鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸對骨癌痛小鼠機械痛敏和熱痛敏的影響

1、鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸對骨癌痛小鼠機械痛敏和熱痛敏的影響 作者：申文 馬正良 黃小冬 曾因明 【摘要】 目的 觀察脊髓水平氟代檸檬酸(fluorocitrate)對骨癌痛小鼠機械痛敏和熱痛敏的影響，探討脊髓星形膠質(zhì)細胞在傷害性信息傳遞中的作用。方法 C3H/HeJ 小鼠48只，隨機分為6組(n = 8) :假手術組( Sham組)，骨癌組，骨癌+生理鹽水組，骨癌+氟代檸檬酸0.25 nmol/5 l、0.50 nmol/5 l、0.75 nmol/5 l組。骨癌組和Sham組測定術前及術后7、12、17、21天小鼠機械縮腿閾值(MWT)和熱縮腿潛伏期(TWL)；骨癌各劑量組在第17天 鞘內(nèi)給予不同

2、劑量的氟代檸檬酸，測定給藥前和給藥后15 min、30 min、1 h、2 h MWT和TWL值。結果 骨癌組從術后12天開始直到本實驗觀察的術后21天，MWT和TWL均明顯降低,與Sham組相比具有顯著性差異( P0.01)；骨癌+生理鹽水組小鼠在各個時間點上與給藥前相比MWT和TWL無明顯改變( P0. 05)；骨癌+氟代檸檬酸各個劑量組小鼠在給藥后MWT和TWL均逐漸增加，具有劑量依賴性，并隨時間的延長又逐漸恢復到給藥前水平；骨癌+氟代檸檬酸0.75 nmol/5 l組在給藥后30 min時作用最明顯，與給藥前和鹽水組相比 P0.01。結論 鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸能明顯減輕骨癌痛小鼠機械痛敏

3、和熱痛敏，提示星形膠質(zhì)細胞在脊髓水平參與疼痛信息傳遞。 【關鍵詞】 骨癌痛；脊髓；星形膠質(zhì)細胞；氟代檸檬酸 癌癥痛嚴重影響患者的生活質(zhì)量,而新的癌癥痛動物模型的出現(xiàn)，為研究癌癥痛的機制，尋找新的治療方法提供了良好契機。大量研究表明星形膠質(zhì)細胞參與了痛信號的轉導，氟代檸檬酸（fluorocitrate）為星形膠質(zhì)細胞代謝抑制劑，其鞘內(nèi)注射在骨癌痛中是否可以產(chǎn)生抗傷害作用，目前鮮見文獻報道。本實驗擬觀察鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸對骨癌痛小鼠機械和熱痛閾值的影響，探討脊髓星形膠質(zhì)細胞在骨癌痛傷害性信息傳遞中的作用。 1 材料和方法 1.1 實驗動物及儀器試劑 實驗采用C3H/HeJ小鼠，56周，體重2025

4、 g，由中國科學院上海實驗動物中心提供，NCTC2472骨纖維肉瘤細胞株購自American Type Culture Collection (ATCC)。氟代檸檬酸(fluorocitrate)為美國Sigma公司產(chǎn)品， 批號：Sigma F-9634，配制方法：秤取4 mg氟代檸檬酸鋇鹽溶于0.5 ml鹽酸(1 mol)，加1或1.5滴Na2SO4(0.1 mol)，再加1 ml磷酸緩沖液(0.1 mol)，以12 000 g離心5 min，取上清加生理鹽水至4.8 ml此即為1 nmol/l。Von Frey細絲購自美國Stoelting公司；熱痛刺激儀BME2410A，中國醫(yī)學科學院生

5、物工程研究所生產(chǎn)。 1.2 細胞培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)基采用NCTC135培養(yǎng)基，其中含有10%的馬血清，ATCC所推薦，每周傳代1次，按146擴增。 1.3 骨癌痛模型的建立 參照Schwei等13所報道方法建立模型，小鼠麻醉后(戊巴比妥50 mg/kg,i.p)，行右膝關節(jié)切開術，暴露股骨關節(jié)面，然后用4號注射針頭鉆穿股骨，再換用20 l微量注射器將含有2×105個腫瘤細胞的-MEM培養(yǎng)基(內(nèi)含1%牛血清白蛋白) 20 l注入股骨遠端，假手術組只注入20 l -MEM培養(yǎng)基(內(nèi)含1%牛血清白蛋白)。注射完畢用牙科玻璃離子封住針孔，再用無菌生理鹽水沖洗創(chuàng)面，創(chuàng)口縫合。 1.4 小鼠鞘內(nèi)注射

6、(intrathecal injection,ith) 按壓小鼠腰骶兩側固定,自L56棘突間進針，以鼠尾突然出現(xiàn)側向運動為注射成功標志。注射用10 l 微量進樣器進行,注射容積為5 l，注射時間10 s，留針20 s。 1.5 動物分組及給藥 C3H/HeJ 小鼠48只，隨機分為6組(n= 8):假手術組( Sham)；骨癌+生理鹽水組：模型成功建立后17天鞘內(nèi)注射生理鹽水5 l；骨癌 +氟代檸檬酸0.25 nmol/5 l、0.5 nmol/5 l、0.75 nmol/5 l組：模型成功建立后第17天分別鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸0.25 nmol/5 l、0.5 nmol/5 l、 0.75 nm

7、ol/5 l。 所有藥物均用生理鹽水稀釋到5 l。 1.6 行為學測定 MWT測定：Von Frey 纖維細絲測定小鼠的機械性縮足閾值(mechanical withdrwal threashold, MWT)4，將一有機玻璃箱（5 cm×5 cm×10 cm）置于金屬篩網(wǎng)上，小鼠放置于玻璃箱中，待小鼠在有機玻璃箱中適應30 min后，用Von Frey纖維絲垂直刺激小鼠后肢足底中部，持續(xù)時間4 s，小鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為視為陽性反應，否則為陰性反應。測定首先從1.0 g開始，當該力度的刺激不能引起陽性反應，則給予相鄰大一級力度的刺激；如出現(xiàn)陽性反應則給予相鄰小一級力度的刺

8、激，如此連續(xù)進行，直至出現(xiàn)第1次陽性和陰性反應的騎跨，再連續(xù)測定4次。每次刺激間隔30 s，以此向下推算小鼠50%縮足閾值。 熱縮腿潛伏期（thermal withdrawal latency,TWL）的測定,將有機玻璃箱置于3 mm厚的玻璃板上，按Hargreaves法5用熱痛刺激儀照射小鼠足底，照射開始至小鼠出現(xiàn)抬腿回避時為TWL。自動切斷時間為25 s，以防止組織損傷。熱刺激強度在整個實驗過程中維持一致。每只動物測定5次，每次間隔3 min，取后3次平均值為小鼠TWL值。 1.7 組織學觀察 模型建立后第21天行小鼠心臟灌注取材后，再取下右側股骨進行修剪，去除周圍少量肌肉組織，再在4%多

9、聚甲醛液固定1周，然后轉移到10%的EDTA中進行脫鈣3周，石蠟切片，蘇木精-伊紅染色，鏡下觀察腫瘤細胞生長和骨結構的破壞情況。 1.8 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)均采用±s表示，用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，組內(nèi)比較采用配對t檢驗，組間比較采用方差分析，P 0.05認為有統(tǒng)計學意義。 2 結 果 2.1 癌痛小鼠痛敏變化 小鼠機械痛敏的測量通過對小鼠后爪中部Von Frey纖維細絲的刺激所產(chǎn)生的縮足反應以及熱刺激小鼠抬足次數(shù)，與Sham組對比,骨癌組術后第7天MWT及TWL統(tǒng)計無明顯差異(P0.05)，而第12、17天表現(xiàn)為MWT及TWL值下降(P0.05)，第21天行為學

10、表現(xiàn)更為明顯(P0.01)。各組MWT及TWL分別在2.60 g和14.50 s左右，術后假手術組各時間點均無統(tǒng)計學差異(P0.05),而骨癌組表現(xiàn)為MWT及TWL均下降(P0.05)，至21天最明顯(P001)。見表1。表1 鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸對骨癌痛小鼠行為學的影響 2.2 骨癌痛小鼠組織學觀察 模型建立后第21天，小鼠右股骨病理切片顯示，骨髓腔完全被腫瘤細胞所填充，中央大部分腫瘤細胞已退變壞死，而在骨髓腔的邊緣部分，腫瘤細胞多呈活躍狀態(tài)，腫瘤向外生長骨皮質(zhì)完全破壞，范圍廣泛。假手術組各時間點小鼠右股骨病理切片顯示，骨髓腔內(nèi)見各種正常的骨髓細胞，未見其他骨結構的改變(見圖1)。 2.3 癌

11、痛小鼠鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸對其MWT和MWT的影響 骨癌+生理鹽水組小鼠在各時間點與給藥前相比MWT和TWL無明顯改變(P0.05)；圖1 模型建立后第21天小鼠右側股骨病理切片而氟代檸檬酸各劑量組小鼠在給藥后MWT和TWL均逐漸增加，并隨時間的延長又逐漸恢復到給藥前水平。氟代檸檬酸0.25 nmol/l組在給藥后15 min和30 min后能明顯增加小鼠的MWL和TWL，與給藥前和鹽水組相比有統(tǒng)計學意義(P0.05)；隨著劑量的增加，小鼠的MWT和TWL均明顯增加且持續(xù)時間也明顯延長，氟代檸檬酸0.75 nmol/l組在給藥后30 min時達到最大效應(P 0.01)，并且持續(xù)到給藥后2 h。

12、給藥后2 h各組均恢復到給藥前水平(見表2、3) 。各鞘內(nèi)給藥組對大鼠運動功能均無影響。表2 鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸對骨癌痛小鼠機械痛敏閾值的影響 表3 鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸對骨癌痛小鼠熱痛敏閾值的影響 3 討 論 1999年，Schwei等 1首次在小鼠的一側股骨髓腔內(nèi)注射同品系的溶骨纖維肉瘤細胞，種植后的第21天，通過X線片可以觀察到明顯的骨質(zhì)破壞，組織學切片顯示破壞的程度與疼痛行為學表現(xiàn)呈正相關。在國外研究的基礎上，我們將溶骨纖維肉瘤細胞注入小鼠股骨髓腔內(nèi)，在小鼠術后12天開始出現(xiàn)機械痛敏和熱痛敏，并且隨著時間的推移，機械痛敏和熱痛敏表現(xiàn)越明顯，從行為學和組織學兩方面證明成功復制此模型。在實驗

13、中，我們發(fā)現(xiàn)最易導致建立模型失敗的是出血問題，骨髓腔穿刺時很容易導致髓腔出血，出血不止則無法進行癌細胞注射。通過反復的摸索，在止血方面我們采用2種方法以減少出血：其一是用一細長橡皮條作為止血帶結扎股骨的上端，時間保持在2 min之內(nèi)；其二，穿刺點用眼科玻璃離子封閉，此措施更易于封住針眼而不致腫瘤細胞從針孔外溢，導致腫瘤在骨外生長，造成模型失敗，同時也要注意無菌操作。 以往實驗證明在慢性給予嗎啡引起的耐受中星形膠質(zhì)細胞的代謝產(chǎn)物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）顯著升高，而給予氟代檸檬酸則可以減少嗎啡的耐受作用，增強其鎮(zhèn)痛作用6，即抗膠質(zhì)

14、細胞與嗎啡鎮(zhèn)痛有協(xié)同作用，間接證明了膠質(zhì)細胞可能參與疼痛的維持和發(fā)展。此外在神經(jīng)損傷以及炎性痛模型的動物實驗中,鞘內(nèi)注射 1 nmol的氟代檸檬酸能夠明顯的減輕由于神經(jīng)損傷和炎癥引起的痛覺過敏和異常性疼痛7-8，提示星形膠質(zhì)細胞與疼痛信息的傳遞關系密切。 在本實驗中我們建立穩(wěn)定的骨癌痛模型后，經(jīng)鞘內(nèi)注射星形膠質(zhì)細胞代謝抑制劑氟代檸檬酸，從行為學的角度觀察到其對骨癌痛小鼠具有鎮(zhèn)痛作用。在實驗中采用鞘內(nèi)注射的方式，可使藥物直接作用于脊髓的不同靶位，避免或最大限度地排除經(jīng)靜脈或腹腔給藥對機體中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外的影響，使觀察結果更為可靠；3個劑量組的結果均顯示不影響小鼠的運動功能。對于大鼠1 nmol劑

15、量的氟代檸檬酸能夠完全、可逆的阻斷星形膠質(zhì)細胞的新陳代謝，而并不影響神經(jīng)元的代謝作用9。我們在預實驗中觀察到,1 nmol以上氟代檸檬酸鞘內(nèi)注入可使小鼠的活動明顯增多，而本實驗所用藥物劑量對小鼠運動功能無影響。實驗中觀察到3個劑量組均能夠明顯減輕骨癌痛小鼠形成的機械痛敏和熱痛敏，且隨著劑量的增加而增強，持續(xù)時間也延長，提示星形膠質(zhì)細胞參與了骨癌痛小鼠傷害性信息的傳遞。其可能機制為：星形膠質(zhì)細胞是興奮性神經(jīng)遞質(zhì)代謝的重要場所，骨癌痛中星形膠質(zhì)細胞激活后導致神經(jīng)末梢谷氨酸堆積以至引起神經(jīng)系統(tǒng)的過度興奮；此外激活的星形膠質(zhì)細胞可以分泌一系列的細胞因子和生長因子，改變神經(jīng)元周圍的神經(jīng)化學環(huán)境，導致中樞

16、敏感化，而氟代檸檬酸能夠能夠通過抑制順烏頭酸酶而選擇性的抑制星形膠質(zhì)細胞的代謝活性，進而抑制中樞敏化的形成而產(chǎn)生抗傷害作用。具體機制，有待于進一步實驗研究證明。 【參考文獻】 1 Schwei MJ, Honore P, Rogers SD, et al. Neurochemical and cellular reorganization of the spinal cord in a murine model of bone cancer painJ. J Neurosci, 1999,19 (24):10886-10897. 2 Clohisy DR, Ogilvie CM, Carpen

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