采用Fluo-3AM-ester探針研究桃不同組織的Ca

1、采用Fluo-3AM-ester探針研究桃不同組織的Ca論文導(dǎo)讀:：以中油桃7號(hào)為試材。采用Fluo-3AM-ester探針研究桃不同組織的Ca。論文關(guān)鍵詞：桃，Ca2+信號(hào)，激光掃描共聚焦顯微鏡，F(xiàn)luo-3AM-ester 鈣（Ca）作為植物必需的一種礦質(zhì)元素在自然界含量相當(dāng)豐富，它能夠以Ca2+的形式被根吸收并在植物生長發(fā)育和應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫中處于中心調(diào)控地位1。作為植物信號(hào)傳導(dǎo)中的第二信使2，在植物應(yīng)對(duì)環(huán)境刺激時(shí)，胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度的改變是一重要的網(wǎng)絡(luò)信號(hào)。同時(shí)鈣在果實(shí)耐貯性以及品質(zhì)方面有重要作用，如果實(shí)的鈣含量的提高有利于維持細(xì)胞壁的強(qiáng)度和膜的完整性，保持果實(shí)硬度，提高果實(shí)品質(zhì)3

2、45。激光掃描共聚焦顯微鏡 (Laser Scanning Confocal Microscope LSCM)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的細(xì)胞生物學(xué)分析儀，與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡相比生物論文，它具有更高的分辨率和清晰度，實(shí)現(xiàn)多重?zé)晒獾耐瑫r(shí)觀察并可形成清晰的三維圖象等優(yōu)點(diǎn)。利用熒光探針標(biāo)記，LSCM可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)微細(xì)結(jié)構(gòu)和離子的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行定性、定量、定時(shí)和定位分析，為我們對(duì)組織細(xì)胞的研究提供了新的手段6。Fluo-3 AM是一種長波鈣熒光探針，它的吸收和發(fā)射峰為506和526 nm，能被488nm的氬激光激發(fā)，若以游離配體形式存在時(shí)幾乎是非熒光性的，但是當(dāng)它與鈣離子結(jié)合后熒光會(huì)增加40至200倍，所以

3、Fluo-3-AM 常作為研究Ca2+信號(hào)的熒光染料7-8。本研究建立了采用Fluo-3 AM-ester為探針研究桃不同組織的Ca2+熒光信號(hào)特征分布，為進(jìn)一步研究Ca2+對(duì)果實(shí)品質(zhì)的影響，合理噴施鈣元素提供理論依據(jù)。1、材料、方法1.1 材料材料取自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所桃育種課題組品種資源圃，以中油桃7號(hào)為試材，每10天噴1.0 % CaNO3。我們選取成熟果實(shí)和同時(shí)期的葉柄用來分析鈣離子信號(hào)論文格式模板。1.2 方法1.2.1材料制備及探針雜交 采用徒手切片法，用剃須刀片將果實(shí)切取約1mm的厚度。將Fluo-3-AM（BiotiumUSA）50g溶于45l DMSO (lmM)，

4、15l/支分裝，凍存。25gPluronic F-127溶于75l DMSO (25%，40溶解20分鐘)生物論文，室溫保存。用含HEPES的緩沖液將1mM Fluo-3-AM稀釋成10M，每ml染液中再加入5lPluoronic F127。具體操作步驟如下：（1）將切取組織放入1.5ml離心管；（2）用HEPES緩沖液漂洗2次 ；（3）用200l的Fluo-3 AM-ester(10M)，37避光孵育60分鐘；（4）再用HEPES緩沖液漂洗3次；（5）放在載玻片上進(jìn)行觀察。1.2.2圖像采集及分析 Ca2+熒光信號(hào)圖像的采集采用Leica SP5 激光共聚焦掃描顯微鏡，制片后立即進(jìn)行觀察。采

5、用Argon激發(fā)光（波長488 nm）和透射光Transmission（DIC）掃描，選擇XYZ掃描模式。熒光掃描參數(shù)設(shè)置為：Gain值：500；分辨率（Resolution）：8Bit；像素格式（Pixel Format）：512*512 pixels；掃描速度（Scanning Speed）400Hz；針孔大?。≒inhole Size）：53；線平均（Line Averaging）：1；面平均（Frame Averaging）：1；累加（Accumulation）：1。圖像文件均儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)中，并以512*512像素類型保存。最大和最小相對(duì)熒光強(qiáng)度采用線定量分析法，2、結(jié)果與分析2.1

6、Ca2+信號(hào)熒光相對(duì)強(qiáng)度我們對(duì)的桃葉柄（圖1、2）和果肉組織（3、4）中Ca2+的熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行了線性相對(duì)定量分析，從表1可以看出葉柄中10×物鏡下最大相對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度為218.32，最小相對(duì)強(qiáng)度為36.68, 20×物鏡下最大相對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度為212.21，最小相對(duì)強(qiáng)度為42.79；果肉組織中10×物鏡下最大相對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度為189.9 7，最小相對(duì)強(qiáng)度為45.03；20×物鏡下最大相對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度為176.07，最小相對(duì)強(qiáng)度為40.93。同一組織不同倍性物鏡觀察下相對(duì)最大熒光強(qiáng)度變化不大。2.1在不同組織中的分布通過比較Ca2+在桃葉柄和果肉組織中

7、的熒光信號(hào)特征分布和強(qiáng)度，我們可以看出Ca2+在細(xì)胞壁和胞間均有分布，葉柄組織細(xì)胞中分布相對(duì)較均勻，而在果肉組織中分布相對(duì)不均勻，雖然果實(shí)和葉柄中最大相對(duì)熒光強(qiáng)度相差不大，但在果實(shí)中Ca2+分布相對(duì)葉柄中較少生物論文，這可能與Ca2+在葉柄和果肉組織中的作用有關(guān)，葉柄作為重要的礦質(zhì)元素運(yùn)輸通道，Ca2+參與許多重要的生理和代謝途徑。但在果實(shí)中Ca2+作用相對(duì)于葉柄比較小。表1 不同組織及放大倍數(shù)Ca2+信號(hào)強(qiáng)度分析Table 1 Ca2+signalintensity analysis of different tissue and magnification  樣品 最大值 最小值

8、 Sample Maximum Minimum 葉柄（10×） 218.32 36.68 葉柄（20×） 212.21 42.79 果肉（10×） 199.97 45.03 果肉（20×） 204.07 40.93 C A B D 圖1. 桃葉柄中游離Ca2+熒光信號(hào)特征（10×）。A: Argon熒光激發(fā)下Ca2+熒光信號(hào)特征；B:透射光觀察下葉柄組織結(jié)構(gòu)；C: A、B的疊加圖；D: 3D成像圖Figure 1.Ca2+ fluorescence signal characteristic (10×)。A: Ca2+ fluores

9、cence signal characteristic excited byargon-ion laser sources, B: Petiole structure scanned in transmitted lightfield, C: Combination of A and B, D: Three dimension imagination.  D C A B 圖2. 桃葉柄中游離Ca2+熒光信號(hào)特征（20×）。A: Argon熒光激發(fā)下Ca2+熒光信號(hào)特征；B: 明場透射光觀察下葉柄組織結(jié)構(gòu)；C: A、B的疊加圖；D: 3D成像圖 B A C D 圖3. 桃果實(shí)

10、中游離Ca2+熒光信號(hào)特征（10×）。A: Argon熒光激發(fā)下Ca2+熒光信號(hào)特征；B: 明場透射光觀察下葉柄組織結(jié)構(gòu)；C: A、B的疊加圖；D: 3D成像圖 D B A C 圖4. 桃果實(shí)中游離Ca2+熒光信號(hào)特征（20×）。A: Argon熒光激發(fā)下Ca2+熒光信號(hào)特征；B: 明場透射光觀察下葉柄組織結(jié)構(gòu)；C: A、B的疊加圖；D: 3D成像圖  0.5-20-2-3   3、討論細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)定量技術(shù)有多種，主要有熒光探針法9、Ca2+敏感微電極法10以及發(fā)光蛋白熒光染色法等11論文格式模板。目前，熒光探針法是最常用的定量方法，而且已廣泛應(yīng)用

11、于細(xì)胞內(nèi)鈣的測定，特別用于測定動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度7,12-13。Fluo-3 AM-ester熒光探針一種可以穿透細(xì)胞膜的熒光染料，主要是通過與細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間游離的鈣離子結(jié)合對(duì)Ca2+信號(hào)分布進(jìn)行定量分析11，它可以靈敏反映細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度變化。Fluo-3 AM進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)非特異性酯酶脫去AM，成為Fluo-3留在細(xì)胞內(nèi)。Fluo-3與細(xì)胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后，其熒光強(qiáng)度是本身的40倍以上。一般在活體細(xì)胞中進(jìn)行，所以很難采用組織石蠟切片的方法進(jìn)行，因此切片的厚度是獲得清晰圖像的關(guān)鍵，本研究中采用徒手切片的方法能夠很清晰的觀察到熒光信號(hào)及植物細(xì)胞的基本架構(gòu)。作為植物最重要的礦質(zhì)元素之一

12、，鈣離子在植物細(xì)胞壁、細(xì)胞膜以及液泡中分布比較廣泛，并行使著重要功能14，植物主要通過根吸收周圍環(huán)境中的游離的鈣生物論文，在植物的不同部位起著不同的作用。齊開杰等15研究表明植物不同部位鈣的含量不同，葉片的鈣含量最高，認(rèn)為長距離運(yùn)輸?shù)闹饕獎(jiǎng)恿κ钦趄v作用，而葉片是主要的蒸騰器官，葉柄是連接莖和葉片之間的營養(yǎng)物質(zhì)和同化物質(zhì)的重要通道，這也可能是葉柄積累大量鈣的原因。在桃果肉中，Ca2+信號(hào)主要分布在細(xì)胞壁，有研究表明內(nèi)源鈣含量的提高有利于維持細(xì)胞壁的強(qiáng)度和膜的完整性, 提高果實(shí)品質(zhì)3。Biggs等16研究表明采前噴施鈣能有效減少桃果實(shí)腐爛、保持果實(shí)硬度和改善果實(shí)外觀等作用。這些研究結(jié)果都表明細(xì)胞壁

13、是果肉中鈣的主要分布區(qū)。本研究中，雖然葉柄和果肉中Ca2+的最大熒光相對(duì)量相差不大，但葉柄中鈣的含量和分布明顯大于果肉中的，這與前人研究結(jié)果一致。參考文獻(xiàn)Reference1Hepler P K. Calcium, a central regulator of plantgrowth and development. Plant Cell，2005，17: 2142 - 2155.2NicolaH. Evans, Martin R. McAinsh, Alistair M. Hetherington and Marc R. Knight. ROSperception in Arabidopsis thaliana: the ozone-induced calcium response. ThePlant Journal, 2005, 41: 615 - 626.3朱竹,孟祥紅,田世平.采前