壯骨鎮(zhèn)痛膠囊對乳腺癌細胞遷移運動信號通路關(guān)鍵蛋白p-JNK和Rac-1

1、壯骨鎮(zhèn)痛膠囊對乳腺癌細胞遷移運動信號通路關(guān)鍵蛋白p-JNK和Rac-1    2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,湖南省中醫(yī)五官科重點學(xué)科,湖南 長沙 410007) 摘 要:目的:研究壯骨鎮(zhèn)痛膠囊對高轉(zhuǎn)移人乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移及其運動信號通路關(guān)鍵蛋白p-JNK和Rac-1表達水平的影響。方法:采用劃痕法測定高(5.0%)、中(1.25%)、低(0.63%)不同濃度壯骨鎮(zhèn)痛膠囊含藥血漿對MDA-MB-231細胞遷移的影響,采用免疫細胞化學(xué)法檢測不同濃度壯骨鎮(zhèn)痛膠囊對MDA-MB-231細胞p-JNK和Rac-1蛋白表達水平的影響。結(jié)果:高、

2、中濃度壯骨鎮(zhèn)痛膠囊含藥血漿顯著抑制了乳腺癌MDA-MB-231細胞的遷移和p-JNK、Rac-1蛋白表達,低濃度血漿對細胞遷移和p-JNK、Rac-1蛋白表達無顯著影響。結(jié)論:壯骨鎮(zhèn)痛膠囊可通過改變運動信號通路關(guān)鍵蛋白p-JNK和Rac-1的表達來抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的遷移,且該作用與濃度密切相關(guān)。 關(guān)鍵詞:壯骨鎮(zhèn)痛膠囊;乳腺癌細胞;遷移;p-JNK;Rac-1?The Effects of Zhuanggu Zhentong Capsules on the Expressions of Key Proteins in Migrating-Related Signaling Pa

3、thway Such as p-JNK and Rac-1of Breast Cancer Cell Lines in Vitro LIU Jing?hong1, HE Ying?chun2, CAO Jian?xiong1,WANG Xian?wen1,TIAN Dao?fa2, ZHUO Yao1 (1.The First Affiliated Hospital, Changsha 410007, Hunan, China; 2.College of integrative medicine, Traditional Chinese Medical University of Hunan,

4、 Changsha 410007, Hunan,China) Abstract:?Objective:?To study the impacts of Zhuanggu Zhentong Capsules(ZZC) on the cell migration and the expressions of key proteins in migrating-related signaling pathway such as p-JNK and Rac-1 of breast cancer cell lines MDA - MB -231 in vitro. Methods:The impacts

5、 of different doses of ZZC contained plasma (5.0%,1.25% and 0.63%) on the migrations of MDA - MB -231 cells in intro were measured by wound-healing assay. These proteins levels were assayed by immunocytochemistry protocol. Results: The cell migration and the expressive levels of p-JNK and Rac-1prote

6、ins in MDA - MB -231 cells treated with 5% ZZC contained plasma and 1.25% ZZC contained plasma were inhibited significantly. However, there are no obvious inhibitions on the cell migrations and p-JNK and Rac-1 proteins expressions in MDA - MB -231 cells treated with 0.63% ZZC contained plasma. Concl

7、usion: ZZC contained plasma can inhibit the migrations of MDA - MB -231 cells in dose - dependent manner by changing the expressions of key proteins in migrating-related signaling pathway such as p-JNK and Rac-1 proteins.? Key words:Zhuanggu Zhentong capsules;breast cancer cell;p-JNK;Rac-1 FQ(8。25,X

8、-W 收稿日期:2009-11-23 基金項目:湖南省科技廳資助項目(2007TP4021,湘財教指2009-42);湖南省教育廳資助項目(08C637,09C724) 作者簡介:柳景紅(1952-),男,湖南臨湘人,教授,碩士研究生導(dǎo)師,學(xué)士,研究方向:惡性腫瘤的中西醫(yī)結(jié)合防治。 通訊作者:曹建雄(1963-),男,湖南湘鄉(xiāng)人,教授,碩士研究生導(dǎo)師,博士,研究方向:惡性腫瘤的中西醫(yī)結(jié)合防治。 乳腺癌是最常見嚴重危害女性健康的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率目前正逐年增高。自20世紀70年代,原為乳腺癌低發(fā)區(qū)的亞洲國家發(fā)病率逐年攀升,在我國特別是經(jīng)濟發(fā)達地區(qū),乳腺癌已有成為威脅女性健康首要惡性腫瘤的趨勢

9、。乳腺癌的擴散轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因。西醫(yī)主要采取手術(shù)、放、化療、內(nèi)照射治療、骨吸收抑制劑、內(nèi)分泌等治療,近期有一定療效,但是副反應(yīng)大,遠期療效不佳。中醫(yī)藥作為治療骨轉(zhuǎn)移瘤手段之一有較好療效,甚或滿意療效,并且副反應(yīng)少。壯骨鎮(zhèn)痛膠囊方在我校附屬醫(yī)院腫瘤科已應(yīng)用十余年,5年前已由醫(yī)院制成了院內(nèi)自制藥使用至今,療效確切,特別是對晚期乳腺癌的骨轉(zhuǎn)移效果顯著,取得了良好的社會效益和經(jīng)濟效益1-4。前期試驗結(jié)果顯示,高、中濃度壯骨鎮(zhèn)痛膠囊可顯著抑制高轉(zhuǎn)移人乳腺癌MDA-MB-231細胞的體外遷移,細胞遷移是一種復(fù)雜的細胞行為,需要通過多個信號分子發(fā)揮作用。本研究擬在通過檢測壯骨鎮(zhèn)痛膠囊干預(yù)前后的

10、MDA-MB-231細胞遷移運動信號通路關(guān)鍵蛋白p-JNK和Rac-1表達水平,初步探討其影響MDA-MB-231細胞遷移運動的分子機制。 1 材料與方法 1.1 材料 1.1.1 動物和細胞株SPF級SD大鼠由河南鄭州大學(xué)實驗動物中心提供(SCXK(豫)2005-0001)。乳腺癌可傳代細胞株MDA-MB-231購自湘雅醫(yī)學(xué)院細胞中心。 1.1.2 主要試劑及藥物RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶-EDTA、D-Hanks液、鼠抗人p-JNK抗體、鼠抗人rac-1抗體購自Santa cruz公司, SABC染色試劑盒、DAB顯色劑購自北京中杉生物有限公司,其他試劑為國產(chǎn)分析純。壯骨鎮(zhèn)痛

11、膠囊由湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制備,藥物組成:骨碎補、仙靈脾、補骨脂、桑寄生、三七粉、莪術(shù)、延胡索、威靈仙、穿山甲、制地龍、全蝎、蜈蚣、生黃芪等組成。        1.2 方法 1.2.1 細胞培養(yǎng) 參考文獻5進行。復(fù)蘇后接種于含15%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液中,在37、5%CO?2條件下培養(yǎng)。 1.2.2 壯骨鎮(zhèn)痛膠囊藥物血漿的制備選用正常SD大鼠30只,隨機分為藥物組和生理鹽水對照組,每組15只,自由飲水,攝食,保持自然光照飼養(yǎng)1周后,藥物組灌胃壯骨鎮(zhèn)痛膠囊,按人與動物用藥劑量換算公式大鼠劑量(g/

12、kg)=6.25×成人劑量(g)/成人體重(60kg)計算出一般給藥量,該實驗中的給藥量為一般用量的3倍,對照組用等體積生理鹽水灌胃。每天灌胃1次,連續(xù)7天;最后1天灌胃2次,間隔1h,末次給藥后1h頸動脈采血,離心,取上清(即藥物血漿),同組動物血漿混勻,經(jīng)0.45m過濾器過濾除菌,-20保存?zhèn)溆谩?1.2.3 細胞遷移實驗參照文獻6進行。收獲對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞,將細胞密度調(diào)整為5×105個/mL,接種于6孔板中,每孔3mL,待其貼壁后融合度約為85%90%時,改為無血清RPIM-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h后,吸棄培養(yǎng)液,用200 L的tip頭在孔內(nèi)側(cè)

13、底面的中部從上向下均勻用力劃一條寬度相等的細胞刮除帶,并在底外面以藍色記號筆劃3條與刮出帶垂直的線,換以高(5.00%)、中(1.25%)、低(0.63%)不同濃度含藥血漿培養(yǎng)液,并且各藥物組的培養(yǎng)液中分別加入正常大鼠血漿,使其最終血漿濃度均為5.00%,同時以5.00%正常大鼠血漿培養(yǎng)液作為對照組,每組設(shè)5個復(fù)孔,以劃帶時間為0 h,在倒置顯微鏡下分別觀察0 h、24 h劃帶的寬度,每孔取3處劃帶寬度值求平均值,再求出每組24h 的細胞實際遷移距離平均值,比較各組細胞的遷移抑制率。? 遷徙抑制率=(1一實驗組遷徙距離/對照組遷徙距離)×100% 1.2.4 免疫細胞化學(xué)法將細胞按2

14、×104/mL接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)(1mL/孔),孔內(nèi)預(yù)置無菌圓蓋玻片。待細胞貼壁后,改為無血清RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h,吸棄培養(yǎng)液,分別加入不同濃度藥物血漿培養(yǎng)液,處理24h后,吸棄培養(yǎng)液,D-Hanks液洗3次,80%的冰丙酮固定1520min,棄丙酮,待玻片自然干燥后,參照文獻7采用SABC法檢測各蛋白水平。采用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)攝像和進行圖像分析,每個細胞玻片共檢測5個陽性視野和5個陰性視野,取平均值,每組6次重復(fù)。以陽性視野和陰性視野灰度值的比值表示蛋白表達水平的高低,比值越高,蛋白表達水平越低。 1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS

15、 16.0軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準差(±s)表示,多組比較采用單因素方差分析,并進行組間的多重比較,方差齊,采用LSD法;方差不齊,則采用Tamhanes T2法比較。顯著性檢驗取雙側(cè)界值點,P2 結(jié)果與分析 2.1 不同濃度壯骨鎮(zhèn)痛膠囊含藥血漿對MDA-MB-231細胞遷移的影響? 與對照組比較,高、中濃度壯骨鎮(zhèn)痛膠囊含藥血漿組乳腺癌細胞實際遷移距離明顯減短(?P?不同濃度壯骨鎮(zhèn)痛膠囊含藥血漿對MDA-MB-231細胞遷移 2.2 不同濃度壯骨鎮(zhèn)痛膠囊含藥血漿對MDA-MB-231細胞 p-JNK和Rac-1蛋白活性的影響? 與對照組比較,高、

16、中濃度壯骨鎮(zhèn)痛膠囊含藥血漿組p-JNK和Rac-1蛋白水平顯著降低(?P?<0.01),低濃度組p-JNK和Rac-1蛋白表達水平無明顯變化,并且p-JNK和Rac-1蛋白表達水平在高、中濃度壯骨鎮(zhèn)痛膠囊含藥血漿組與低濃度組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P3 討 論? 細胞遷徙在癌癥、動脈粥樣硬化等疾病中多見,阻止細胞遷移能延緩甚至抑制疾病的發(fā)展。國內(nèi)外學(xué)者對各種腫瘤細胞的形態(tài)學(xué)進行了觀察8-10,認為腫瘤細胞的運動性與轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。細胞遷移過程的每一步都需要有一系列的生化級聯(lián)反應(yīng)如細胞極性、微絲和微管的解聚和聚合 表1壯骨鎮(zhèn)痛膠囊對MDA-MB-231細胞p-JNK和R

17、ac-1蛋白的影響(n=6,±s) 組別含藥血漿濃度(%)p-JNK灰度值比值Rac-1灰度值比值 對照組00.622±0.0370.666±0.044 高濃度組5.000.701±0.022*0.753±0.036* 中濃度組1.250.727±0.019*0.719±0.059?* 低濃度組0.630.652±0.0220.655±0.028 統(tǒng)計量?F?值-20.2476.768 ?P? -0.0000.002 注:與對照組比較*P<0.05,*P<0.01;與高濃度組比較P<0.

18、01;與中濃度組比較P<0.05,P動態(tài)過程的調(diào)控、遷移過程中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在時間和空間上的變化等11細胞遷移機制。腫瘤細胞的絲狀偽足能夠使癌細胞牢固地固定于器官表面,并沿器官表面移動及沿細胞之間的間隙向器官內(nèi)移動12。侵襲部分癌細胞絲狀偽足與器官表面突起部分連接或與靶細胞直接黏附,還有部分癌細胞絲狀偽足吞噬靶細胞使癌細胞的遷移能力增加導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移。本實驗結(jié)果顯示,高、中濃度壯骨鎮(zhèn)痛膠囊對乳腺癌MDA-MB-231細胞的體外遷移具有顯著的抑制效應(yīng),并且抑制了細胞偽足生長,證實了乳腺癌細胞的生長形態(tài)及形態(tài)學(xué)改變與它自身的生長狀態(tài)、轉(zhuǎn)移都有密切關(guān)系,而低濃度壯骨鎮(zhèn)痛膠囊對乳腺癌MDA-MB-231

19、細胞遷移無顯著影響,表明該效應(yīng)與濃度密切相關(guān)。?        Rac-1,Ras相關(guān)的C3肉毒桿菌毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1),是Rho(Ras homologous)家族的GTPases中研究的較多的因子,其功能包括:對細胞骨架的作用,如在成纖維細胞肌動蛋白骨架形成中,導(dǎo)致細胞偽足和膜褶皺樣運動;對細胞黏附的作用,并且通過影響RhoA的活性,間接影響細胞胞體的收縮;在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用13,誘導(dǎo)integrin重新募集于細胞頭部,從而提供細

20、胞遷移的正反饋調(diào)節(jié)。也可參與調(diào)控上皮腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的鈣黏蛋白依賴性的細胞間黏附,并且與細胞移行的關(guān)系密切14,如Rac-1能在內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞遷移中也發(fā)揮重要作用15。本實驗中,高、中濃度壯骨鎮(zhèn)痛膠囊顯著抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的體外遷移,相應(yīng)的,這兩組細胞中rac-1表達水平降低,筆者的研究結(jié)果與前面報道一致。? JNK(stressactivated protein kinases,SAPK,應(yīng)激活化的蛋白激酶),絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)級聯(lián)系統(tǒng)是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。多種胞外

21、刺激因子可激活以JNK為中心的JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,一些抑癌基因編碼產(chǎn)物抑制 JNK的功能或活化。JNK活化以后,可以通過磷酸化作用調(diào)控多種底物的功能活性。幾種控制細胞遷移的信號通路包括Rac, FAK和Src與JNK信號通路密切相關(guān),并且JNK信號通路是細胞遷移過程中所必需的16-17,用其抑制劑SP600125抑制JNK活化可抑制細胞的遷移18。? 綜上所述,壯骨鎮(zhèn)痛膠囊抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移的作用機制之一是通過影響p-JNK和Rac-1蛋白表達,改變JNKRAC1信號傳導(dǎo)通路中的信號,導(dǎo)致偽足和絲狀偽足生成減少,進而使乳腺癌MDA-MB-231細胞的遷移能力降低。 參考文獻

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