高效表達(dá)系統(tǒng)Ecoli

15、-BL21篩選高表達(dá)株，高效穩(wěn)定表達(dá)重組熒光酶通過蛋白工作站，純化生產(chǎn)重組熒光酶制備凍干熒光酶制劑重組熒光酶研發(fā)路線重組熒光酶研發(fā)路線熒光酶基因的克隆和鑒定熒光酶基因的克隆和鑒定PCRPCR產(chǎn)物電泳圖產(chǎn)物電泳圖重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒PET22b-PET22b-lucluc鑒定圖鑒定圖M215：GC AG AlaLeu M245：C G HisGln atggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatcctctagaggatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgctttta

16、cagatgcacatatcgaggtgaacatcacgtacgcggaatacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgaacatttcgcagcctaccgtagtgtttgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaaat

17、taccaataatccagaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtaccagagtcctttgatcgtgacaaaacaattgcactgataatgaattcctctggatctactgggttacctaagggtgtggcccttccgcatagaactgc*ctgcgtcagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttcca

18、ttccatcac*ggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttttacgatcccttcaggattacaaaattcaaagtgcgttgctagtaccaaccctattttcattcttcgccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctgggggcgcacctctttcgaaagaagtcggggaagcggttgcaaaacgcttccatcttccagggatacgacaaggatatgggct

19、cactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcagagaggcgaattatgtgtcagaggacctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatagttgaccgcttgaagtctttaat

20、taaatacaaaggatatcaggtggcccccgctgaattggaatcgatattgttacaacaccccaacatcttcgacgcgggcgtggcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggc

21、caagaagggcggaaagtccaaattgtaa G C ,導(dǎo)致第245位氨基酸置換(HisGln) 測序單位：上海生工GC AG,導(dǎo)致第215位氨基酸置換(AlaLeu) 熒光酶表達(dá)熒光酶表達(dá)電泳圖電泳圖 純化后電泳圖純化后電泳圖熒光酶蛋白質(zhì)熒光酶蛋白質(zhì)電泳圖電泳圖0%20%40%60%80%100%0510152025303537度孵育時(shí)間（m i n ）殘留活性M245突變型熒光酶M215突變型熒光酶野生型熒光酶圖圖1：野生型和突變型熒光酶熱穩(wěn)定性比較：野生型和突變型熒光酶熱穩(wěn)定性比較野生型和突變型熒光酶活性比較野生型和突變型熒光酶活性比較10010001000010000010

22、000001000000025083.33 27.78 9.26 3.091.030.340.11ATP濃度（n g / ml）熒光強(qiáng)度（R L U ）M245突變型熒光酶野生型熒光酶圖圖2：野生型和突變型熒光酶發(fā)光效率及線：野生型和突變型熒光酶發(fā)光效率及線性關(guān)系比較性關(guān)系比較l重組重組熒光酶制劑穩(wěn)定性研究熒光酶制劑穩(wěn)定性研究放置放置溫度溫度活性半衰期活性半衰期液體保存液體保存凍干品凍干品-20-208080天天360360天天442020小時(shí)小時(shí)180180天天25253.83.8小時(shí)小時(shí)2121天天37370.80.8小時(shí)小時(shí)3 3天天因此，我們將熱穩(wěn)定性和發(fā)光效率均好的M245突變熒光酶

23、凍干制劑作為藥敏檢測用酶制劑 *重組熒光酶為M245突變型熒光酶00.511.522.51234567培養(yǎng)時(shí)間（天）熒光強(qiáng)度（1 0 E + 0 5 RLU）MCF-7A549Eca109選擇性培養(yǎng)基生長支持度及選擇性研究選擇性培養(yǎng)基生長支持度及選擇性研究0.0010.010.11101234567培養(yǎng)時(shí)間（天）熒光強(qiáng)度（1 0 E + 0 5 RLU）正常組織良性組織腫瘤組織淋巴細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系生長曲線腫瘤細(xì)胞系生長曲線正常、良性卵巢及腫瘤組織培養(yǎng)生長曲線正常、良性卵巢及腫瘤組織培養(yǎng)生長曲線 新鮮瘤組織體外培養(yǎng)效果圖新鮮瘤組織體外培養(yǎng)效果圖Continued卵巢癌原代培養(yǎng)前后卵巢癌原代培養(yǎng)前后

24、HE及免疫組及免疫組化染色化染色PAN-KERATIN染色正常卵巢上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞正常卵巢上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果培養(yǎng)結(jié)果正常上皮細(xì)胞培養(yǎng)抑制效果圖正常上皮細(xì)胞培養(yǎng)抑制效果圖成纖維細(xì)胞培養(yǎng)抑制效果圖成纖維細(xì)胞培養(yǎng)抑制效果圖培養(yǎng)前后細(xì)胞組成變化 培養(yǎng)前細(xì)胞組成培養(yǎng)前細(xì)胞組成 6天培養(yǎng)后細(xì)胞組成天培養(yǎng)后細(xì)胞組成淋巴 上皮 成纖維 腫瘤 淋巴 上皮 成纖維 腫瘤 細(xì)胞 細(xì)胞 細(xì)胞 細(xì)胞 細(xì)胞 細(xì)胞 細(xì)胞 細(xì)胞 40-50% 10-25% 5-10% 10-20% 1% 10% 75%選擇性培養(yǎng)基的研究結(jié)果表明該培養(yǎng)基具有良好的選擇性，適合腫瘤體外藥敏檢測的需要 1、培養(yǎng)基對腫瘤細(xì)胞生長支持程

25、度、培養(yǎng)基對腫瘤細(xì)胞生長支持程度 以MCF-7細(xì)胞系作為標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系，按2000個細(xì)胞/孔接種濃度接種至96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)七天后，要求測定的RLU值400000。2、ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線 將ATP標(biāo)準(zhǔn)品配成250ng/ml，倍比(3)稀釋7次，做出ATP濃度與RLU（扣除本底吸收值）的標(biāo)準(zhǔn)曲線，要求：r0.995，最小ATP濃度（0.11ng/ml）的RLU400。3、精密度、精密度 選MCF-7細(xì)胞系低、中、高（500、10000、40000個）數(shù)目的細(xì)胞，分別測定十組RLU值，要求： CV440RLU，同時(shí)本底值200 RLU。第三部分第三部分ATP-TCAATP-TCA體外體外藥敏檢測

26、技術(shù)的臨藥敏檢測技術(shù)的臨床應(yīng)用研究床應(yīng)用研究 ATP-TCA 藥物測試方式藥物測試方式評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)敏感(SS)：IC5025%及IC90100%PPC中度敏感(IS)：IC50100%PPC輕度敏感(MS)：IC5025%及IC9025%及IC90100%PPCIC90:抑制90%腫瘤細(xì)胞生長的血漿峰值濃度百分比IC50:抑制半數(shù)腫瘤細(xì)胞生長的血漿峰值濃度百分比PPC:一定臨床用藥劑量對應(yīng)的血漿峰值濃度病病例例數(shù)數(shù) 3 4 年年齡齡 腫腫瘤瘤類類型型 53 (34-74) yrs. 上上皮皮性性卵卵巢巢癌癌 生生殖殖細(xì)細(xì)胞胞腫腫瘤瘤 標(biāo)標(biāo)本本類類型型 實(shí)實(shí)體體瘤瘤標(biāo)標(biāo)本本 32 2 28

27、 腹腹水水標(biāo)標(biāo)本本 手手術(shù)術(shù)病病理理分分期期（F IG O ） 6 18 16 紫紫杉杉醇醇+ 卡卡鉑鉑方方案案耐耐受受病病人人 8 表表1：卵巢癌體外藥敏檢測與臨床療效的比較：卵巢癌體外藥敏檢測與臨床療效的比較臨床相關(guān)性研究初步結(jié)果臨床相關(guān)性研究初步結(jié)果 例數(shù) 體外檢測 體外檢測 敏感 (SS+IS) 耐藥(WS+R)共計(jì) 體內(nèi)敏感（CR+PR） 體內(nèi)耐藥（SD+PD） 18 2 20 1 11 12 共計(jì) 19 13 32*34例卵巢癌中可評價(jià)標(biāo)本為32例，標(biāo)本可評價(jià)率為94.1% 表表2：卵巢癌體外藥敏檢測真實(shí)性評價(jià)：卵巢癌體外藥敏檢測真實(shí)性評價(jià)陽性預(yù)測值陰性預(yù)測值靈敏度特異性 90.6

28、% 94.7% 84.6% 90% 91.7%整體預(yù)測值1. 設(shè)計(jì)個體化治療方案設(shè)計(jì)個體化治療方案2. 研究新的聯(lián)合化療方案研究新的聯(lián)合化療方案3. 化療藥物新適應(yīng)癥研究化療藥物新適應(yīng)癥研究020406080100100502512.56.25Test Drug Concentration (%)Tumor Growth Inhibition (%)DDP+VP16+VCRGEM+DDPCTX+ADM+CBPVP16+CBPGEM+THPBLM+CTX+ACTDBLM+VP16+CBPIFO+VP16+ADM020406080100100502512.56.25Test Drug Concen

29、tration (%)Tumor Growth Inhibition (%)5-FU+DDP+THPPTX+CBPNVB+EPIGEM+PTXBLM+DDP+VCRMMCHCPT+DDPBLM+DDP+5-FU1. 1. 設(shè)計(jì)個體化治療方案設(shè)計(jì)個體化治療方案藥物名稱藥物名稱IC50（PPC%）殺傷作用評估殺傷作用評估BLM+DDP+VCR12.69%部分敏感藥物部分敏感藥物BLM+DDP+5-FU18.59%輕度敏感藥物輕度敏感藥物BLM+CBP +VP1614.79%部分敏感藥物部分敏感藥物VP16+CBP28.16%輕度敏感藥物輕度敏感藥物THP+DDP+5-FU14.79%部分敏感藥物部

30、分敏感藥物VP16+DDP+VCR6.32%較敏感藥物較敏感藥物IFO+VP16+ADM25.5%輕度敏感藥物輕度敏感藥物CTX+ADM +CBP32.4%耐藥藥物耐藥藥物NVB+EPI0.76%強(qiáng)敏感藥物強(qiáng)敏感藥物治療前治療前 該患者經(jīng)多重化療方案復(fù)發(fā)，頸側(cè)、右鎖骨下、胸壁、縱隔淋巴結(jié)廣泛轉(zhuǎn)該患者經(jīng)多重化療方案復(fù)發(fā)，頸側(cè)、右鎖骨下、胸壁、縱隔淋巴結(jié)廣泛轉(zhuǎn)移，氣管、食管壓迫移位并伴有吞咽困難。胸水活檢發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞，淋巴結(jié)病理移，氣管、食管壓迫移位并伴有吞咽困難。胸水活檢發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞，淋巴結(jié)病理活檢證實(shí)為絨毛膜上皮癌，活檢證實(shí)為絨毛膜上皮癌，HCG激素水平為激素水平為600u/ml。治療后治療后（N

31、VB+EPI方案一個半周期以后）方案一個半周期以后） 胸水消失，頸側(cè)、右鎖骨下、胸壁、縱隔淋巴結(jié)病灶緩解或消失，可以進(jìn)胸水消失，頸側(cè)、右鎖骨下、胸壁、縱隔淋巴結(jié)病灶緩解或消失，可以進(jìn)食，食，HCG激素水平降至激素水平降至60u/ml。因此ATP-TCA技術(shù)對于開展腫瘤患者的個體化治療極具指導(dǎo)意義 因此ATP-TCA技術(shù)的建立為腫瘤新化療方案的研究和臨床應(yīng)用建立了重要技術(shù)平臺 ATP-TCA檢測技術(shù)是一種先進(jìn)的藥敏檢測技術(shù)，其具有相檢測技術(shù)是一種先進(jìn)的藥敏檢測技術(shù)，其具有相關(guān)性好（關(guān)性好（r=0.9981）；）；量程寬，跨越量程寬，跨越4個數(shù)量級（個數(shù)量級（10-80000個細(xì)個細(xì)胞）；檢測敏感

32、程度高（最小檢測胞）；檢測敏感程度高（最小檢測10個細(xì)胞）的優(yōu)點(diǎn)。個細(xì)胞）的優(yōu)點(diǎn)。 34例卵巢癌體外藥敏檢測結(jié)果表明，例卵巢癌體外藥敏檢測結(jié)果表明，ATP-TCA技術(shù)可反映不技術(shù)可反映不同病人對藥物的敏感性的個體差別，標(biāo)本可評價(jià)率高，其結(jié)果同病人對藥物的敏感性的個體差別，標(biāo)本可評價(jià)率高，其結(jié)果與臨床療效及相關(guān)臨床資料有較好的吻合性：整體預(yù)測值與臨床療效及相關(guān)臨床資料有較好的吻合性：整體預(yù)測值90.6%，陽性預(yù)測值陽性預(yù)測值94.7%，陰性預(yù)測值，陰性預(yù)測值84.6%，敏感性，敏感性90%，特異性，特異性91.7%。 同時(shí)，該技術(shù)對抗腫瘤藥物篩選和應(yīng)用、臨床藥物新適應(yīng)癥同時(shí)，該技術(shù)對抗腫瘤藥物篩

33、選和應(yīng)用、臨床藥物新適應(yīng)癥研究、化療方案篩選和評估以及推廣個體化治療具有實(shí)際指導(dǎo)研究、化療方案篩選和評估以及推廣個體化治療具有實(shí)際指導(dǎo)意義。意義。 本研究為該技術(shù)的初步臨床應(yīng)用研究，為了進(jìn)一步證實(shí)其臨本研究為該技術(shù)的初步臨床應(yīng)用研究，為了進(jìn)一步證實(shí)其臨床應(yīng)用價(jià)值，大樣本的病例藥敏研究是必要的。床應(yīng)用價(jià)值，大樣本的病例藥敏研究是必要的。 已發(fā)表已發(fā)表 1.王燕，傅軍等.脂肪酸合成酶在非小細(xì)胞肺癌診斷及預(yù)后的臨床意義.中華外科 雜志.2001,14（5）45-47. 2.Xu M, Jin Y-L, Fu J, The abnormal expression of retinoic acid re

34、ceptor-beta, p53 and Ki67 protein in normal, premalignant and malignant esophageal tissues. World J Gastroenterol. 2002,8(2):200-2. 待發(fā)表待發(fā)表 3.Jun Fu, Ping Qu, Mo Li, et al.Expression of plant associated human cancer antigen in normal, premalignant, and malignant esophageal tissues. World J Gastroente

35、rol. 4.傅軍，田海梅等.植物相關(guān)人腫瘤抗原在乳腺癌中的表達(dá)及其臨床意義.中華腫瘤雜志。 5.田海梅，傅軍等.人乳腺癌細(xì)胞異質(zhì)性及其生物學(xué)行為研究.中華腫瘤雜志。 衷心感謝我的導(dǎo)師張偉研究員三年來對我的辛勤教誨和培養(yǎng)。本文是在他的悉心關(guān)懷和指導(dǎo)下完成的。三年來導(dǎo)師在科學(xué)上的遠(yuǎn)見卓識、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ髯黠L(fēng)、虛懷若谷的胸懷和正直的人品一直是我學(xué)習(xí)的楷模并使我受益終身。 本論文是在腫瘤研究所腫瘤生物學(xué)檢測中心完成的，在這里得到了田海梅老師的極大支持和指導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)室劉毅、曲平、劉朝陽老師都給予我熱情的幫助、支持和指導(dǎo)，我的師弟黃泓，王小兵也參與了部分研究工作，在此表示最衷心的感謝。 本課題系由腫瘤醫(yī)院婦瘤

36、科與腫瘤生物學(xué)檢測中心合作進(jìn)行，腫瘤標(biāo)本由婦瘤科提供，在這里得到了吳令英主任和張凱主治醫(yī)師的熱情指導(dǎo)和幫助，在此向他們表示衷心的感謝。 教育處林賽榮老師和王瓏瓏?yán)蠋熢谖业膶W(xué)習(xí)和生活上給予許多關(guān)懷、幫助和照顧，令我感激不盡。謹(jǐn)在此向所有關(guān)心和幫助過我的老師和同學(xué)致以衷心的感謝。 Enjoy the flashes sparkling the nightThank you for your attention! P Pr re ed di i c ct ti i v ve e V Va al l u ue e n n + + - - S Se en ns s. . S Sp pe ec c. .

37、2 23 30 00 0 6 69 9% % 9 91 1% % 7 79 9% % 8 86 6% % 4 49 94 4 5 51 1% % 9 92 2% % 8 86 6% % 6 66 6% % 5 51 10 0 7 77 7% % 9 92 2% % 9 94 4% % 7 71 1% % 3 32 26 6 8 83 3% % 7 73 3% % 8 87 7% % 6 67 7% % 1 12 29 9 9 93 3% % 8 86 6% % 9 90 0% % 8 86 6% % adapted from: DeVita VT, Hellman S, Rosenberg S

38、A: Cancer: Principles and Practice of Oncology,1997AssayHTCA3H-TDISCMTTATPn 28 28 C R 6 (21,5% ) 8 (29% ) PR 7 (25% ) 14 (50% ) SD 11 (39.5% ) 4 (14% ) PD 4 (14% ) 2 (7% ) R R 46.5% 79% PFS (M edi an) 35 W ks. 50 W ks. O A S (M edi an) 67 W ks. 97 W ks. 傳統(tǒng)化療 ATP-TCA指導(dǎo)化療050100150200250020406080100ATP-TCAATP-TCA指導(dǎo)的化療指導(dǎo)的化療 (n = 39)傳統(tǒng)化療傳統(tǒng)化療(n = 17)p = 0,0009Weeks% Patients050100150200250020406080100ATP-TCAATP-TCA指導(dǎo)的化療指導(dǎo)的化療 (n = 39)傳統(tǒng)化療傳統(tǒng)化療(n = 17)p = 0,0016Weeks% PatientsOverall SurvivalProgression free Survival引自引自Kurbacher CM, Cree IA, Brucker. Anticancer Drugs. 199