首屆吉林省大學(xué)生生物學(xué)實驗技能

1、首屆吉林省大學(xué)生生物學(xué)實驗技能競賽科目指南首屆吉林省大學(xué)生生物學(xué)實驗技能競賽組委會2013年3月6 / 7文檔可自由編輯打印科目一：Hucker 改良的革蘭氏染色法鑒定微生物一、實驗器材1、設(shè)備：顯微鏡（尼康YS100、YS2-H）2、材料：酒精燈、接種環(huán)、雙層瓶（內(nèi)裝香柏油和二甲苯）、載玻片、蓋片、擦鏡紙、白紙、革蘭氏染色液（結(jié)晶紫染液、碘液、95%乙醇、番紅液）、生理鹽水3、菌種：（1）大腸桿菌；（2）枯草芽孢桿菌二、實驗步驟1、涂片 取一塊潔凈載玻片，在載玻片的左、中、右3處各滴加一小滴無菌生理鹽水，且均勻分布，用接種環(huán)以無菌操作分別從大腸桿菌和枯草芽孢桿菌斜面上挑取少許菌苔于左、右一水

2、滴中，從大腸桿菌斜面和枯草芽孢桿菌斜面上各挑取少許菌苔同置于中間一水滴中，分別混勻并涂成薄膜。2、干燥室溫自然干燥。3、固定 涂面朝上，通過火焰2-3次。此操作目的是使細(xì)胞質(zhì)凝固，以固定細(xì)胞形態(tài)，并使之牢固附著在載玻片上。4、初染 滴加結(jié)晶紫液，以剛好將菌膜覆蓋為宜，染色1-2min，水洗。5、媒染 用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1min，水洗。6、脫色 用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時，立即水洗。7、復(fù)染 用番紅液復(fù)染約2min，水洗。8、鏡檢 干燥后，用油鏡觀察，比較。正確結(jié)果：菌體被染成深紫色的是革蘭氏陽性菌，被染成紅色的

3、是革蘭氏陰性菌。三、要求1、競賽選題內(nèi)容應(yīng)在 2小時內(nèi)完成；2、載玻片要潔凈無油跡；要用活躍生長期的幼培養(yǎng)物做革蘭氏染色；涂片不宜過厚，以免脫色不完全造成假陽性。3、固定操作中，火焰不宜過熱，以玻片不燙手為宜。4、革蘭氏染色結(jié)果是否正確，乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌；脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌；脫色時間一般為20-30s。5、在顯微鏡視野下觀察出兩種菌（大腸桿菌；枯草芽孢桿菌）的形態(tài)，在混菌中區(qū)分革蘭氏陰性菌和陽性菌，并作圖。6、寫出實驗報告，包括實驗?zāi)康?、原理、器材與材料、實驗步驟、結(jié)果與討論?？颇慷阂鹊鞍酌副然盍Φ臏y定一、實驗原理胰蛋白酶能催化蛋

4、白質(zhì)的水解，該酶對于由堿性氨基酸（如精氨酸，賴氨酸）的羧基與其他氨基酸所形成的肽鍵具有高度專一性。本實驗利用胰蛋白酶能催化N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）水解生成N-苯甲酰-L-精氨酸（BA）的原理，進(jìn)行胰蛋白酶的活力測定。由于BAEE在253nm處的紫外吸收遠(yuǎn)低于BA，而BAEE在胰蛋白酶的催化下逐漸生成BA，反應(yīng)體系在253nm的紫外吸收值隨之增加，因此可以以A253nm來計算胰蛋白酶的酶活力。胰蛋白酶的酶活力單位定義（底物BAEE）：在本實驗條件下，以BAEE為底物，每分鐘使A253nm增加0.001所需的酶量定義為1個酶活力單位。二、實驗器材1、設(shè)備：分光光度計（UVmini-1

5、240）、旋渦混合器（QL-901）、微量移液器。2、材料：試管、試管架、石英比色皿、記號筆、槍頭（1000微升、200微升、10微升）、5mL移液管、吸耳球、擦鏡紙、濾紙、洗瓶、燒杯。3、試劑：胰蛋白酶樣品（濃度為mg/mL，體積為Xml，需用Tris-HCl緩沖液自行稀釋指定倍數(shù)后測定）、0.05mol/L pH 7.8 Tris-HCl緩沖液、2mmol/L BAEE。三、實驗步驟1、取多支試管，分別標(biāo)號為1、2、3、4等，1號為空白組，其余為測定組，按照表1順序加入各相關(guān)試劑。表1. 胰蛋白酶活性測定加樣程序試劑/mL空白組測定組0.05mol/L，pH 7.8 Tris-HCl緩沖液

6、待測胰蛋白酶去離子水2mmol/L BAEE總體積1.50.11.53.11.50.11.53.12、以空白組校正A253nm值至0，測定組中加入底物液BAEE后，立即混合均勻，用比色皿在UVmini-1240分光光度計上測定光吸收值A(chǔ)253nm，同時記錄時間。3、每間隔1min讀取A253nm值一次，至6min終止讀數(shù)。4、通過調(diào)節(jié)酶的濃度，控制測定組測得A253nm/min在0.05-0.10之間數(shù)據(jù)視為有效。5、計算每分鐘平均A253nm增加值即A253nm/min。A253nm =【(A6min-A3min)/3 + (A5min-A2min)/3 + (A4min-A1min)/3】

7、/3 四、要求1、競賽選題內(nèi)容應(yīng)在 2小時內(nèi)完成；2、微量移液器在吸取液體時避免平置、倒置等狀態(tài)，防止液體流入移液器腔體內(nèi)；3、微量移液器用后要調(diào)至最大量程放置；4、測吸光度之前要分別用水和樣品潤洗比色杯；5、濾紙用于吸干比色杯上殘留的液體，擦鏡紙用于擦試比色杯的光面；6、比色杯用完后要用水清洗干凈，并倒扣在平皿上；7、寫出實驗報告，包括實驗?zāi)康?、原理、器材與材料、實驗步驟、結(jié)果與討論。8、實驗報告需計算出A253nm/min、所用胰蛋白酶的總活力、胰蛋白酶的比活力。科目三：離體蛙心及蟾蜍坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本制作一、實驗器材1、材料：鐵支架（共用）、雙凹夾、竹試管夾、蛙板、玻璃板（或光面瓷磚）、

8、杭剪(大剪刀)、組織剪、有齒組織鑷、眼科剪、眼科鑷、脊髓探針、玻璃分針、器械盤、吸管、小燒杯、蛙心插管、手術(shù)線、培養(yǎng)皿。2、試劑：任氏液3、動物：蟾蜍二、實驗步驟1、破壞腦和脊髓 取蟾蜍一只，左手持蟾蜍，用食指按壓其頭部前端，拇指按壓背部，使其脊柱伸直，右手持脊髓探針從枕骨大孔處垂直向下刺入，轉(zhuǎn)向前刺入顱腔，充分搗毀腦組織。然后將探針退至枕骨大孔處，轉(zhuǎn)向后刺入椎管搗毀脊髓。此時如蟾蜍的四肢無肌張力、呼吸消失，即表明腦和脊髓已破壞完全。將蟾蜍仰臥位置于蛙板上，用有齒組織鑷從劍突下夾起上腹部皮膚V型剪開；提起胸骨柄，V型剪開胸骨并剪斷，暴露心臟；用眼科鑷夾起心包膜剪開心包膜。2、心室插管 在左右主

9、動脈下穿一條手術(shù)線打活結(jié)備用。用眼科剪在左主動脈剪一斜口，將盛有任氏液的蛙心插管插入主動脈，至動脈圓錐時略向后退，于心室收縮時經(jīng)主動脈瓣進(jìn)入心室。若插管成功，管內(nèi)液面會隨著心跳波動。結(jié)扎、固定插管，并將結(jié)扎線固定于插管側(cè)鉤上；提起蛙心插管剪斷周圍血管等組織，使心臟離體。吸凈插管內(nèi)血液，用任氏液反復(fù)沖洗致液體澄清，液面高度應(yīng)為1-2厘米。3、剪除軀干上部和內(nèi)臟在骶髂關(guān)節(jié)水平上1cm處剪斷脊柱，左手提起蟾蜍的后肢，將骶骨向上，使蟾蜍頭和內(nèi)臟自然下垂，右手持剪刀，沿脊柱兩側(cè)剪除一切內(nèi)臟和頭胸部，留下后肢、骶骨、脊柱以及緊貼于脊柱兩側(cè)的坐骨神經(jīng)。4、皮膚剝離用有齒組織鑷夾住脊柱斷端，右手提起其上的皮膚

10、邊緣，用力向下剝?nèi)ト亢笾钠つw，把標(biāo)本置于盛有任氏液的培養(yǎng)皿中。5、分離后肢將標(biāo)本腹面朝上放于蛙板，沿正中線用杭剪沿脊柱和恥骨聯(lián)合正中線將標(biāo)本一分為二，將分離后的標(biāo)本浸入盛有任氏液的培養(yǎng)皿中。6、制備坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本（1）游離坐骨神經(jīng)用玻璃分針沿脊柱旁游離坐骨神經(jīng)，并沿坐骨神經(jīng)溝繼續(xù)分離坐骨神經(jīng)至腘窩處。用玻璃分針仔細(xì)剝離，眼科剪剪斷坐骨神經(jīng)的所有分支，然后用杭剪剪斷脊柱，僅保留約1cm與坐骨神經(jīng)相連的脊柱。（2）完成坐骨神經(jīng)小腿標(biāo)本將已手術(shù)分離的坐骨神經(jīng)置于腓腸肌上，剪掉膝關(guān)節(jié)以上的全部肌肉，然后在股骨中部用杭剪剪去上段股骨，保留約1cm的股骨，剩余的部分即為坐骨神經(jīng)小腿標(biāo)本。（3）完成坐骨神經(jīng)腓腸肌標(biāo)本將上述坐骨神經(jīng)小腿標(biāo)本在跟腱處穿線結(jié)扎后，于遠(yuǎn)心端剪斷跟腱。游離腓腸肌至膝關(guān)節(jié)處，然后用組織剪剪掉其余的小腿部分，完成坐