大鼠STAT3信號(hào)分子對(duì)苦參堿對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的腎小球硬化

1、大鼠STAT3信號(hào)分子對(duì)苦參堿對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的腎小球硬化         08-09-08 16:49:00     編輯：Studa_hasgo122【關(guān)鍵字】腎小球【摘要】  目的： 動(dòng)態(tài)觀察苦參堿對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的腎小球硬化大鼠STAT3分子及其抑制分子PIAS3變化的影響，探討苦參堿在腎臟纖維化發(fā)病進(jìn)程中的作用及其機(jī)制. 方法： 45只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及試驗(yàn)組各15只，用單側(cè)腎切除加1 wk后尾靜脈注射阿霉素(5 mg/kg)的方法建

2、立腎小球硬化大鼠模型，為模型組；只行手術(shù)不注射阿霉素為對(duì)照組；造模后即予苦參堿100 mg/(kg·d)灌胃干預(yù)治療為試驗(yàn)組. 于2,4,6 wk分批處死每組各5只大鼠，采用免疫組化檢測(cè)腎臟STAT3、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1(TGF1)表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)觀察STAT3，PIAS3 mRNA表達(dá). 結(jié)果： 第6 wk時(shí)，模型組腎小球硬化指數(shù)（71.7±11.2）%高于對(duì)照組（17.6±2.5）%及試驗(yàn)組（44.9±8.9）% (P<0.01)；模型組TGF1在腎皮質(zhì)表達(dá)（2.196±0.394）%多于對(duì)照組（0.017±0.00

3、5）%及試驗(yàn)組（0.750±0.089）% (P<0.01)，并呈逐漸升高趨勢(shì)；模型組STAT3蛋白（19.58±2.66）%表達(dá)較對(duì)照組（7.64±1.25）%增高(P<0.01),試驗(yàn)組（14.90±1.66）%較模型組（19.58±2.66）%降低(P<0.01)；模型組STAT3 mRNA表達(dá)為5.06±0.26倍于對(duì)照組，高于試驗(yàn)組的3.49±0.39倍(P<0.01)，而PIAS3 mRNA呈相反趨勢(shì). 結(jié)論： 苦參堿有抑制腎小球硬化進(jìn)展的作用，其作用機(jī)制可能為下調(diào)JAK/STAT通路信號(hào)

4、分子STAT3及上調(diào)其抑制分子PIAS3的表達(dá)，降低TGF1的蛋白水平，從而延緩腎小球硬化進(jìn)程. 【關(guān)鍵詞】  苦參堿;腎小球硬化癥，病灶性;JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;STAT3信號(hào)分子;大鼠;多柔比星【Abstract】 AIM: To dynamically observe the effect of matrine on STAT3 and PIAS3 in adriamycininduced glomerulosclerosis in rats and explore its protective mechanisms. METHODS: Fourtyfive male

5、Wistar rats were randomly divided into 3 groups: model group, control group and experimental group(n=15 in each group). Adriamycin nephropathy was induced by complete excision of left kidney and a single tail intravenous injection of adriamycin（5 mg/kg）; control group received only the operation but

6、 without intravenous injection of adriamycin; experimental group were treated with matrine 100 mg/kg·d after accomplishment of adriamycin nephropathy. Five rats in each group were sacrificed every 2 weeks. A semiquantitative score was used to evaluate the degree of glomerular lesions. Immunohis

7、tochemistry was employed to examine the expression of STAT3 and transforming growth factor1 (TGF1). Finally,the expressions of STAT3 and PIAS3 mRNA were measured by realtime quantitative RTPCR. RESULTS：   Glomerulosclerosis index (GSI) in model group increased progressively（71.7±11.2）

8、%, and was higher than that of control group（17.6±2.5）% and experimental group（44.9±8.9）% at week 6; Immunohistochemical staining indicated that STAT3 and TGF1 expressions gradually increased in model groupTGF1（2.196±0.394）%; STAT3(19.58±2.66) and were higher than those in contro

9、l groupTGF1 （0.017±0.005）%; STAT3(7.64±1.25)% and experimental group TGF1(10.750±0.089)%; STAT3(14.90±1.66)%at week 6. The  expression of STAT3 gene in model group was increased compared with the control group (5.06±0.26 times higher than that of control group) and expe

10、rimental group (3.49±0.39 times higher than that of experimental group), and PIAS3 mRNA expression change displayed an opposite tendency. CONCLUSION: Matrine has a depressive role in the development of glomerular sclerosis in adriamycininduced nephropathy rats. Its mechanism is considered to be

11、 related to intervention of the pathway of signal conduction of JAK/STAT: Upregulation of PIAS3, downregulation of STAT3, and decrease of TGF1 protein.【Keywords】 matrine； glomerulosclerosis, focal； pathway of signal transduction of JAK/STAT； STAT3 signaling molecule；rats， doxorubicin0  引言 

12、   近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿（matrine）具有抑制成纖維細(xì)胞及膠原合成，防治實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化的作用. 但其對(duì)腎小球硬化作用及機(jī)制目前尚未完全明晰；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)作為JAK的靶蛋白，是存在于細(xì)胞胞質(zhì)中的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，STAT3是該家族的重要成員. 研究表明STAT3途徑不僅是參與腎臟疾病發(fā)病過(guò)程中一個(gè)很重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而且與多種增生性腎小球疾病的發(fā)生有關(guān)1-2. 本研究通過(guò)免疫組化及實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法，觀察阿霉素誘導(dǎo)的腎小球硬化大鼠模型及苦參堿干預(yù)治療后腎組織STAT3、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1(TGF1)蛋白表達(dá)和STAT3，PAS3 mRN

13、A表達(dá)，探討苦參堿在腎小球硬化治療作用及機(jī)制，為臨床防治腎小球硬化尋找新的途徑.1  材料和方法1.1  材料  純系健康Wistar大鼠45只，雄性，體質(zhì)量(200±20) g，89周齡，普通級(jí)，蘭州大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心提供（醫(yī)動(dòng)字第07371號(hào)）. 苦參堿(寧夏紫荊花藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20070329)；阿霉素（深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司產(chǎn)品, 批號(hào):0703E2）；Trizol（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；Taq DNA聚合酶、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Oligo d(T)18,dNTP，DNA Marker,SYBR Premix Ex TaqT

14、M（大連TaKaRa生物工程公司）；DEPC(上海實(shí)生細(xì)胞生物技術(shù)有限公司,為進(jìn)口分裝分析純)；STAT3,PIAS3,內(nèi)參照GAPDH的引物由大連TaKaRa生物工程公司合成；STAT3,TGF1兔抗大鼠mAb(武漢博士德生物工程公司)；免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、羊抗鼠FITCIgG二抗作液（北京中杉金橋生物工程公司）.1.2  方法1.2.1  模型制備及分組  大鼠給予普通飼料、自由飲水適應(yīng)性飼養(yǎng)1 wk，隨機(jī)分為3組： 對(duì)照組、模型組及試驗(yàn)組，每組各15只. 造模方法參照文獻(xiàn)3采用單側(cè)腎切除加單次阿霉素（5 mg/kg）尾靜脈注射制作大鼠腎小球硬化

15、模型；對(duì)照組行假手術(shù),尾靜脈注射等量蒸餾水. 從第1次注射阿霉素后開(kāi)始干預(yù)治療, 試驗(yàn)組給予苦參堿100 mg/(kg·d)灌胃，模型組和對(duì)照組每日給予等容積蒸餾水灌胃. 實(shí)驗(yàn)周期共6 wk.1.2.2  標(biāo)本制備  于實(shí)驗(yàn)第2,4,6 wk分批處死大鼠每組5只，迅速摘除左腎，將1/2腎組織置40 g/L多聚甲醛固定，脫水、石蠟包埋，制備腎組織HE，Masson染色和免疫組化標(biāo)本，另1/2腎組織放入DEPC處理的凍存管，液氮保存，留待熒光定量PCR檢測(cè).1.2.3  指標(biāo)檢測(cè)  （1）腎組織病理檢查： 腎組織病變程度采用Raij4半定量積分法評(píng)

16、估腎小球硬化程度，每張切片觀察40個(gè)腎小球，然后計(jì)算腎小球硬化指數(shù)(glomerulosclerosis index,GSI). 每張切片腎小球平均硬化指數(shù)計(jì)算公式為：(1×N1+2×N2+3×N3+4×N4)/40×100%，式中N1代表1級(jí)損害腎小球個(gè)數(shù)，N4為4級(jí)損害腎小球個(gè)數(shù). （2）腎組織STAT3，TGF1蛋白表達(dá)的檢測(cè)： 采用免疫組化SP法檢測(cè),將石蠟包埋的腎組織標(biāo)本,4 m厚切片，方法與步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作，一抗STAT3，TGF1，稀釋倍數(shù)1100，并設(shè)陰性對(duì)照，以PBS代替一抗,DAB顯色，蘇木素復(fù)染，以光鏡下細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃

17、色顆粒為陽(yáng)性信號(hào). 結(jié)果采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，每張切片按順序選10個(gè)視野，按陽(yáng)性染色面積所占視野百分比進(jìn)行半定量評(píng)分后取均值. （3）STAT3，PIAS3 mRNA表達(dá)的檢測(cè)：引物序列設(shè)計(jì)：內(nèi)參照GAPDH正義引物、反義引物序列分別為5GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG3，5ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA3,產(chǎn)物為143 bp；STAT3 正義引物、反義引物序列分別為5CACAACCTGCGAAGAATCAAG3，5GCTGCTTCTCCGTCACTAC3,產(chǎn)物為139 bp；PIAS3正義引物、反義引物序列分別為5GTCGTCCAATCAACATCAC

18、AC3，5CTCACCAGGTACACAGACAAG3,產(chǎn)物為118 bp. 經(jīng)Blast分析引物與大鼠其他基因無(wú)同源序列. Trizol法提取細(xì)胞總RNA,取2 g總RNA標(biāo)本,采用兩步法進(jìn)行PCR： 第一步,利用反轉(zhuǎn)錄酶PrimeScriptTM RTase將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體積為20 L，反應(yīng)體系如下: PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I，Oligo dT Primer，Random Primers各1 L，5×PrimeScriptTM Buffer 4 L, RNase Free dH2O 11 L，反應(yīng)條件: 42 15 min, 85 5 s；第二步，Real Time PCR反應(yīng)：在RotorGene 3000 熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(Corbett Research公司)上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)體積為25 L，反應(yīng)體系如下: SYBRPremix Ex TaqTM（2×）12.5 L，PCR Forward Primer，PCR Reverse Primer各0.5 L，RT反應(yīng)液2 L，