外植體的選擇和滅菌

1、復(fù)習(xí)題：培養(yǎng)基的成分包括哪幾類？各有何作用？在培養(yǎng)基成分中什么決定著外植體發(fā)育方向？抗生素的作用是什么？配制MS培養(yǎng)基時(shí)，瓊脂和蔗糖的加入量一般為多少？ 第一節(jié)第一節(jié) 外植體的選擇外植體的選擇 第二節(jié)第二節(jié) 外植體的滅菌方法外植體的滅菌方法 第三節(jié)第三節(jié) 污染原因和預(yù)防措施污染原因和預(yù)防措施 第三章 外植體的選擇和滅菌第一節(jié)第一節(jié) 外植體的選擇外植體的選擇 1 外植體部位外植體部位2 取材季節(jié)取材季節(jié)3 器官的生理狀態(tài)和發(fā)育年齡器官的生理狀態(tài)和發(fā)育年齡4 選取適宜的大小選取適宜的大小1 外植體部位 植物體的各個(gè)部位，如莖尖、莖段、皮層及維管組織、髓細(xì)胞、表皮、塊莖的貯藏薄壁細(xì)胞、花瓣、根、葉、

2、子葉、鱗莖、胚珠和花藥等。 不同種類的植物以及同一植物的不同器官對(duì)誘導(dǎo)條件反應(yīng)不一致的。 大多數(shù)植物來(lái)說(shuō)，莖尖是較好的部位，其形態(tài)已基本建成，生長(zhǎng)速度快，遺傳性穩(wěn)定，是獲得無(wú)病毒苗的重要途徑。外植體選擇的原則 培養(yǎng)材料的來(lái)源是否保證是否會(huì)引起不良變異。 葉片的來(lái)源最有保證，許多植物的組織培養(yǎng)以葉片為外植體。 對(duì)一些培養(yǎng)較困難的植物，可以通過(guò)子葉或下胚軸來(lái)建立其組織培養(yǎng)再生體系。2 2 取材季節(jié)取材季節(jié) p在生長(zhǎng)開(kāi)始的季節(jié)取材，若在在生長(zhǎng)開(kāi)始的季節(jié)取材，若在生長(zhǎng)末期或已進(jìn)入休生長(zhǎng)末期或已進(jìn)入休眠眠時(shí)取樣，則外植體可能對(duì)誘導(dǎo)反應(yīng)遲鈍或無(wú)反應(yīng)。時(shí)取樣，則外植體可能對(duì)誘導(dǎo)反應(yīng)遲鈍或無(wú)反應(yīng)。3 器官的生

3、理狀態(tài)和發(fā)育年齡 植物上部器官的生長(zhǎng)時(shí)間雖短，其生理年齡卻較老，更接近發(fā)育上的成熟，越容易形成花器官。而越向基部，則生理年齡越小。 下部組織越易形成營(yíng)養(yǎng)器官，上部組織易形成花器官。 通常年幼組織比年老組織有較高的形態(tài)發(fā)生能力，容易培養(yǎng)，有較大的再生能力。4 選取適宜的大小選取適宜的大小 n 材料太大易污染；材料太小，難于成活。材料太大易污染；材料太小，難于成活。n 0.5cm-1.0cm。n 如果是胚胎培養(yǎng)或脫毒培養(yǎng)的材料，則應(yīng)更小如果是胚胎培養(yǎng)或脫毒培養(yǎng)的材料，則應(yīng)更小第三章 外植體的選擇和滅菌 第一節(jié) 外植體的選擇 第二節(jié) 外植體的滅菌方法 第三節(jié) 污染原因和預(yù)防措施 1 外植體的滅菌方法

4、外植體的滅菌方法預(yù)處理：預(yù)處理：先對(duì)植物組織修整，去掉不需要的部分，流水先對(duì)植物組織修整，去掉不需要的部分，流水中沖洗干凈。中沖洗干凈。預(yù)處理的植物材料的滅菌預(yù)處理的植物材料的滅菌： 原則：原則：充分滅菌，但不傷外植體充分滅菌，但不傷外植體不同的外植體，滅菌的要求也不一樣不同的外植體，滅菌的要求也不一樣2 常用滅菌藥劑的使用和效果常用滅菌藥劑的使用和效果滅菌劑滅菌劑使用濃度使用濃度（%）清除的難易清除的難易消毒時(shí)間消毒時(shí)間（min）效效 果果次氯酸鈉次氯酸鈉10-30易易530很好很好次氯酸鈣次氯酸鈣2易易530很好很好漂漂 白白 粉粉飽和濃度飽和濃度易易530很好很好氯氯 化化 汞汞0.01

5、1較難較難210最好最好酒酒 精精7075易易0.22好好過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫1012最易最易515好好溴溴 水水12易易210很好很好硝硝 酸酸 銀銀1較難較難530好好抗抗 菌菌 素素450mg/L中中3060較好較好常規(guī)的表面滅菌處理方法常規(guī)的表面滅菌處理方法把材料放進(jìn)把材料放進(jìn)70%的酒精中約的酒精中約30s。用用0.1%的升汞（的升汞（HgCl2）中浸泡）中浸泡5-10min。 或用或用10%的漂白粉上清液中浸的漂白粉上清液中浸10min 15min。無(wú)菌蒸餾水沖洗無(wú)菌蒸餾水沖洗35次。次。滅菌時(shí)進(jìn)行攪動(dòng)，使植物材料與滅菌劑有良好滅菌時(shí)進(jìn)行攪動(dòng)，使植物材料與滅菌劑有良好 的接觸。的接觸。

6、在滅菌劑里滴入數(shù)滴在滅菌劑里滴入數(shù)滴0.1%的的Tween20（吐溫）（吐溫） 或或Tween80濕潤(rùn)劑，則滅菌效果更好。濕潤(rùn)劑，則滅菌效果更好。 1）表面消毒劑對(duì)植物組織是有害的，應(yīng)正確選擇消毒劑的濃度和）表面消毒劑對(duì)植物組織是有害的，應(yīng)正確選擇消毒劑的濃度和處理時(shí)間，以減少組織的死亡。處理時(shí)間，以減少組織的死亡。2）與消毒劑接觸過(guò)的切面在轉(zhuǎn)移到無(wú)菌基質(zhì)前需將其切除，因?yàn)椋┡c消毒劑接觸過(guò)的切面在轉(zhuǎn)移到無(wú)菌基質(zhì)前需將其切除，因?yàn)橄緞?huì)阻礙植物細(xì)胞對(duì)基質(zhì)中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。消毒劑會(huì)阻礙植物細(xì)胞對(duì)基質(zhì)中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。3）若外植體污染嚴(yán)重則應(yīng)先用流水漂洗）若外植體污染嚴(yán)重則應(yīng)先用流水漂洗1小時(shí)以上

7、或先種子培養(yǎng)得小時(shí)以上或先種子培養(yǎng)得到無(wú)菌種苗，然后用其各個(gè)部分建立組織培養(yǎng)。到無(wú)菌種苗，然后用其各個(gè)部分建立組織培養(yǎng)。4）HgCl2效果最好，但對(duì)實(shí)驗(yàn)材料的危害最大，要用水沖洗至少效果最好，但對(duì)實(shí)驗(yàn)材料的危害最大，要用水沖洗至少5次。次。 消毒注意事項(xiàng)消毒注意事項(xiàng)第三章 外植體的選擇和滅菌 第一節(jié) 外植體的選擇 第二節(jié) 外植體的滅菌方法 第三節(jié) 污染原因和預(yù)防措施 第三節(jié)污染原因和預(yù)防措施第三節(jié)污染原因和預(yù)防措施1、污染的原因、污染的原因污染污染是指在組織培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生是指在組織培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。1.1 污染的原

8、因： 從病源菌方面：主要有細(xì)菌及真菌兩大類； 從污染的途徑： 外植體帶菌 培養(yǎng)基 器皿滅菌不徹底 操作人員未遵守操作規(guī)程等引起的。1.2 細(xì)菌污染的特點(diǎn)細(xì)菌污染的特點(diǎn)：菌斑呈粘液狀物，而且在接種后菌斑呈粘液狀物，而且在接種后12天即可發(fā)現(xiàn)。天即可發(fā)現(xiàn)。原因：原因：材料帶菌材料帶菌 培養(yǎng)基滅菌不徹底培養(yǎng)基滅菌不徹底 操作人員未遵守操作規(guī)程操作人員未遵守操作規(guī)程因此因此接種人員的手應(yīng)經(jīng)常用接種人員的手應(yīng)經(jīng)常用70%酒精精擦凈，鑷酒精精擦凈，鑷子和接種針在使用前必須在火焰上燒紅。子和接種針在使用前必須在火焰上燒紅。1.3 真菌污染的特點(diǎn)真菌污染的特點(diǎn)：污染部分長(zhǎng)有不同顏色的霉菌，在接種后污染部分長(zhǎng)有

9、不同顏色的霉菌，在接種后310天才能天才能發(fā)現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)。原因原因：周圍環(huán)境不清潔：周圍環(huán)境不清潔 超凈工作臺(tái)的過(guò)濾裝置失效超凈工作臺(tái)的過(guò)濾裝置失效 培養(yǎng)用器皿的口徑過(guò)大等培養(yǎng)用器皿的口徑過(guò)大等為了減少損失，提高工作效率，必須在為了減少損失，提高工作效率，必須在每個(gè)操作環(huán)節(jié)注每個(gè)操作環(huán)節(jié)注意防止污染的發(fā)生。意防止污染的發(fā)生。 污染后的措施 發(fā)現(xiàn)污染的材料應(yīng)及時(shí)處理，否則將導(dǎo)致培養(yǎng)室環(huán)境污染。 對(duì)一些特別寶貴的材料，可以取出再次進(jìn)行更嚴(yán)格的滅菌，然后接入新鮮的培養(yǎng)基中重新培養(yǎng)。 要處理的污染培養(yǎng)瓶最好在打開(kāi)瓶蓋前，先集中進(jìn)行高壓滅菌，再清除污染物，然后洗凈備用。2 污染的防治措施2.1 防止材料帶菌

10、的措施2.2 外植體的滅菌2.3 玻璃器皿的滅菌2.4 金屬器械的滅菌2.5 布質(zhì)制品的滅菌2.6 無(wú)菌操作室的滅菌2.7 操作 2.2.1 防止材料帶菌的措施防止材料帶菌的措施（1）用莖尖作外植體時(shí)，可在室內(nèi)或無(wú)菌條件下對(duì)）用莖尖作外植體時(shí)，可在室內(nèi)或無(wú)菌條件下對(duì) 枝條先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。枝條先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。p 枝條插入無(wú)糖的營(yíng)養(yǎng)液或自來(lái)水，以枝條插入無(wú)糖的營(yíng)養(yǎng)液或自來(lái)水，以新抽嫩枝條新抽嫩枝條作為外作為外植體；植體；p 或或暗培養(yǎng)暗培養(yǎng)，待，待 抽出徒長(zhǎng)的黃化枝條時(shí)采枝接種。抽出徒長(zhǎng)的黃化枝條時(shí)采枝接種。 （2）選擇合適的時(shí)間去田間采取外植體 避免陰雨天去田間采取外植體。 在晴天采取外植體時(shí)，下午

11、采取的外植體要比早晨采的污染少，因材料經(jīng)過(guò)日曬后可殺死部分細(xì)菌或真菌。 但目前對(duì)材料內(nèi)部污染還沒(méi)有令人滿意的滅菌方法。 在菌類長(zhǎng)入組織內(nèi)部時(shí)，不要去年生的鱗片，甚至要除去韌皮組織，只接種內(nèi)部的分生組織，可以收到一定的防污染效果。2.2 外植體的滅菌外植體的滅菌（1）多次滅菌法：如咖啡成熟葉片的滅菌）多次滅菌法：如咖啡成熟葉片的滅菌。p除去主脈、葉的頂端、基部和邊緣部分，這樣可大大減除去主脈、葉的頂端、基部和邊緣部分，這樣可大大減少污染；少污染；p消毒處理消毒處理p次日再次消毒次日再次消毒p對(duì)層積過(guò)的種子也可用多次滅菌法對(duì)層積過(guò)的種子也可用多次滅菌法，在種子吸脹前后都，在種子吸脹前后都要滅菌，要

12、滅菌，（2）多種藥液交替浸泡法 對(duì)容易污染而難滅菌的材料：2.3 玻璃器皿的滅菌 濕熱滅菌法即將玻璃器皿包扎后置入蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行高溫高壓滅菌，滅菌時(shí)間可延長(zhǎng)達(dá)25min30min。 干熱滅菌法即將玻璃器皿置入電熱烘箱中進(jìn)行滅菌。 煮沸滅菌即將玻璃器皿放入水中煮沸進(jìn)行滅菌。2.4 金屬器械的滅菌 火焰滅菌法：即把金屬器械放在95%的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃燒滅菌。 這一步驟應(yīng)當(dāng)在無(wú)菌操作過(guò)程中反復(fù)進(jìn)行。 干熱滅菌法：即將拭凈或烘干的金屬器械用紙包好，盛在金屬盒內(nèi)，放在烘箱中滅菌。 濕熱滅菌法：工作服、口罩、帽子等布質(zhì)品均用濕熱滅菌法，即將洗凈晾干的的布質(zhì)品，放入高壓鍋中，用1.1公斤/厘

13、米2 （即15磅/英寸2），121 的溫度，滅菌20 min30min。2.5 布質(zhì)制品的滅菌 2.6 無(wú)菌操作室的滅菌 無(wú)菌操作室的地面、墻壁和工作臺(tái)的滅菌可用2%的新潔爾敏或70%的酒精擦洗，然后用紫外燈照射約20min。 使用前用70%酒精噴霧，使空間灰塵落下。 一年中要定期一、二次用甲醛和高錳酸鉀熏蒸。2.7 2.7 操作人員在接種時(shí)一定要嚴(yán)格操作人員在接種時(shí)一定要嚴(yán)格按照無(wú)菌操作的程序進(jìn)行按照無(wú)菌操作的程序進(jìn)行防止操作帶來(lái)的污染 A、整個(gè)接種操作應(yīng)在近火焰處進(jìn)行，且動(dòng)作要迅速正正 確確 錯(cuò)錯(cuò) 誤誤B、接種過(guò)程中盡可能達(dá)到懸空要求防止操作帶來(lái)的污染正正 確確 錯(cuò)錯(cuò) 誤誤 C、接種時(shí)不得

14、用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口防止操作帶來(lái)的污染正正 確確 錯(cuò)錯(cuò) 誤誤小結(jié)：常用的滅菌方法小結(jié)：常用的滅菌方法物理方法物理方法化學(xué)方法化學(xué)方法干熱滅菌干熱滅菌(烘燒和灼燒烘燒和灼燒)濕熱滅菌濕熱滅菌(常壓或高壓蒸煮常壓或高壓蒸煮)射線處理射線處理(紫外線、超聲波、微波紫外線、超聲波、微波) 過(guò)濾除菌過(guò)濾除菌大量無(wú)菌水沖洗大量無(wú)菌水沖洗升汞升汞(氯化汞氯化汞)甲醛甲醛(福爾馬林福爾馬林)過(guò)氧化氫過(guò)氧化氫高錳酸鉀高錳酸鉀來(lái)蘇兒來(lái)蘇兒漂白粉漂白粉次氯酸鈉次氯酸鈉酒精酒精 不耐熱的物質(zhì)的過(guò)濾滅(除)菌 一些生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(赤霉素、玉米素)、某些維生素是不耐熱的，常用過(guò)濾滅菌-細(xì)菌過(guò)濾器方法。 防細(xì)菌濾膜網(wǎng)孔的直徑為0.22-0.45m以下，可阻止細(xì)菌細(xì)胞和真菌的孢子通過(guò)。小 結(jié)第一節(jié) 外植體的選擇 ：優(yōu)良種