第五章培養(yǎng)基及設(shè)備的滅菌

1、第五章第五章 培養(yǎng)基及設(shè)備的滅菌培養(yǎng)基及設(shè)備的滅菌使生物反應(yīng)的基質(zhì)或產(chǎn)物，因雜菌的消耗使生物反應(yīng)的基質(zhì)或產(chǎn)物，因雜菌的消耗而損失，造成生產(chǎn)能力的下降。而損失，造成生產(chǎn)能力的下降。 雜菌也會(huì)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，這就使產(chǎn)物的提取雜菌也會(huì)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，這就使產(chǎn)物的提取更加困難，造成得率降低，產(chǎn)品質(zhì)量下降。更加困難，造成得率降低，產(chǎn)品質(zhì)量下降。 有些雜菌會(huì)分解產(chǎn)物，使生產(chǎn)失敗。有些雜菌會(huì)分解產(chǎn)物，使生產(chǎn)失敗。 雜菌大量繁殖后，會(huì)改變反應(yīng)液的雜菌大量繁殖后，會(huì)改變反應(yīng)液的pH值，使值，使反應(yīng)異常。反應(yīng)異常。 如發(fā)生噬菌體污染，生產(chǎn)菌細(xì)胞將被裂解，使如發(fā)生噬菌體污染，生產(chǎn)菌細(xì)胞將被裂解，使生產(chǎn)失敗。生產(chǎn)失敗。

2、染菌造成的不良后果染菌造成的不良后果第一節(jié)第一節(jié) 培養(yǎng)基滅菌的目的、要求和方法培養(yǎng)基滅菌的目的、要求和方法 一、定義一、定義1. 培養(yǎng)基滅菌的定義 指從培養(yǎng)基中殺滅有生活能力的細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)體及其孢子，或從中將其除去。工業(yè)規(guī)模的液體培養(yǎng)基滅菌，殺滅雜菌比除去雜菌更為常用。2. 滅菌與消毒的區(qū)別滅菌：用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽孢和孢子。消毒：用物理或化學(xué)方法殺死物料、容器、器皿內(nèi)外的病源微生物。二、培養(yǎng)基滅菌的目的二、培養(yǎng)基滅菌的目的 1. 在發(fā)酵過程中夾雜其它雜菌造成的后果 2. 工業(yè)上具體措施 包括：（1）使用的培養(yǎng)基和設(shè)備須經(jīng)滅菌；（2）好氧培養(yǎng)中使用的空氣

3、應(yīng)經(jīng)除菌處理；（3）設(shè)備應(yīng)嚴(yán)密，發(fā)酵罐維持正壓環(huán)境；（4）培養(yǎng)過程中加入的物料應(yīng)經(jīng)過滅菌；（5）使用無(wú)污染的純粹種子。3. 培養(yǎng)基滅菌的目的4. 培養(yǎng)基滅菌的要求（1）達(dá)到要求的無(wú)菌程度（10-3）（2）盡量減少營(yíng)養(yǎng)成分的破壞5. 滅菌的方法（1）化學(xué)法 化學(xué)藥品滅菌法 （2）物理法 干熱滅菌法 濕熱滅菌法 射線滅菌法 6，濕熱滅菌的原理 當(dāng)溫度超過生長(zhǎng)的最高限度時(shí)，微生物細(xì)胞中的原生質(zhì)膠體和酶發(fā)生不可逆的凝固變性，使微生物在很短時(shí)間內(nèi)死亡。7. 濕熱滅菌中的相關(guān)定義 致死溫度致死溫度：殺死微生物的極限溫度。 致死時(shí)間致死時(shí)間：在致死溫度下，殺死全部微生物所需的時(shí)間。 微生物的熱阻微生物的熱阻

4、：是指微生物在某一特定條件（主要是溫度和加熱方式）下的致死時(shí)間。 相對(duì)熱阻相對(duì)熱阻：指某一微生物在某條件下的致死時(shí)間與另一微生物在相同條件下的致死時(shí)間的比值。 各種微生物對(duì)濕熱的相對(duì)熱阻微生物相對(duì)熱阻營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和酵母細(xì)菌芽孢霉菌孢子病毒和噬菌體1.03106210158. 濕熱滅菌的優(yōu)點(diǎn) 蒸汽來源容易，操作費(fèi)用低，本身無(wú)毒 蒸汽有強(qiáng)的穿透力，滅菌易于徹底 蒸汽有很大的潛熱 操作方便，易管理第二節(jié)第二節(jié) 濕熱滅菌的理論基礎(chǔ)濕熱滅菌的理論基礎(chǔ) 一、培養(yǎng)基濕熱滅菌需解決的工程問題一、培養(yǎng)基濕熱滅菌需解決的工程問題1. 將培養(yǎng)基中的雜菌總數(shù)N0 殺滅到可以接受的總數(shù)N（10-3/ml）， 需要多高的溫度

5、、多長(zhǎng)的時(shí)間為合理。2. 滅菌溫度和時(shí)間的確定 取決于：（1）雜菌孢子的熱滅死動(dòng)力學(xué) （2）反應(yīng)器的形式和操作方式（3）培養(yǎng)基中有效成分受熱破壞的可接受范圍二、微生物的熱死滅動(dòng)力學(xué)方程二、微生物的熱死滅動(dòng)力學(xué)方程 微生物營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的均相熱死滅動(dòng)力學(xué)符合化學(xué)反應(yīng)的一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，即： N：任一時(shí)刻的活細(xì)菌濃度（個(gè)/L） t：時(shí)間（min） 1NkdtdN K：比熱死速率常數(shù)（死亡速率）（min-1） 取邊界條件t0=0，N=N0，對(duì)（1）積分得上式稱為對(duì)數(shù)殘留定律上式稱為對(duì)數(shù)殘留定律 2ln0tKNN 30KteNN死亡速率k，又稱為滅菌速度常數(shù)K越大，表明微生物越容易死亡。一定溫度下，比死亡速率

6、k隨微生物的種類不同而不同；同一種微生物其營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞與芽孢的k也不同。對(duì)熱抵抗能力較弱：細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)體、酵母菌、放線菌、病毒及phage。對(duì)熱抵抗能力較強(qiáng)：細(xì)菌芽孢和霉菌的孢子。三、溫度對(duì)三、溫度對(duì)K K的影響的影響 比熱死滅速率常數(shù)K與滅菌溫度T的關(guān)系可用阿累尼烏斯方程表征 A：頻率因子（min-1） E：活化能（J/mol） R：通用氣體常數(shù)J/（mol.k） 4/ RTEeAK 從方程（4）可以看出：（1）活化能E的大小對(duì)K值有重大影響（2）不同菌的孢子的熱死滅反應(yīng)E可能各不相同對(duì)方程（4）兩邊取對(duì)數(shù)，得 5lnlnAKRTE 對(duì)方程（5）兩邊對(duì)T取導(dǎo)數(shù)，得 由方程（6）可得出結(jié)論：反應(yīng)的E

7、越高，lnK對(duì)T的變化率越大，即T的變化對(duì)K的影響越大。 62lnTREdTKd受熱物質(zhì)E（J/mol）維生素B12維生素B1鹽酸鹽嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子肉毒梭菌孢子枯草桿菌孢子9623292048283257343088317984例：嗜熱脂肪芽孢桿菌 嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子死滅程度為N/N0=10-16時(shí)，滅菌溫度對(duì)維生素B1破壞的影響滅菌溫度（C）達(dá)到滅菌程度的時(shí)間（min）維生素B1的損失（%）100110120130140150843757.60.8510.1070.01599.9989271031理論滅軍時(shí)間的估算理論滅軍時(shí)間的估算培養(yǎng)基在滅菌前，存在各種各樣的微生物，培養(yǎng)基在滅菌前，

8、存在各種各樣的微生物，k值值不同計(jì)算時(shí)，可以取對(duì)熱抵抗力較大的芽孢桿不同計(jì)算時(shí)，可以取對(duì)熱抵抗力較大的芽孢桿菌的菌的k值。值。此時(shí)，此時(shí)，A取取1.341036s-1， E E取取2.8442.84410-5J/mol。即：即：36.127+T14845-=lgk例：某發(fā)酵罐裝培養(yǎng)基例：某發(fā)酵罐裝培養(yǎng)基40m3，在，在121下進(jìn)行分下進(jìn)行分批滅菌。設(shè)每毫升培養(yǎng)基中含耐熱的芽孢為批滅菌。設(shè)每毫升培養(yǎng)基中含耐熱的芽孢為107個(gè)，求理論滅菌時(shí)間。個(gè)，求理論滅菌時(shí)間。解：解：N0=10106107=41014個(gè)個(gè) Ns=0.001個(gè)個(gè) 算得：算得：K=0.0281s-11.55-=36.127+121

9、+27314845-=36.127+T14845-=lgk24min=1442.6=0.001104ln0.02811=NNlnk1=4s0第三節(jié)第三節(jié) 培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì)培養(yǎng)基滅菌的工程設(shè)計(jì)一、無(wú)菌的標(biāo)準(zhǔn)一、無(wú)菌的標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)微生物熱死滅方程，要求滅菌后達(dá)到絕對(duì)無(wú)菌。 在工程設(shè)計(jì)中常取N=10-3二、分批滅菌二、分批滅菌1. 分批滅菌的設(shè)計(jì) 在發(fā)酵罐中進(jìn)行實(shí)罐滅菌，是典型的分批滅菌。 全過程包括升溫、保溫、降溫三個(gè)過程。孢子熱死亡的規(guī)律符合 7NkdtdN積分，得 在分批滅菌過程中 8ln0tKNN 9lnlnlnlnln221022100NNNNNNNNNNNNNN升溫、冷卻階段T是時(shí)間t

10、的函數(shù)，K不是常數(shù)，所以： 式中Kh是保溫階段的孢子比熱死亡速度常數(shù) 10ln100/tRTENNdteA 11ln1221ttKhNN 12ln322/dteAttRTENN分批滅菌中幾種換熱方式的溫度-時(shí)間變化關(guān)系2. 保證間歇滅菌成功的要素（1）內(nèi)部結(jié)構(gòu)合理(主要是無(wú)死角)，焊縫及軸封裝置可靠，蛇管無(wú)穿孔現(xiàn)象（2）壓力穩(wěn)定的蒸汽（3）合理的操作方法 發(fā)酵罐的接管圖4. 培養(yǎng)基間歇滅菌過程中應(yīng)注意的問題（1）溫度和壓力的關(guān)系（2）泡沫問題（3）投料過程中，麩皮和豆餅粉等固形物在罐壁上殘留的問題（4）滅菌結(jié)束后應(yīng)立即引入無(wú)菌空氣保壓三、連續(xù)滅菌的設(shè)計(jì)三、連續(xù)滅菌的設(shè)計(jì)1. 連續(xù)滅菌的流程（1

11、）噴射加熱連續(xù)滅菌噴射加熱連續(xù)滅菌流程典型的噴射加熱連續(xù)滅菌時(shí)的溫度和時(shí)間曲線圖（2）薄板換熱器連續(xù)滅菌 薄板換熱器連續(xù)滅菌流程薄板換熱器連續(xù)滅菌時(shí)的溫度和時(shí)間曲線圖（3）噴淋冷卻連續(xù)滅菌 噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程3. 連續(xù)滅菌設(shè)備的結(jié)構(gòu)及計(jì)算（1）設(shè)備結(jié)構(gòu)：套管式連消塔噴嘴式連消塔連消器噴射加熱器薄板換熱器維持罐四、連續(xù)滅菌與間歇滅菌的比較四、連續(xù)滅菌與間歇滅菌的比較1. 連續(xù)滅菌的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： 保留較多的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量、容易放大、較易自動(dòng)控制、糖受蒸汽的影響較少、縮短滅菌周期、在某些情況下，可使發(fā)酵罐的腐蝕減少、發(fā)酵罐利用率高、蒸汽負(fù)荷均勻 缺點(diǎn)： 設(shè)備比較復(fù)雜，投資較大 2. 分批滅菌的優(yōu)缺點(diǎn)

12、優(yōu)點(diǎn)： 設(shè)備投資較少、染菌的危險(xiǎn)性較小、人工操作較方便、對(duì)培養(yǎng)基中固體物質(zhì)含量較多時(shí)更為適宜 缺點(diǎn)： 滅菌過程中蒸汽用量變化大，造成鍋爐負(fù)荷波動(dòng)大，一般只限于中小型發(fā)酵裝置 。五、影響滅菌的因素五、影響滅菌的因素1. 培養(yǎng)基成分對(duì)滅菌的影響 油脂，糖類及一定濃度的蛋白質(zhì)可增加微生物的耐熱性，另一些物質(zhì)，如高濃度的鹽類，色素等可削弱其耐熱性。2. pH值的影響pH值對(duì)微生物的耐熱性影響很大，pH為6.08.0時(shí)微生物最不易死亡， pH 6.0時(shí)氫離子易滲入微生物的細(xì)胞內(nèi)。3. 培養(yǎng)基的物理狀態(tài)對(duì)滅菌的影響4. 培養(yǎng)基中微生物數(shù)量對(duì)滅菌的影響5. 培養(yǎng)基中氫離子濃度對(duì)滅菌的影響 培養(yǎng)基中氫離子濃度

13、直接影響滅菌的效果。培養(yǎng)基的 酸堿度越大，所需殺滅微生物的溫度越低。6. 微生物細(xì)胞中水分對(duì)滅菌的影響細(xì)胞含水越多，蛋白質(zhì)變性的溫度越底7. 微生物細(xì)胞菌齡對(duì)滅菌的影響老細(xì)胞水分含量低、低齡細(xì)胞水分含量高8. 空氣排除情況對(duì)滅菌的影響9. 攪拌對(duì)滅菌的影響10. 泡沫對(duì)滅菌的影響六、六、常見培養(yǎng)基與設(shè)備、管道滅菌條件常見培養(yǎng)基與設(shè)備、管道滅菌條件1. 殺菌鍋內(nèi)滅菌固體培養(yǎng)基滅菌：壓力0.098MPa，維持2030min；液體培養(yǎng)基滅菌：壓力0.098MPa，維持1520min；玻璃器皿及用具滅菌：壓力0.098MPa，維持3060min。2. 種子罐、發(fā)酵罐、計(jì)量罐、補(bǔ)料罐等的空罐及管道滅菌從

14、有關(guān)管道通入蒸汽，使罐內(nèi)蒸汽壓力達(dá)0.147MPa，維持45min。3. 空氣總過濾器和分過濾器滅菌 維持壓力0.147MPa，滅菌2h4. 種子培養(yǎng)基實(shí)罐滅菌從夾層通入蒸汽間接加熱至80 ，關(guān)閉夾層蒸汽的進(jìn)口閥門、升溫121 ，30min谷氨酸發(fā)酵的種子培養(yǎng)基實(shí)罐滅菌為110 ，維持10min5.發(fā)酵培養(yǎng)基實(shí)罐滅菌121 ，30min，谷氨酸實(shí)消105 ，維持5min6. 發(fā)酵培養(yǎng)基連續(xù)滅菌 一般培養(yǎng)基130 ，維持5min 谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基為115 ，68min7. 消泡劑滅菌 直接加熱至121 ，30min8. 補(bǔ)料罐滅菌 根據(jù)料液不同而異，淀粉質(zhì)原料121 維持5min9. 尿素溶液滅

15、菌 105 ，5min七、發(fā)酵罐的滅菌七、發(fā)酵罐的滅菌 培養(yǎng)基的滅菌如果是采用連續(xù)滅菌法，則發(fā)酵罐應(yīng)在加入滅菌的培養(yǎng)基前先行單獨(dú)滅菌。通常是用蒸汽加熱發(fā)酵罐的夾套或設(shè)管并從空氣分布管中通入蒸汽，充滿整個(gè)容器后，再?gòu)呐艢夤苤芯従徟懦?。容器?nèi)的蒸汽壓力保持1kg，20min。在保溫結(jié)束后，關(guān)鍵是隨即通入無(wú)菌空氣，使容器保持正壓，防止形成真空而吸入帶菌的空氣。注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：l 先將罐內(nèi)空氣排盡，滅菌時(shí)要保持蒸氣暢通，使有關(guān)閥門、管道徹底滅菌；l 嚴(yán)格檢查有關(guān)罐體、管道、法蘭、軸封、閥門等有無(wú)滲漏、穿孔、堵塞、死角以及有無(wú)閥門忘開、忘關(guān)、開關(guān)次序搞錯(cuò)，泡沫冒頂和逃液等不正?，F(xiàn)象；l 在配料時(shí)應(yīng)開攪拌器，盡量將各種粉餅等團(tuán)塊打碎，攪拌均勻，防止結(jié)塊或大顆粒對(duì)其內(nèi)部微生物的保護(hù)；l 淀粉配比超過4%時(shí)必須水解，否則影響滅菌效果；l 滅菌時(shí)，罐蓋面上的玻璃視鏡必須用橡皮墊蓋好，以防沾著冷水引起炸裂。八、附屬設(shè)備滅菌發(fā)酵罐的附屬設(shè)備：分空氣過濾器，補(bǔ)料系統(tǒng)、消沫劑系統(tǒng)等。（1）分空氣過濾器在發(fā)酵罐滅菌之前進(jìn)行滅菌，滅菌后用空氣吹干備用。（2）補(bǔ)料罐的滅菌溫度視物料性質(zhì)而定，如糖水，滅菌時(shí)蒸氣壓力為0.1Mpa（120），保溫30min。（3）油罐（消沫劑罐）滅菌