王可畢業(yè)論文0616

1、( 此文檔為 word 格式，下載后您可任意編輯修改！)分類號：TS201單位代碼： 10183吉林大學碩士學位論文玉米蛋白資源高效利用開發(fā)抗氧化肽的關(guān)鍵技術(shù)研究Key technologies of efficient utilization of Corn gluten meal todevelop antioxidative peptides作者姓名：王可專業(yè)：食品科學研究方向：營養(yǎng)與功能食品指導教師：林松毅教授培養(yǎng)單位：軍需科技學院2014年6月1玉米蛋白資源高效利用開發(fā)抗氧化肽的關(guān)鍵技術(shù)研究Key technologies of efficient utilization of Co

2、rn gluten mealto develop antioxidative peptides作者姓名：王可專業(yè)名稱：食品科學指導教師：林松毅教授學位類別：工學碩士答辯日期： 2014 年 6 月 5 日中文摘要玉米蛋白資源高效利用開發(fā)抗氧化肽的關(guān)鍵技術(shù)研究本論文研究內(nèi)容隸屬于 “十二五” 國家科技支撐計劃課題 食源性功能肽生物制備技術(shù)研究（ 2012BAD33B03），是以蛋白質(zhì)含量為79.4 % 、粒徑為 180 目的玉米蛋白粉為原料，重點開展了高效水解玉米蛋白粉的關(guān)鍵技術(shù)、高活性玉米抗氧化肽（CAPS）的優(yōu)選、高活性玉米抗氧化肽（ CAPS-1）的安全毒理學評價、玉米抗氧化肽（CAPS-

3、1）分離制備高活性因子、基于高壓脈沖電場技術(shù)（PEF ）提高玉米抗氧化肽活性等研究工作，具體研究內(nèi)容如下：（1）在高效水解玉米蛋白粉的關(guān)鍵技術(shù)研究中，以水解度（DH ）為衡量指標，借助單因素實驗和響應(yīng)面實驗設(shè)計等研究方法，對比分析了堿性蛋白酶、 中性蛋白酶和木瓜蛋白酶 3 種蛋白酶對玉米蛋白粉酶解過程中的DH 的影響情況。通過對酶解溫度T 、酶解pH 值、酶比底物濃度 ES的單因素實驗對比分析獲知，堿性蛋白酶酶解制備玉米蛋白粉酶解物的 DH最高。通過響應(yīng)面實驗設(shè)計，構(gòu)建了堿性蛋白酶回歸模型為2211.8954X2 -1.74292X3 ，式中： X 1 為酶解溫度（）； X2 為酶解 pH 值

4、； X 3 為酶比底物濃度ES（% ）。其最佳工藝參數(shù)為：酶解溫度 50 ，酶解 pH 值 8.6，酶比底物濃度 9.13 % ，玉米蛋白粉的最大水解度可達 40.26 ±0.23 % ；在此基礎(chǔ)上探討了輻照劑量 （0-138.7 kGy）對玉米蛋白粉酶解過程中 DH 的影響，獲知當輻照劑量為 65.0 kGy 時，玉米蛋白粉的 DH可達最高值 48.23 ±6.1 %，經(jīng)場發(fā)射掃描電鏡檢測輻照前后玉米蛋白粉表面形態(tài)變化，獲知較未輻照玉米蛋白粉相比，輻照劑量為65.0 kGy 的玉米蛋白粉表面的凹凸程度增加，完整性下降。關(guān)鍵詞：玉米蛋白粉，玉米抗氧化肽，電子束輻照技術(shù)，高壓

5、脈沖電場技術(shù)AbstractKey technologies of efficient utilization of Corn gluten meal to developantioxidative peptidesKey technologiesof efficient utilization of Corn gluten meal to develop antioxidative peptides were granted by the National Science and Technology Pillar Program during the 12th Five-year Plan

6、 Period (No. 2012BAD33B03). Corn gluten meal (protein content of79.4%, sieving mesh of 180) were used as raw material. The key technologies of gluten meal, optimization of Corn antioxidant peptides (CAPS) with of CAPS with of gluten meal, CAPS, Electron beam radiation, PEF technology目錄第 1 章緒論 .11.1玉

7、米蛋白粉的綜合利用現(xiàn)狀分析 .11.1.1玉米蛋白粉的組成 .11.1.2玉米蛋白粉的營養(yǎng)價值 .11.1.3玉米蛋白粉的應(yīng)用現(xiàn)狀 .21.2食源性抗氧化肽的研究進展 .31.2.1大豆源抗氧化肽 .31.2.2水產(chǎn)源抗氧化肽 .31.2.3蛋源抗氧化肽 .31.2.4玉米源抗氧化肽 .41.3影響抗氧化肽活性的高新技術(shù)的研究現(xiàn)狀 .41.3.1超聲波技術(shù) .41.3.2微膠囊技術(shù) .41.3.3高壓脈沖電場技術(shù) .51.4輻照技術(shù)在功能食品領(lǐng)域中的研究現(xiàn)狀 .51.5本文主要研究內(nèi)容 .61.5.1研究內(nèi)容 .61.5.2研究路線 .6第 2 章高效水解玉米蛋白粉的關(guān)鍵技術(shù)研究 .82.1材

8、料與設(shè)備 .82.1.1材料與試劑 .82.1.2儀器與設(shè)備 .82.2實驗方法 .92.2.1玉米蛋白粉的酶解方法 .92.2.2水解度測定方法 .92.2.3蛋白酶可控酶解技術(shù)的單因素實驗設(shè)計 .102.2.4蛋白酶可控酶解技術(shù)的響應(yīng)面實驗設(shè)計 .102.2.5電子束輻照技術(shù)對玉米蛋白粉水解度的影響 .112.2.6場發(fā)射電子掃描實驗 .112.2.7數(shù)據(jù)分析方法 .112.3結(jié)果與分析 .122.3.1單因素實驗結(jié)果 .122.3.2響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果 .162.3.3不同輻照劑量對玉米蛋白粉水解度的影響 .192.3.4場發(fā)射電子掃描結(jié)果分析 .202.4討論.212.5本章小結(jié) .2

9、2第 3 章高活性玉米抗氧化肽（ CAPS-1）的優(yōu)選 .233.1材料與設(shè)備 .233.1.1材料與試劑 .233.1.2實驗動物 .233.1.3儀器與設(shè)備 .243.2實驗方法 .243.2.1超濾分離技術(shù) .243.2.2DPPH 清除率的測定方法 .253.2.3體內(nèi)抗氧化活性評價方法 .253.2.4氨基酸成分及含量分析 .263.2.5數(shù)據(jù)處理與分析方法 .263.3結(jié)果與分析 .273.3.1超濾液各組分的 DPPH 清除率測定結(jié)果 .273.3.2體內(nèi)抗氧化活性評價結(jié)果 .273.3.3氨基酸成分及含量分析 .293.4討論.303.5本章小結(jié) .31第 4 章高活性玉米抗氧

10、化肽（ CAPS-1）的安全毒理學評價 .324.1材料與設(shè)備 .324.1.1材料與試劑 .324.1.2實驗動物 .324.1.3儀器與設(shè)備 .324.2實驗方法 .334.2.1實驗動物飼養(yǎng)與分組 .334.2.2受試小鼠精子畸形率的測定方法 .334.2.3受試小鼠的骨髓微核率測定方法 .344.2.4受試小鼠的 NK 細胞活性檢測方法 .344.2.5受試小鼠的臟器系數(shù)檢測方法 .344.2.6受試小鼠的體重均值、日攝食量和日飲水量監(jiān)測方法.344.2.7數(shù)據(jù)處理與分析方法 .344.3結(jié)果與分析 .354.3.1CAPS-1 不同受試劑量對小鼠精子畸形率和骨髓微核率的影響354.3

11、.2CAPS-1 不同受試劑量對受試小鼠的 NK 細胞活性的影響 .354.3.3CAPS-1 不同受試劑量對受試小鼠的臟器系數(shù)的影響 .364.3.4CAPS-1 不同受試劑量對受試小鼠的體重的影響 .364.3.5CAPS-1 不同受試劑量對受試小鼠日攝食量和飲水量的影響. 374.4討論.374.5本章小結(jié) .38第 5 章玉米抗氧化肽（ CAPS-1）分離制備高活性因子的研究 .405.1材料與設(shè)備 .405.1.1材料與試劑 .405.1.2儀器與設(shè)備 .405.2實驗方法 .415.2.1CAPS-1 的最大吸收波長測定 .415.2.2CAPS-1 的 Sephadex G-25

12、凝膠色譜分離方法 .415.2.3DPPH 清除率的測定方法 .415.2.4氨基酸成分及含量分析 .415.2.5數(shù)據(jù)處理與分析方法 .425.3結(jié)果與分析 .425.3.1CAPS-1 的最大吸收波長檢測結(jié)果 .425.3.2CAPS-1 的 Sephadex G-25凝膠色譜分離圖譜分析 .425.3.3DPPH 清除率測定結(jié)果 .435.3.4氨基酸成分及含量分析結(jié)果 .445.4討論.445.5本章小結(jié) .45第 6 章基于高壓脈沖電場技術(shù)提高玉米抗氧化肽活性的研究.466.1材料與設(shè)備 .466.1.1材料與試劑 .466.1.2儀器與設(shè)備 .466.2實驗方法 .466.2.1高

13、壓脈沖電場處理實驗 .466.2.2單因素實驗設(shè)計 .476.2.3響應(yīng)面實驗設(shè)計 .476.2.4DPPH 清除率的測定方法 .476.2.5中紅外光譜（ MIR ）分析 .486.2.6數(shù)據(jù)處理與分析方法 .486.3結(jié)果與分析 .486.3.1PEF 的單因素實驗結(jié)果 .486.3.2PEF 的響應(yīng)面實驗結(jié)果 .506.3.3MIR 分析結(jié)果 .536.4討論.536.5本章小結(jié) .54第 7 章結(jié)論 .557.1全文結(jié)論 .557.2創(chuàng)新點56參考文獻58導師簡介64作者簡介65在學期間所取得的科研成果66致謝68英文縮略詞表英文縮寫英文名稱中文名稱DHDegree of Hydrol

14、ysis水解度SPSSStatistical Package for Social Science 社會科學統(tǒng)計軟件包OFATOne-factor-at-a-time單因素實驗設(shè)計RSMResponse Surface Methodology響應(yīng)面分析法BBDBox-Behnken DesignBox-Behnken 設(shè)計SDStandard Deviation標準差DPPH1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl1,1-二苯基 -2-三硝基苯肼CAPSCorn Antioxidative Peptides玉米抗氧化肽LDLow Dose低劑量MDMiddle Dose中劑

15、量HDHigh Dose高劑量GSH-PxGlutathione Peroxidase谷胱甘肽過氧化物酶SODSuper Oxide Dismutase超氧化物歧化酶MDAMalondialdehyde丙二醛CATCatalase過氧化氫酶PEFPulsed Electric Field高壓脈沖電場EWAPSEgg White Antioxidative Peptides蛋清抗氧化肽MIRMid-infrared中紅外光譜分析第 1 章緒論1.1玉米蛋白粉的綜合利用現(xiàn)狀分析玉米是我國的傳統(tǒng)糧食作物，分布范圍廣，營養(yǎng)價值豐富，2013 年產(chǎn)量已超過2.1億噸，而且種植面積將繼續(xù)擴大。近年來，我國

16、玉米深加工行業(yè)取得了飛速發(fā)展，一系列玉米加工副產(chǎn)物在我國食品工業(yè)和畜牧業(yè)中的地位也越來越重要，玉米蛋白粉即屬于其中之一。玉米蛋白粉是玉米籽粒經(jīng)濕磨法工藝生產(chǎn)玉米淀粉所產(chǎn)生的副產(chǎn)物，產(chǎn)量占總產(chǎn)品的 30 % 左右 1,2 。但是由于玉米蛋白粉的水溶性差、口感粗糙、利用率低、營養(yǎng)價值低等不足，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用，大多被用于飼料或作為廢棄物排掉3 。一直以來，如何提高玉米蛋白粉的利用率和附加值成為了食品工業(yè)的研究熱點，這對于玉米產(chǎn)業(yè)的綜合開發(fā)利用有著重要意義。玉米蛋白粉的組成玉米蛋白粉中含蛋白質(zhì)60 % 左右，含淀粉 20 % ，以及少量的纖維素和維生素A，通常含 15 種無機鹽和玉米黃色素

17、 4,5 。玉米蛋白粉中的蛋白在機體內(nèi)呈現(xiàn)兩種不同狀態(tài)，即可溶性蛋白質(zhì)和不可溶性蛋白質(zhì)6 ?？扇苄缘鞍踪|(zhì)在機體內(nèi)分解、轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)出一定的生理功能性；不可溶性蛋白質(zhì)易和大分子有機物或微量元素結(jié)合，不易被機體吸收利用。 玉米蛋白粉中淀粉分為抗性淀粉和慢消化淀粉兩種，抗性淀粉在小腸中不能被酶解，但在人的腸胃道結(jié)腸中可以與揮發(fā)性脂肪酸發(fā)生發(fā)酵反應(yīng)；慢消化淀粉在小腸中黏滯性增大，被消化吸收速度較慢。所以如何改良淀粉和蛋白質(zhì)特性是玉米蛋白粉精深加工的主要研究問題。玉米蛋白粉的營養(yǎng)價值玉米蛋白粉中的蛋白質(zhì)主要為醇溶蛋白和谷物蛋白，另有少量的球蛋白和白蛋白7 。醇溶蛋白可溶于 70 % - 80 % 的乙醇，

18、谷蛋白可溶于稀酸或稀堿，球蛋白不溶于水但溶于鹽，白蛋白又稱清蛋白，可溶于水8 。玉米蛋白粉水解后可分解得到谷氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和丙氨酸等 9 ，其中亮氨酸和谷氨酸的含量較多，賴氨酸和色氨酸含量較低，其他幾種必需氨基酸含量也較低。由于這種獨特的氨基酸組成，造成玉米蛋白粉的營養(yǎng)價值不高，但是通過生物工程和化學技術(shù)可以對玉米蛋白粉進行二次利用。目前的研究熱點在于，11 。10 ?？刂泼附饧夹g(shù)可獲得具備多種生理功能的玉米源活性肽。玉米蛋白粉的應(yīng)用現(xiàn)狀（1）用作飼料蛋白原料玉米蛋白粉不含有毒有害物質(zhì)， 可以直接作為飼料蛋白原料。 玉米蛋白粉飼料可替代豆餅和菜粕，通常作為家禽配合飼料的主要組分。飼喂玉

19、米蛋白粉的蛋雞產(chǎn)蛋率可提高15 % 左右，能夠防治蛋雞的軟骨病和其他疾病，有助于提高蛋白品質(zhì)。用玉米蛋白粉飼喂牛，可以使在瘤胃中不易被消化的蛋白質(zhì)能在小腸中被更好地吸收（2）制備谷氨酰胺肽谷氨酰胺是一種氨基酸類藥物， 可用于治療胃腸性疾病和免疫性疾病。 研究人員發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺一般聚集于玉米醇溶蛋白， 而玉米蛋白主要由醇溶蛋白構(gòu)成， 所以可由玉米蛋白粉制得谷氨酰胺肽。當機體內(nèi)谷氨酰胺含量不足時， 可以通過體外的谷氨酰胺肽進行補給，利用低價值的玉米蛋白粉制備高價值的谷氨酰胺肽是玉米蛋白粉深加工一條新途徑（3）制備玉米醇溶蛋白研究發(fā)現(xiàn)，玉米醇溶蛋白具有獨特的溶解性、成模性和生物活性，可用于防潮、抗氧

20、化、保鮮、防靜電等。利用成膜性，玉米醇溶蛋白還可作為藥物制劑的輔料。近年來有研究報道，玉米醇溶蛋白的制備方法已經(jīng)由過去的異丙醇提取法發(fā)展為乙醇提取法。也有研究應(yīng)用超聲波技術(shù)和萃取技術(shù)，并優(yōu)化獲得醇溶蛋白的提取工藝，可以提高生產(chǎn)效率12 。（4）制備玉米黃色素玉米蛋白粉經(jīng)水解、 萃取、蒸發(fā)濃縮等操作能夠制備玉米黃色素。適宜的蛋白酶水解條件和酶解物處理能夠提高玉米黃色素得率，增效劑的配合使用能夠影響玉米黃色素的光密度值 13 。段純明等研究了通過擠壓膨化技術(shù)處理玉米蛋白粉可以提高玉米黃色素的提取率14 。而且玉米蛋白粉的酶解溫度、水解時間和pH值也會影響玉米黃色素的提取率15。（5）制備玉米蛋白肽

21、近期研究發(fā)現(xiàn)，玉米蛋白粉可用以制備高F 值低聚肽、降血壓肽和抗氧化肽等蛋白肽。高 F 值低聚肽的消化吸收性優(yōu)于蛋白質(zhì)與氨基酸，可以作為腸道營養(yǎng)劑。隨著相關(guān)研究的逐步深入，高F 值低聚肽的生產(chǎn)與應(yīng)用為玉米蛋白粉的精深加工開辟了新方向。玉米蛋白粉具有獨特的氨基酸組成，能夠滿足血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE ）抑制肽的氨基酸特征，可制備獲得降血壓肽16,17。何慧等研究報道，玉米大豆復配蛋白可以制備獲得降血壓肽，而且中性蛋白酶是酶解蛋白的最適宜酶 18 。國內(nèi)外研究表明，玉米源抗氧化肽的活性受酶解條件、 蛋白酶種類和底物特性的影響較大。 有研究證實， 玉米抗氧化肽的活性測定方法較為普遍，多數(shù)以自由基清除率

22、為考察指標 19 。王雙玉研究報道，底物濃度為8 % ，ES為 2 % ，pH 值為 9.0，時間為 3of One-factor-at-a-time experiment酶種類因素水平123456酶解溫度（）404550556065堿性蛋白酶酶解 pH 值67891011ES（ % ）24681012酶解溫度（）253035404550中性蛋白酶酶解 pH 值55.566.577.5ES（ % ）24681012酶解溫度（）404550556065木瓜蛋白酶酶解 pH 值456789ES（ % ）24681012蛋白酶可控酶解技術(shù)的響應(yīng)面實驗設(shè)計利用響應(yīng)面軟件 Design-Expert 8

23、.0 中的 BBD 實驗設(shè)計進行優(yōu)化分析。 根據(jù)單因素實驗結(jié)果和 BBD 中心組合實驗原理，為最優(yōu)蛋白酶設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化實驗55。建立二次回歸模型，用不失擬的回歸方程確定最優(yōu)工藝參數(shù)，決定最優(yōu)響應(yīng)因子水平56。自變量 X 1（酶解溫度）、X 2（酶解 pH 值）、X 3（ES ）的三個水平編碼表如表2.2，回歸方程的二次模型如下：3323y 0j X jjj X 2jij Xi X jj1j 1i 1j i1式中： y 是響應(yīng)值； 0是截距， j、jj 和 ij 分別代表線性、平方和交互作用系數(shù)； Xi 和 Xj 代表自變量。表 2.2響應(yīng)面實驗因素水平表Table 2.2 Fact

24、ors and levels of RSM因素編碼編碼水平-101酶解溫度（）X 1505560酶解 pH 值X 28910ES （% ）X 38910電子束輻照技術(shù)對玉米蛋白粉水解度的影響以玉米蛋白粉為原料，分別經(jīng)0 kGy 、9.0 kGy、36.8 kGy、65.0 kGy、 108.7 kGy、135.0 kGy 和 138.7 kGy 8 個輻照劑量進行電子束輻照處理，依次在適宜蛋白酶的最佳酶解條件下進行可控酶解處理， 以 DH 作為衡量指標， 檢測不同輻照劑量對玉米蛋白粉水解度的影響。場發(fā)射電子掃描實驗利用場發(fā)射掃描電子顯微鏡（JSM-6700F，JEOL 日本電子公司）對輻照處理

25、前后的玉米蛋白粉進行電鏡掃描，可以反映輻照處理對玉米蛋白粉表面微觀結(jié)構(gòu)的影響。數(shù)據(jù)分析方法利用 SPSS 17.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析和顯著性檢驗，結(jié)果用平均數(shù)±標準偏差（ x ±S.D.）表示，顯著性水平為P<0.05。2.3結(jié)果與分析單因素實驗結(jié)果以 DH 作為衡量指標，對溫度 T（）、pH 值和酶比底物濃度 ES（ % ）三個因素影響三種蛋白酶的酶解效果情況匯總分析，結(jié)果如圖 2.1 所示。（1）酶解溫度對 DH 的影響酶解溫度對 DH 的影響如圖 2.1 所示，在可控酶解條件下，堿性蛋白酶的酶解效果理想， DH 能夠達到 40 % 以上。（ a）堿性蛋

26、白酶（ b）中性蛋白酶（ c）木瓜蛋白酶圖 2.1 酶解溫度對 DH 的影響Figure 2.1Effects of temperature on DH注：不同小寫字母代表差異性顯著（P<0.05）。如圖 2.1（ a）所示，溫度對其DH 影響顯著（ P<0.05），隨著溫度升高， DH 逐漸上升，在60時達到最高值37.89 ±2.89 % ，繼續(xù)升高至65 時，DH顯著下降（P<0.05）。中性蛋白酶的單因素實驗結(jié)果如圖2.1（ b）所示，比較于堿性蛋白酶，其酶解物的DH較低，當酶解溫度由25 升至30 時 ,DH顯著升高（P<0.05），最高值達到3.21±0.21 %，隨著溫度繼續(xù)升高，DH逐漸下降。木瓜蛋白酶的單因素結(jié)果如圖2.1（c）所示，同樣，相比于堿性蛋白酶，其酶解物的DH較低，隨著溫度升高，DH顯著增加（P<0.05），在60 時， DH達到最高值6.56±0.5 % 。（2）酶解pH值對DH的影響pH 值對 DH 的影響如圖 2.2 所示，堿性蛋白酶的單因素結(jié)果如圖 2.2（a）， DH 隨著 pH 值的升高先增加后再減少，變化顯著