07酶切與電泳ppt課件

1、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑 實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論 l限制性內(nèi)切酶切割出目的DNAl了解瓊脂糖凝膠電泳的原理l掌握瓊脂糖凝膠的制作及進(jìn)行電泳的方法 利用限制性內(nèi)切酶具有特定的識(shí)別及切割位點(diǎn)，定點(diǎn)切割環(huán)狀質(zhì)粒DNA。瓊脂糖凝膠電泳是基因工程操作中常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法，它能檢測(cè)少量的DNA如用肉眼觀察，可檢測(cè)到10 ng的DNA），且檢測(cè)的范圍很廣。影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素(1) DNA的純度；的純度；(2) DNA的甲基化程度；的甲基化程度；(3) 酶切消化反應(yīng)的溫度；酶切消化反應(yīng)的溫度；(4) DNA的分子結(jié)構(gòu)；的分子結(jié)構(gòu)；(5) 溶液中離子濃度

2、及種類；溶液中離子濃度及種類；(6) 緩沖液的緩沖液的 pH值。值。l瓊脂糖凝膠電泳的原理是溴化乙錠在紫外光照射下能發(fā)射熒光，當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中從負(fù)極向正極泳動(dòng)時(shí)，溴化乙錠從正極向負(fù)極移動(dòng)，這樣溴化乙錠分子就會(huì)嵌入DNA分子中形成絡(luò)合物，使DNA在紫外光下發(fā)射很強(qiáng)的熒光。在溴化乙錠足夠的情況下，熒光的強(qiáng)度正比于DNA的含量，這樣就可以檢測(cè)DNA的濃度。（一） 儀器 1. 水平式凝膠電泳槽 2. 穩(wěn)壓電泳儀 3. 電爐 4. 紫外檢測(cè)儀 5. 臺(tái)式離心機(jī) （二） 資料 實(shí)驗(yàn)一中提取的質(zhì)粒DNA和酶切后的質(zhì)粒DNA。 （三）（三） 試劑試劑 1.限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 2. TAE電泳緩

3、沖液電泳緩沖液(50) （pH8.0） Tris 242g 冰醋酸冰醋酸 57.1ml 0.5mol/L EDTApH8.0） 100ml 3. 溴化乙錠溶液溴化乙錠溶液 10mg/ml水溶液，室溫，棕色瓶水溶液，室溫，棕色瓶或鋁鉑紙包裝保存?；蜾X鉑紙包裝保存。 4. 10DNA樣品上樣緩沖液樣品上樣緩沖液 5. 瓊脂糖瓊脂糖酶切體系配制酶切體系如下: (共 20L) 質(zhì)粒 16 L 10X Buffer K 2 L BamH I 1 L Pst I 1 L 輕甩并混勻后再輕甩去除氣泡放于37水浴，酶切1.5小時(shí)。 l1. 洗凈電泳槽、制膠槽、梳子、擋板，晾干。 l2. 插好擋板、梳子。 l3

4、. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需稱取0.5克瓊脂糖，放入制膠 的容器中一般用三角瓶），然后加入50ml電泳緩沖液1TAE）。 l4. 加熱煮沸，使瓊脂糖完全溶解。 l5. 溶液冷至約60時(shí)，加入溴化乙錠5 L (終濃度為0.1 g/l)，輕輕搖勻，倒入制膠槽上，檢查有無氣泡。l6. 室溫下約30-45分鐘后，瓊脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和擋板，清除碎膠，將凝膠放入電泳槽中。 l7. 加入電泳緩沖液1TAE至電泳槽中，使液面高于膠面約1mm。l 8.在DNA樣品中加入2 L (1/10體積)的10 DNA上樣緩沖液(loading buffer)，混勻，稍甩一下，使溶液都處于離心管底。 l9.用移液器吸

5、起離心管中溶液，移入凝膠的梳孔中。l10.插上導(dǎo)線，打開電泳儀電源，按照需要調(diào)節(jié)電壓至120V，電泳開始，觀察電流情況或電泳槽中負(fù)極的鉑金絲是否有氣泡出現(xiàn)。 l11. 等溴酚藍(lán)泳動(dòng)至凝膠前沿后，將電壓或電流回零，關(guān)閉電源，停止電泳。 l12. 取出凝膠，在紫外觀測(cè)儀上觀察電泳結(jié)果。 l13. 根據(jù)需要切下DNA條帶，放入1.5ml Ep管中，放于4保管，以備下周實(shí)驗(yàn)用。 對(duì)于未進(jìn)行酶切的質(zhì)粒來說，常會(huì)出現(xiàn)兩條電對(duì)于未進(jìn)行酶切的質(zhì)粒來說，常會(huì)出現(xiàn)兩條電泳帶，一條是松弛螺旋狀質(zhì)粒泳帶，一條是松弛螺旋狀質(zhì)粒DNA帶，另帶，另一條是超螺旋狀質(zhì)粒一條是超螺旋狀質(zhì)粒DNA的帶，以超螺旋狀質(zhì)的帶，以超螺旋狀質(zhì)粒粒DNA居多，移動(dòng)速度也最快。有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)居多，移動(dòng)速度也最快。有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)三條帶，其中一條是因?yàn)橛幸恍┵|(zhì)粒三條帶，其中一條是因?yàn)橛幸恍┵|(zhì)粒DNA在提在提取過程中遭到損傷而線性化，其移動(dòng)速度介于螺取過程中遭到損傷而線性化，其移動(dòng)速度介于螺旋狀和超螺旋狀質(zhì)粒旋狀和超螺旋狀質(zhì)粒DNA之間，所以該條電泳之間，所以該條電泳帶也位于上述兩種帶之間。如果提取的質(zhì)粒很好帶也位于上述兩種帶之間。如果提取的質(zhì)粒很好時(shí)，這條帶會(huì)很弱，有時(shí)看不到。時(shí)，這條帶會(huì)很弱，有時(shí)看不到。Relaxed circleLinearized formSuper-coiled form