腺病毒載體介導(dǎo)的遺傳病基因治療研究和應(yīng)用進(jìn)展

1、    腺病毒載體介導(dǎo)的遺傳病基因治療研究和應(yīng)用進(jìn)展            作者：萬成松 張文炳時間：2007-11-22 12:14:00                     關(guān)鍵詞： 人類腺病毒；遺傳性疾??；基因療法

2、60;     一群分布廣泛的呼吸道病毒，A:6090nM，無包膜，20面體立體對稱型。分為大約47個血清群，其中Ad2、Ad4、Ad5和Ad7在疫苗和基因轉(zhuǎn)移載體研究方面，應(yīng)用最普遍。腺病毒粒子衣由252個殼粒組成，幾何排列成240個非頂角六鄰體和12個五鄰體。基因組為雙股DNA，呈線性，長度大約36kb。腺病毒的轉(zhuǎn)錄區(qū)分早期（early,E1、E2、E3、E4）轉(zhuǎn)錄區(qū)和晚期（late）轉(zhuǎn)錄區(qū)。復(fù)制周期大約為3236小時。 腺病毒載體法是基因治療中最有前途的基因轉(zhuǎn)移方法之一。其生物學(xué)特性得到廣泛研究。Ad有一個中等大小的基因組（平均36kb），適合于容

3、納于大片段基因，與反轉(zhuǎn)發(fā)病毒載體相比，腺病毒載體能有效地外源基因轉(zhuǎn)動到各種靶細(xì)胞或組織中。載體容易構(gòu)建和操作。宿主范圍廣，感染性強(qiáng)，可經(jīng)不同途徑進(jìn)入不同組織，能感染分化后的非分裂期細(xì)胞。在Ad生活周期中，其基因不整合到宿主細(xì)胞中，無插入突變激活癌基因的危險(xiǎn)，外源基因能游離地表達(dá)。Ad制成疫苗臨床應(yīng)用表明，體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移是安全是。 最近幾年，Ad載體已引起科研人員的廣泛關(guān)注，Ad可用于遺傳病、傳染病和腫瘤等疾病基因治療的研究和應(yīng)用。 一、不同動物組織中腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 Rosenfeld等1把1抗胰蛋白酶（1-An-titrypsin,1-AT）基因轉(zhuǎn)動到肺上皮細(xì)胞中，證實(shí)重組腺病毒載體和其野

4、生型病毒一樣，易感染宿主上皮組織，特別是呼吸道上皮組織。但把Ad載體通過靜脈注射到小鼠模型體內(nèi)，也可在肝內(nèi)檢測到大量載體?？蒲腥藛T在不同動物模型上作了大量基因轉(zhuǎn)移試驗(yàn)，證實(shí)采用氣管內(nèi)皮滴注法，肌肉注射、腦門實(shí)體接種等方法可感染Ad，感染部位有呼吸道內(nèi)皮組織，肝組織、眼組織、羊膜內(nèi)腔等。研究證明，重組Ad載體把目的基因轉(zhuǎn)動到不同組織中，為Ad載體介導(dǎo)的遺傳病基因缺陷糾正治療提供了理論基礎(chǔ)。 二、腺病毒介導(dǎo)的1抗胰蛋白酶基因轉(zhuǎn)移 大量臨床病例表明，1抗胰蛋白酶（1-AT）缺陷癥是高加索人肺部最普遍的致死遺傳性疾病之一。Rosenfeld等1構(gòu)建了含Ad主要晚期啟動子（MLP）和重組人1-AT基因的

5、復(fù)制缺陷型Ad載體（Ad-1AT），體內(nèi)外分別感染棉鼠呼吸道上皮細(xì)胞。Lemarchand等2將Ad-1-AT通過氣管內(nèi)滴注給小鼠后，在呼吸道上皮內(nèi)可檢測到人1AT mRNA，說明在肺組織內(nèi)可合成并貯存人1-AT。在鼠的呼吸道粘液中也可檢測到人1-AT（1.7M），但會逐漸減少，一周后完全檢測不到。通過靜脈灌注，24小時后，可檢測到平均13g/ml的1-AT，證實(shí)了重組Ad載體介導(dǎo)的體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移的可能性。最近，Kochanek等3利用缺失了整個病毒編碼基因的Ad載體，鼠尾靜脈注轉(zhuǎn)移19kb的人1-AT基因組，發(fā)現(xiàn)13周內(nèi)在鼠血清中可檢測到大約1g/ml的1-AT。 三、腺病毒

6、介導(dǎo)的低密度脂蛋白受體基因轉(zhuǎn)移 家族性高膽固醇血癥（familial hypercholesterolaemia,FH）是由低密度脂蛋白（lowdensity lipoprotein,LDL）受體缺乏導(dǎo)致而成，與高膽固醇和早期冠狀動脈疾病有關(guān)。最初在細(xì)胞培養(yǎng)中證實(shí)了Ad載體介導(dǎo)的LDL受體基因轉(zhuǎn)移，注射過載體的小鼠血漿中膽固醇水平明顯減少。據(jù)LDL受體的免疫熒光和-半乳糖苷酶染色等實(shí)驗(yàn)檢測，大約90%的肝細(xì)胞表達(dá)了Ad轉(zhuǎn)移的基因。Kozarsky等4在轉(zhuǎn)導(dǎo)的FH肝細(xì)胞中，Ad.CBhLDLR誘導(dǎo)的LDL受體蛋白至少比骨源性的要高20倍，將該載體注入一種叫新西蘭白兔（NZW）

7、中，發(fā)現(xiàn)NZW兔血清中膽固醇明顯減少。Kobayashik等5構(gòu)建極低密度脂蛋白（VLDL）受本的Ad載體的相關(guān)研究也已開始。他們用3×1019PFU的Ad mVLDLR靜脈注射LDLR（-/-）小鼠，結(jié)果表明，感染后49天，小鼠體內(nèi)總膽固醇水平減少50%。Ad載體介導(dǎo)的LDL和VLDL受體基因轉(zhuǎn)移方法是一種治療LDL或VLDL受體缺乏的有效方法，不足之處在于基因的表達(dá)量需加強(qiáng)。  四、腺病毒介導(dǎo)的囊性纖維變性轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（CFTR）基因轉(zhuǎn)移 Ad載體介導(dǎo)的囊性纖維變性（cystic fibrosis,CF）基因治療是Ad載體體內(nèi)基因治療最早的例子。一些

8、科學(xué)家做了大量的工作，先后克隆了CFTR基因，構(gòu)建了E1區(qū)缺失的Ad cFTR載體，在CF小鼠、棉鼠、非人靈長類動物，人呼吸道上皮細(xì)胞中，完成了該載體的安全性、毒性和生物學(xué)效應(yīng)的研究。 盡管CFTR的基因轉(zhuǎn)移率較低，但在感染細(xì)胞中，CFTR的基因表達(dá)要體內(nèi)外都能被檢測出來。動物模型研究和臨床試驗(yàn)表明，CFTR基因表達(dá)是短暫是，并且隨著宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)的發(fā)展而終結(jié)。這促使人們改進(jìn)缺失E1區(qū)的Ad載體，試圖發(fā)展既缺失E2A區(qū)，又缺失部分E4區(qū)的新一代載體。最近，F(xiàn)isher6等開始研究缺失所有病毒編碼序列的Ad載體，并且開始應(yīng)用該載體把CFTR表達(dá)盒轉(zhuǎn)移到人氣管上皮細(xì)胞內(nèi)。 五、腺病毒介

9、導(dǎo)的杜氏肌肉營養(yǎng)不良癥（DMD）基因轉(zhuǎn)移 DMD是由于功能性營養(yǎng)蛋白缺乏而引起的致死性遺傳病。DMD的基因治療就是通過質(zhì)粒表達(dá)載體和重組病毒（如逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒等）載體，將功能性營養(yǎng)蛋白的cDNA導(dǎo)入肌肉細(xì)胞內(nèi)。Hauser等7在轉(zhuǎn)基因mdx小鼠中，分別轉(zhuǎn)移6.3kb的一段基因和cDNA全基因，證實(shí)可以部分或全部糾正小鼠的病理癥狀，小鼠的肌肉力量可以恢復(fù)。1993年，Vincent等8最早通過缺失E1區(qū)Ad載體的介導(dǎo)，將微小基因轉(zhuǎn)移到新生的小鼠肌肉中，觀察到DMD癥狀明顯減弱。1996年，Acsadi等在利用mdx小鼠進(jìn)行的腺病毒介導(dǎo)的營養(yǎng)不良微小的基因轉(zhuǎn)移中也證實(shí)了這一點(diǎn)。最近，Kocha

10、nek等10利用一種微小腺病毒載體，把全長DMD cDNA轉(zhuǎn)運(yùn)到mdx小鼠的肌肉中也取得了很好的效果。 六、腺病毒介導(dǎo)的因子基因轉(zhuǎn)移 血友病B（haemophilia B）是一種血液凝血因子IX（F IX）缺乏綜合癥?，F(xiàn)已通過不同的基因轉(zhuǎn)移方法在體內(nèi)，外作了大量的基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。在動物模型中，把F iX基因轉(zhuǎn)移到成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成肌細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞中，但表達(dá)水平較低。 利用Ad體內(nèi)基因治療血友病B正在取代逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的方法。Smithtag等11通過AvIH9B載體把呼吸道合胞病毒（RSV）啟動子啟動的F iX cDNA表達(dá)盒

11、注射小鼠尾靜脈中，結(jié)果可在肝得到有將效轉(zhuǎn)導(dǎo)，9周后，其表達(dá)水平才會慢慢減弱。Dai等12用Ad載體把帶有巨細(xì)胞病毒（CMV）增強(qiáng)啟動子的FIX表達(dá)盒肌肉注射到裸鼠體內(nèi)，血漿中可得到人F iX的高水平表達(dá)（15g/ml），持續(xù)時間1年。如果載體在小鼠骨有某種免疫活性，血漿F iX的表達(dá)時間會縮短，表達(dá)量會降低，在血友病犬模型中也證實(shí)了這些結(jié)果。 七、腺病毒介導(dǎo)的因子基因轉(zhuǎn)移 血友病A（haemophilia A）是由因子正?；蛉毕菀鸬模饕砻鏋椴蛔灾鞯某鲅l(fā)癥。早期，采用細(xì)胞移植、反轉(zhuǎn)錄病毒載體等方法在動物模型中僅能得到F低水平表達(dá)和分泌?，F(xiàn)在采用缺失E1區(qū)的

12、Ad載體，轉(zhuǎn)運(yùn)B區(qū)缺失的F（BOD f）的cDNA，感染1周后，在HepG2細(xì)胞系和C57BL/6小鼠中，F(xiàn)得到了30793ng/ml的高水平表達(dá)。 AvlALApH81是一種小鼠白蛋白啟動子，由AvlALH91載體帶有一個Apo-A1內(nèi)含子和一個HNF3/eG-Tf連接位點(diǎn)改建而成。Connelly等13把該載體注射到小鼠體內(nèi)后，能顯著增加血漿中BOD-F含量，可達(dá)到1046 163ng/ml。BOD-F主要在肝中表達(dá)，其分泌時間可維持4周左右。據(jù)報(bào)道，通過改進(jìn)Ad載體，在血友病小鼠，BOD-F的表達(dá)時間可持續(xù)13周以上。最近，Alemany14等第一次構(gòu)建F微小腺病毒載

13、體，用2.5kb的人白蛋白基因片段作啟動子，轉(zhuǎn)移全基因組的人FcDNA表達(dá)盒，將該載體注射到血友病鼠后，血漿中可產(chǎn)生300ng/ml的F表達(dá)量，并且在40ng/ml的水平上可維持6周。 八、腺病毒介導(dǎo)的其它基因轉(zhuǎn)移 基因治療適合于治療一些單基因遺傳疾病。鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶（OTC）缺乏癥和苯丙酮酸尿癥（PKU）是另外兩類Ad介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法病例。OTC缺乏癥是一種伴X染色體的氨基酸缺乏疾病，能影響尿素的生物合成而導(dǎo)致尿素癥。Morsy等15在OTC缺乏癥小鼠體內(nèi)小外活體試驗(yàn)，證實(shí)了Ad介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法能引起OTC的有效表達(dá)，這項(xiàng)研究也給OTC缺乏癥病人的治療帶來了曙光。PKU是由于肝內(nèi)苯

14、丙氨酸脫氨酶（PAH）缺乏而造成的先天性代謝紊亂，可導(dǎo)致個人嚴(yán)重的精神障礙。含人PAH cDNA基因的重組Ad載體已經(jīng)構(gòu)建，并且導(dǎo)入到PAH缺乏的小鼠中。這些動物血中苯丙氨酸過多的癥狀完全可以在1周內(nèi)恢復(fù)正常。遺憾之點(diǎn)是這種治療的效果不能持續(xù)太久。參考文獻(xiàn) Rosenfeld MM,et al.Science,1991;252:431 Lemarchand P,et al.Proc Natl Acad Sci USA,1992;89:6482 Kochanek,et al.Keystone

15、60;Gene Therapy Smyposium,1997 Kozarsky KF,et al.J Biol Chem,1994;269:13695 Kobayashi K,et al.J Biol Chem,1996;271:6852 Fisher KJ,et al,Virology,1996;217:11 Hauser X,et al.Am J Human Gen,1994;55:A47 Vircent N,et al.1993;5:130 Acsadi G,et al.Huan Gene Ther ,1996;7:129 Kochanek S,et al.Proc Natl Acad Sci USA,1996;93:5731 Smith T,et al.Nat Genet,1993;5: