無菌、微生物限度檢查及方法驗(yàn)證

1、無菌、微生物限度檢查 及方法驗(yàn)證 微生物實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理 一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)施與設(shè)備和管理（法規(guī)要求） 無菌檢查、微生物限度檢查與抗生素微 生物檢定的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)嚴(yán)格分開。 無菌檢查、微生物限度檢查實(shí)驗(yàn)室分 無菌操作間和緩沖間。 無菌操作間應(yīng)具備相應(yīng)的空調(diào)凈化設(shè) 施和環(huán)境，采用局部百級(jí)措施時(shí)，其環(huán) 境應(yīng)符合萬級(jí)潔凈度要求。 進(jìn)入無菌操作間應(yīng)有人流凈化和物流 凈化的設(shè)施。 無菌操作間應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)品種的需要， 保持對(duì)鄰室的相對(duì)正壓或相對(duì)負(fù)壓，并 定期檢測(cè)潔凈度。 無菌操作間內(nèi)禁放雜物，并應(yīng)制定地 面、門窗、墻壁、設(shè)施等的定期清潔、 滅菌規(guī)程。 無菌檢查在潔凈度100級(jí)單向流空氣區(qū)域 內(nèi)進(jìn)行，其全過程應(yīng)嚴(yán)格遵

2、守?zé)o菌操作， 防止微生物污染。單向流空氣區(qū)與工作臺(tái) 面，必須進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。微生物限度檢 查的全過程，均應(yīng)遵守?zé)o菌操作，嚴(yán)防再 污染。 微生物實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理 為滿足微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求，微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具有： 嚴(yán)格分開的無菌檢查、微生物限度檢查、 無菌采樣室。 菌種處理與微生物鑒別室有局部百級(jí)措 施。 各自分開的抗生素微生物檢定、細(xì)菌內(nèi) 毒素檢查、抗菌作用測(cè)定半無菌室。 培養(yǎng)室（一般為100，000級(jí)）。 試液及培養(yǎng)基的配制室。 滅菌室。 實(shí)驗(yàn)器皿洗滌、烘干室。 人員辦公休閑室。 實(shí)驗(yàn)用品、易耗品儲(chǔ)藏室。 微生物實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理 設(shè)施和設(shè)備的管理 特殊標(biāo)準(zhǔn)品菌種 培養(yǎng)基、緩沖液、試劑 消毒劑 文件

3、管理 培訓(xùn) 內(nèi)審 微生物實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理 微生物室實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理制定 潔凈室（無菌室）的使用管理規(guī)程 （SOP） 菌種處理相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP） 生物安全柜的使用標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP） 帶菌廢棄物的處理標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP） 環(huán)境消毒標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP） 環(huán)境清潔、消毒標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP） 試液及培養(yǎng)基配制的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 （SOP） 實(shí)驗(yàn)器皿洗滌標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP） 建立無菌室使用登記冊(cè) 使用日期，時(shí)間，使用人，設(shè)備運(yùn)轉(zhuǎn) 狀況，溫、濕度，潔凈度狀況（沉降菌 數(shù)、浮游菌數(shù)、塵埃粒子數(shù)），報(bào)修原 因，報(bào)修結(jié)果，清潔工作（臺(tái)面、地面、 墻面、天花板、傳遞窗、門把手），消 毒液名稱等 微

4、生物實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理 實(shí)驗(yàn)室使用管理 每天工作前用消毒液消毒工作臺(tái)，開紫 外燈（最少半小時(shí)）進(jìn)行空氣消毒，每 月定期做徹底清潔工作，適當(dāng)時(shí)用消毒 劑進(jìn)行熏蒸。 非必要品禁止帶入實(shí)驗(yàn)室，必要資料和 記錄應(yīng)消毒后進(jìn)入并應(yīng)遠(yuǎn)離操作臺(tái)。 實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)入潔凈室（無菌室）不得化 妝、戴手表、戒指等首飾；不得吃東西。 應(yīng)嚴(yán)格按更衣程序更衣。 記錄溫濕度是否在規(guī)定的范圍內(nèi)，每次 實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)操作室和層流臺(tái)做微生物沉 降菌落計(jì)數(shù)并記錄；如發(fā)現(xiàn)問題應(yīng)找原 因，及時(shí)報(bào)修和報(bào)告并將報(bào)修原因和結(jié) 果記錄歸檔。如遇停電，應(yīng)立即停止實(shí) 驗(yàn)，重新進(jìn)入無菌室前，至少開啟機(jī)房 運(yùn)轉(zhuǎn)1小時(shí)以上。 在每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，應(yīng)用消毒劑及時(shí)按 消

5、毒規(guī)程中的要求消毒操作臺(tái)和潔凈室 （區(qū)），并開啟室內(nèi)紫外燈以殺滅存留 微生物。 使用后的器具如平皿、試管，所有微生 物培養(yǎng)物，染菌/帶菌物品等應(yīng)用消毒液 浸泡（至少24小時(shí)以上），經(jīng)煮沸或滅 菌后清洗或丟棄。 微生物實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理 l潔凈室（無菌室）的使用管理 每季度定期進(jìn)行清潔度再驗(yàn)證，以確保 潔凈度符合規(guī)定，保存原始記錄及趨勢(shì) 分析資料，定期歸檔保存。 至少每年一次定期更換新的紫外燈管并 記錄，以確保紫外燈管滅菌持續(xù)有效， 定期歸檔保存。 至少2年1次，或按潔凈度驗(yàn)證實(shí)際情況， 定期更換初效、中效、高效頭。以確保 凈化系統(tǒng)的功能持續(xù)有效，并同時(shí)在使 用登記本上做好更換記錄。定期歸檔保 存

6、。 平時(shí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)盡可能減少人員的走動(dòng) 或活動(dòng)，通向潔凈室的門要關(guān)閉或安裝 自動(dòng)閉門器使其保持關(guān)閉狀態(tài)。 發(fā)現(xiàn)潔凈度不符合規(guī)定時(shí)，應(yīng)立即停止 使用，尋找原因，徹底清潔、消毒，須 經(jīng)清潔度再驗(yàn)證符合規(guī)定后，才再使用， 并將情況記錄在無菌室使用登記冊(cè)上， 定期歸檔保存。 非微生物室檢驗(yàn)人員不得進(jìn)入潔凈室 （無菌室），對(duì)必須進(jìn)入的外來人員或 維修人員應(yīng)進(jìn)行指導(dǎo)和監(jiān)督。 微生物實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理 一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)施與設(shè)備和管理 設(shè)施潔凈室、凈化工作臺(tái)、生物安全 柜。 設(shè)備高壓蒸汽滅菌器、電熱恒溫干烤 箱、培養(yǎng)箱、冰箱。 實(shí)驗(yàn)儀器全封閉薄膜過濾裝置、電動(dòng) 勻漿儀、電熱恒溫水浴箱、離心機(jī)、顯 微鏡，及刻度吸管、

7、試管、三角燒瓶、 培養(yǎng)皿等。 建立主要設(shè)施、設(shè)備、儀器的明細(xì)記錄， 內(nèi)容包括名稱、型號(hào)、生產(chǎn)廠家、購買 日期。 質(zhì)量保證檔案：購買發(fā)票、安裝驗(yàn)收或 開箱驗(yàn)收記錄、調(diào)試記錄、計(jì)量檢定或 運(yùn)行校驗(yàn)合格證、指定專人負(fù)責(zé)、制訂 標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）、建立使用登記 冊(cè)，維修、保養(yǎng)記錄、改造或更新記錄、 直至報(bào)廢記錄。 微生物實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理 一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)施與設(shè)備和管理 定期監(jiān)測(cè)生物安全柜和（或）超凈工作 臺(tái)的內(nèi)表面的微生物學(xué)質(zhì)量及其內(nèi)部的 空氣質(zhì)量（粒子和微生物）。使用時(shí)檢 查壓差指示表。 培養(yǎng)箱、冰箱需在設(shè)備的每個(gè)腔室內(nèi)放 置經(jīng)校準(zhǔn)過的玻璃溫度計(jì)，每天檢查設(shè) 備腔室內(nèi)的溫度狀況并且在日志上做好 相應(yīng)

8、的記錄。定期回顧每個(gè)設(shè)備的溫度 記錄數(shù)據(jù)，以考察設(shè)備的運(yùn)行狀態(tài)。 定期用中性的清潔劑或消毒劑清洗培養(yǎng) 箱（或室）、冷藏箱（或室）、冷凍冰 箱及水浴的腔室內(nèi)表面。 高壓滅菌柜、電熱恒溫干燥箱等需要驗(yàn) 證和持續(xù)監(jiān)控。 儀器的校準(zhǔn)和確認(rèn)。 微生物實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理 需要確認(rèn)和驗(yàn)證試驗(yàn)和 持續(xù)的質(zhì)量監(jiān)控的設(shè)備 高壓滅菌柜和電熱恒溫干燥去熱原烘箱 安裝確認(rèn)（IQ）：要確認(rèn)控制系統(tǒng)及其 他儀器儀表的設(shè)計(jì)是否得當(dāng)并經(jīng)過校驗(yàn)。 檢查有關(guān)共用介質(zhì)（如蒸氣、水和空氣 等）符合滅菌工藝的要求。 運(yùn)行確認(rèn)（OQ）：要求證明空載狀態(tài)下 驗(yàn)證方案中所述腔室內(nèi)所有關(guān)鍵位置的 溫度是否均處在規(guī)定范圍內(nèi)。建立熱分 布圖譜。空載狀

9、態(tài)下，濕熱滅菌當(dāng)腔室 工作溫度不低于121時(shí)，各點(diǎn)溫度與 腔室內(nèi)平均溫度之差不超過1 ，于 熱除熱源，當(dāng)運(yùn)行溫度不低于250 時(shí)， 腔室內(nèi)的溫差應(yīng)不得超過15 。 性能確認(rèn)（PQ）：要求在滿載條件，溫 度探頭插入待滅菌物品的內(nèi)部，同時(shí)加 入一定濃度的微生物或獨(dú)立的生物指示 劑。 對(duì)不同的工藝條件（物品、包裝和裝載 方式、滅菌參數(shù)等），分別進(jìn)行性能確 認(rèn)試驗(yàn)，包括熱穿透試驗(yàn)和生物指示劑 挑戰(zhàn)試驗(yàn)。 包括：高壓滅菌 柜、除熱源電熱 恒溫干燥箱、自 動(dòng)微生物鑒別系 統(tǒng)和計(jì)數(shù)系統(tǒng)。 微生物實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理 品種：520倍稀釋的碘伏水溶液 0.10%新潔爾滅容易 1:50的84消毒液 75%乙醇溶液 3

10、%碘酒溶液 5%石碳酸（來蘇兒）消毒溶液 2%戊二醛水溶液 尼泊金酒精消毒液等 應(yīng)定期更換消毒劑品種，按標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)確配 制。 l清潔、消毒劑的管理 微生物實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理 一、菌種的保存與管理 菌種特殊的標(biāo)準(zhǔn)品 應(yīng)保持基生長(zhǎng)特性和減 少污染，是微生物實(shí)驗(yàn) 結(jié)果一致性的重要保證。 制定菌種保藏管理制度 微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定菌種的保藏管理規(guī) 程來規(guī)范菌種的來源、申購、保管、轉(zhuǎn) 種傳代、存儲(chǔ)和領(lǐng)用等方面的要求，確 保菌種的溯源性和穩(wěn)定性；防止試驗(yàn)用 菌種因多次傳代而失去典型生物學(xué)特征 發(fā)生變異或死亡，保證菌種長(zhǎng)期正確、 穩(wěn)定，從而確保實(shí)驗(yàn)的靈敏度和重現(xiàn)性。 菌種名稱：金 黃色葡萄球菌 菌種系列號(hào)：CMCC

11、(B)26003 傳代次數(shù)： 第 4 代 有 效 期： 年 月 日 制備日期： 年 月 日 傳 代 人： 王熙鳳 微生物實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理 菌種保存應(yīng)有專人負(fù)責(zé)，加鎖保存于冰 箱中。 實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)來自CMCC（中國(guó) 藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)菌種保藏中心 或ATCC（美國(guó)菌種保藏中心）等國(guó)際法 定菌種保藏機(jī)構(gòu)。有接收、確認(rèn)記錄。 菌種的轉(zhuǎn)種等均應(yīng)在超凈工作臺(tái)進(jìn)行， 以防污染。 各種菌種應(yīng)按規(guī)定時(shí)間接種，所有保藏 的菌種均應(yīng)貼有相應(yīng)的標(biāo)簽，有菌種清 單。 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)常用菌種 枯草芽孢桿菌 CMCC （B）63501 金黃色葡萄球菌 CMCC （B）26003 生孢梭菌 CMCC （B）64941

12、銅綠假單胞菌 CMCC （B）10104 大腸埃希菌 CMCC （B）44102 乙型副傷寒沙門菌 CMCC （B）50094 白色念珠菌 CMCC（B）98001 黑曲霉 CMCC （B）9 003 菌種保藏步驟 干燥菌種復(fù)蘇，劃平板 挑選特征典型的純菌菌落；（制菌懸液使用） 確定保藏的合格菌體形態(tài)； 選擇最適宜的保存方法，定期對(duì)保藏菌種進(jìn)行檢查，觀察是否 發(fā)生變化，若有變化，須改變保藏方法。保藏期滿應(yīng)及時(shí)進(jìn)行 移種。 菌種的接收 標(biāo)準(zhǔn)菌種一般是玻璃安平裝的凍干粉劑 接收時(shí)應(yīng)檢查名稱/數(shù)量和完整性。 貼好標(biāo)簽后儲(chǔ)存于-20 一般安平凍干品可在5年之內(nèi)使用 使用時(shí)應(yīng)按（菌種保藏中心提供的）相關(guān)

13、資料的要求進(jìn)行復(fù)溶、 培養(yǎng)和保存。 菌種的復(fù)活 l 菌種的復(fù)活 用70%的酒精擦拭清潔安瓿，自然風(fēng)干 用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線，用手輕輕將安瓿開 無菌操作，用一無菌吸管無菌移取12ml適宜的液體培養(yǎng)基到瓿中； 輕輕地旋轉(zhuǎn)安瓿以使凍干菌種和液體培養(yǎng)基充分混合并完全溶解； 用無菌吸管將安瓶?jī)?nèi)菌液轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中， 根據(jù)不同菌種類型而將其培養(yǎng)于相宜的溫度下24-72小時(shí)。 l 菌種的確認(rèn) 菌種復(fù)活后，應(yīng)確認(rèn)菌種的純度與特性 從培養(yǎng)肉湯中取細(xì)菌培養(yǎng)物接種到平板上，上劃線分離出單個(gè)菌落。 培養(yǎng)后觀察其是否具有典型的菌落形態(tài) 然后挑取單一的純菌落，進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，觀察其染色特性及 菌形。

14、 最后再做生化實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步鑒定該菌種，或用API鑒定系統(tǒng)做鑒定 工作。 對(duì)已經(jīng)過鑒定確認(rèn)的菌種就可以進(jìn)行菌種的傳代和保藏了。 菌種的傳代和保藏 l 菌種的保藏方法 使菌種的代謝處于最不活躍或相對(duì)靜止的狀態(tài)，從而在一定時(shí)間內(nèi) 不發(fā)生變異并保持生命活力。 一般來說，低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的三個(gè) 重要因素 無論使用那種菌種保藏方法，都應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證，以確保在相應(yīng)保存條 件下的菌種不會(huì)變異并且性能穩(wěn)定。 菌種的傳代次數(shù)（自原始菌種凍干粉起）不得超過5代（GMP，藥 典） 將微生物接種至一新鮮培養(yǎng)基上/內(nèi)，每萌發(fā)一次即稱為“一代”。 冷凍真空干燥保藏法 主要是將待保藏菌種混于有保護(hù)作用介

15、質(zhì)內(nèi)制成菌液，分裝在安 瓿中于冷凍條件下使其快速凍結(jié)，因凍結(jié)可使晶型細(xì)致，不致?lián)p傷活 菌細(xì)胞。然后用真空抽氣減壓，是安瓿內(nèi)的冰晶液體升華，水氣迅速 被真空抽走，冰晶型的菌液很快變成疏松的干燥固體物，最后在真空 狀態(tài)下熔封管口，使干燥物在局部真空條件下封存，并置冷暗處，在 很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)菌種仍可維持活力不變。 甘油冷凍管保藏法 將待保藏菌接種至平板或瓊脂斜面，培養(yǎng) 用無菌接種環(huán)輕輕刮取菌臺(tái)，用接種環(huán)使細(xì)菌充分?jǐn)U散到預(yù)先裝于 試管中的無菌蒸餾水中 調(diào)整菌液濃度，使其等同于麥?zhǔn)媳葷峁艿?0號(hào)管 向已制備好的菌懸液中加入等體積、濃度為20%的無菌甘油，得到 10%甘油菌懸液。 輕輕振搖小管，使內(nèi)容物充分混

16、合，分裝于無菌小試管。 制好的甘油冷凍管最好在-30條件下貯存。 有效期至少為2年。 氧細(xì)菌和酵母菌可用此法保藏，霉菌和厭 氧菌則不適于用此法保藏。 液體石蠟覆蓋保藏法 將菌種穿刺接種于半固體高層培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 無菌操作在層流臺(tái)下用無菌吸管吸取無菌液體石蠟至培養(yǎng)好的菌種 管內(nèi)，并使石蠟高出菌種表面約1cm， 將試管直立，置于28冰箱中或室溫下保存，如 銅綠假單胞菌。 此法保藏霉菌、放線菌、芽胞桿菌可保藏 兩年以上，酵母菌可保藏12年，一般無 芽胞細(xì)菌也可保藏1年左右。 此法制備簡(jiǎn)單，不需要其他特殊設(shè)備，并 且效果好，是傳代培養(yǎng)的變相方法，可適 當(dāng)延長(zhǎng)保藏時(shí)間。 瓊脂斜面低溫保藏法保藏法（廠家常

17、用） 將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)充分后，移至28 冰箱中保藏。 保藏時(shí)間： 霉菌、放線菌及芽胞的菌保存24 個(gè)月，移種一次； 酵母菌2個(gè)月移種一次； 細(xì)菌最好每1月移種一次。 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，使用方便，不需特殊設(shè)備，對(duì)大多數(shù)微生物都適 用。 缺點(diǎn)：保藏期太短；傳代次數(shù)多，易發(fā)生變異及污染。 此法為實(shí)驗(yàn)室工作用菌種的最常用的保藏方法，僅能用于工作用菌 種的短期保藏。 保藏芽胞液對(duì) 產(chǎn)芽胞的微生物宜制成芽胞菌懸液后再保藏， 無菌操作，取1ml孢子液接入茄形瓶或培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)使菌液 均勻分布于培養(yǎng)基表面。 將培養(yǎng)皿在適當(dāng)?shù)臏囟认屡囵B(yǎng)。一般需要7天或更長(zhǎng)時(shí)間 在層流臺(tái)下，取35ml氯

18、化鈉磷酸鹽緩沖液（pH7.0）加入培養(yǎng)皿內(nèi) 用無菌玻璃L棒輕輕刮下菌苔，注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基。 用無菌注射器或無菌吸管吸取菌懸液，收集于試管中。 將收集的芽胞液放在8090水浴中加熱15分鐘， 冷卻。 做好標(biāo)記，放至28冰箱中保藏。原始 芽胞液可保存1年。 每次使用前用平皿法重新標(biāo)定其濃度。 微生物菌種的傳代保藏過程 按菌種說明書要求復(fù)溶菌粉 菌（標(biāo)準(zhǔn)菌株），轉(zhuǎn)種于適 當(dāng)?shù)脑鼍囵B(yǎng)基內(nèi)（此為第 一代G1），復(fù)壯后轉(zhuǎn)接至平 板上，并于適當(dāng)溫度下培養(yǎng) 適當(dāng)時(shí)間，分離出單個(gè)純種 菌落（此為第二代G2） 菌種鑒定完成后，挑取純菌 落制成濃菌懸液用于制備甘 油冷凍管，冷凍或低溫保存 （標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株G2）；

19、同時(shí) 挑取純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種作 為工作用菌種（工作菌株 W3），于適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適 當(dāng)時(shí)間后可用于試驗(yàn)， 直至轉(zhuǎn)為W5為止，需重新開 啟安瓶，再重復(fù)上述操作程 序。 菌種被分為兩類，傳代用菌種和工作用菌種， 傳代用菌種（標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株）用甘油冷凍管法保藏 工作用菌種（工作菌株）用斜面低溫保藏法保藏 試驗(yàn)用菌液的制備 傳代：取菌液0.1ml接種至10ml液體培養(yǎng) 基，按規(guī)定培養(yǎng)、稀釋 對(duì)照用菌種在使用過程中，亦應(yīng)檢查其生 物學(xué)特性。如菌落形態(tài)（在可能情況下， 用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行生長(zhǎng)檢查）、革蘭染 色、鏡檢菌體形態(tài)、主要生化特性（必要 時(shí)應(yīng)作菌種鑒定實(shí)驗(yàn)）。如發(fā)現(xiàn)染菌或或 變異，衰退等現(xiàn)象時(shí)，應(yīng)及時(shí)

20、處理。 為保證試驗(yàn)的可靠性和準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)室還 應(yīng)嚴(yán)格按照相關(guān)規(guī)程制備和使用菌種，并 對(duì)每種微生物的存貯條件（需/厭氧狀態(tài)、 溫度和時(shí)間）進(jìn)行確認(rèn)。 室溫下菌懸液應(yīng)在制備后的2小時(shí)內(nèi)使用 低溫保存（2-8）時(shí) 細(xì)菌和酵母菌的菌懸液應(yīng)在制備后的24小時(shí)內(nèi)使用 霉菌孢子液則應(yīng)在制備后的7天內(nèi)使用（黑曲霉孢子懸液可保存在28 ，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用） 在使用時(shí)（在24小時(shí)之內(nèi)）均應(yīng)同時(shí)進(jìn)行菌數(shù)復(fù)核檢查。 試驗(yàn)時(shí)可采用分光光度法或麥?zhǔn)媳葷岱ü?計(jì)菌液濃度。 菌種的制備、保藏和使用記錄 1、菌種名稱_菌種系列號(hào)_菌種來源_ 實(shí)驗(yàn)室編號(hào)_傳代代數(shù)_ 2、菌種制備：培 養(yǎng) 基_批號(hào)_接種日期_ 接種容器_數(shù)

21、量_培養(yǎng)條件_溫度_時(shí)間_ 純化分離鑒定結(jié)果_操作人_日期_ 3、菌種保藏方法_保藏?cái)?shù)量_保藏用培養(yǎng)基_批號(hào)_ 培養(yǎng)條件 溫度_時(shí)間_有效期_操作人_日期_ 4、菌種使用記錄 序號(hào)支取日期數(shù)量操作人用途處理 當(dāng)菌種超過有效期或被污染以后應(yīng)滅菌后丟棄。 是 否 說明：實(shí)驗(yàn)室菌種編號(hào)原則：名稱+傳代代數(shù)+ 制備日期 培養(yǎng)基管理 一般采用購自中國(guó)藥品生物制品檢定所合 格的商品脫水培養(yǎng)基。同時(shí)按照使用說明 書進(jìn)行配制，需注意培養(yǎng)基的pH值應(yīng)符合 規(guī)定，否則必須校正后，按說明書規(guī)定滅 菌。 商品脫水培養(yǎng)基應(yīng)在有效期內(nèi)使用，使用 前應(yīng)注意核對(duì)名稱，檢查外觀，遇有結(jié)塊、 吸潮現(xiàn)象，應(yīng)廢棄。 新鮮培養(yǎng)基的配制

22、，應(yīng)按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的 配方進(jìn)行，對(duì)培養(yǎng)基的原材料要進(jìn)行挑選， 試劑應(yīng)為化學(xué)純?cè)噭┮?guī)格。制成的培養(yǎng)基 要求無沉淀。必要時(shí)以適當(dāng)方法過濾，調(diào) 整pH值，分裝滅菌備用。 滅菌：應(yīng)經(jīng)驗(yàn)證合格的滅菌程序（一定裝 載方式下滅菌方法和條件）。 驗(yàn)證：無菌性試驗(yàn)，促生長(zhǎng)試驗(yàn)，滅菌器 蒸汽循環(huán)系統(tǒng)。 培養(yǎng)基的質(zhì)量控制 建立質(zhì)量控制程序 所有配好的培養(yǎng)基均需進(jìn)行質(zhì)量控制（pH、適用性檢查試驗(yàn)） 培養(yǎng)基有效期的確定：定期的穩(wěn)定性檢查以確定有效期（225，避光，非密閉容 器3周內(nèi)使用，密閉容器1年內(nèi)使用。 質(zhì)量控制的頻率：用同1批脫水培養(yǎng)基，采用經(jīng)驗(yàn)證的配制和滅菌方法制備的培養(yǎng)基， 可只做1次靈敏度檢驗(yàn)。 質(zhì)量控制菌

23、株的選擇（營(yíng)養(yǎng)、靈敏、代表性） 對(duì)無菌培養(yǎng)基的無菌性、靈敏度檢查 與對(duì)照培養(yǎng)基進(jìn)行比較 無菌檢查用需氣厭氣培養(yǎng)基的指示劑氧化層不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，否則須經(jīng)水 浴煮沸10分鐘，但只限加熱一次。無菌檢查結(jié)束時(shí)，指示劑氧化層應(yīng)不超過培養(yǎng)基 深度的1/2。 大腸埃希菌檢查用MUG培養(yǎng)基配制前應(yīng)挑選無熒光的試管進(jìn)行配制，觀察結(jié)果時(shí)應(yīng) 用同批培養(yǎng)基配制的空白管和陽性菌管同時(shí)觀察。 培養(yǎng)基的靈敏度檢查：已知菌生長(zhǎng)試驗(yàn) 細(xì)菌組： 取每管裝量為12ml硫 乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基9 支，分別接種小于 100cfu試驗(yàn)菌各2支； 菌種： 金黃色葡萄球菌 銅綠假單胞菌 枯草芽孢桿菌 生孢梭菌 空白對(duì)照：另一支不

24、接種，培養(yǎng)2472小 時(shí)逐日觀察結(jié)果 霉菌組： 取每管裝量為9ml的 改良馬丁液體培養(yǎng)基5 支，分別接種小于 100cfu試驗(yàn)菌各2支； 菌種： 白色念珠菌 黑曲霉 空白對(duì)照：另一支不 接種，培養(yǎng)5天逐日觀 察結(jié)果 l結(jié)果判 定 空白管培 養(yǎng)基無菌 生長(zhǎng) 加菌的培 養(yǎng)基管均 生長(zhǎng)良好 判靈敏度 檢查合格。 培養(yǎng)基管理 配制好的培養(yǎng)基，按無菌要求進(jìn)行滅菌。 培養(yǎng)基的配制須有記錄，記錄內(nèi)容含有： 配制日期和配制人員的標(biāo)識(shí)； 培養(yǎng)基/溶液的類型、體積； 成分、每個(gè)成分物質(zhì)的含量、 制造商、批號(hào)； pH（最初和最終）值 無菌措施，包括實(shí)施的方式、 時(shí)間和溫度。 按日期編制滅菌后的培養(yǎng)基編號(hào) 將制備完畢

25、的培養(yǎng)基按品種放置在陰涼的指定位置，備用。注意保 存期 滅菌法 濕熱高壓蒸汽滅菌法：依115、121 或132 ， 應(yīng)用于培養(yǎng)基滅菌、試驗(yàn)器械、工作服、 橡膠物品和實(shí)驗(yàn)室廢棄物，也可用于玻璃 器皿的滅菌。一般121 30min 干熱法：利用物理學(xué)，171 -1小時(shí)， 160 -2小時(shí)、121 -3小時(shí)：玻璃器皿 濕熱：蛋白質(zhì)容易凝固 干熱：氧化 檢驗(yàn)方法學(xué)驗(yàn)證： l 在化學(xué)測(cè)試中，藥品的測(cè)定方法需要驗(yàn)證，與此相應(yīng)， 當(dāng)建立藥品的無菌、微生物限度檢查法時(shí)，也應(yīng)進(jìn)行分 析方法的驗(yàn)證，以證明所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無 菌、微生物限度檢查。 l 證明采用藥典的某種方法和檢驗(yàn)條件，在該供試品的檢 驗(yàn)量

26、、檢驗(yàn)條件下，無抑菌活性或活性已消失，保證檢 驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 檢驗(yàn)方法學(xué)驗(yàn)證： l 驗(yàn)證時(shí)機(jī)； l 建立檢驗(yàn)方法時(shí)； l 修訂檢驗(yàn)方法時(shí)； l 組分和檢驗(yàn)條件發(fā)生變更時(shí)； l 定期再驗(yàn)證。 人員 l 人是無菌藥品生產(chǎn)中的主要污染源，在管理比較到位。 生產(chǎn)設(shè)備自動(dòng)化程度較好，操作人員素質(zhì)較高的企業(yè)， 人員操作所致的污染率超過70%。 l 具微生物專業(yè)知識(shí) l 經(jīng)無菌技術(shù)培訓(xùn) l 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果能進(jìn)行充分全面的評(píng)價(jià)。 其它重要影響因素 藥品本身的抑菌性； 培養(yǎng)基的促菌生長(zhǎng)能力； 培養(yǎng)條件（溫度、濕度及需氧或厭氧）； 過濾系統(tǒng)的材質(zhì) 檢驗(yàn)的進(jìn)展 強(qiáng)調(diào)檢驗(yàn)的過程控制，提高檢出率，保證檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

27、人員的要求 環(huán)境、設(shè)施要求 培養(yǎng)基適用性 檢驗(yàn)數(shù)量 方法驗(yàn)證 培養(yǎng)時(shí)間 試驗(yàn)用菌 全封閉過濾培養(yǎng)器、隔離系統(tǒng) 檢驗(yàn)結(jié)果的保證 l 要求有一個(gè)取樣計(jì)劃來涵蓋整個(gè)批號(hào) l 有足夠的取樣量和檢驗(yàn)量 l 選擇適用的培養(yǎng)基 l 采用經(jīng)驗(yàn)證的無菌檢驗(yàn)方法 l 良好的環(huán)境監(jiān)控 l 人員保證 無菌檢查 無菌檢查 l 定義： p無菌原料藥是指法定藥品標(biāo)準(zhǔn)中列有無菌檢查項(xiàng)目的制劑和原 料藥，包括無菌制劑和無菌原料藥。 p無菌檢查是檢查要求無菌的藥品、醫(yī)療器具、原料、輔料以及 要求無菌的其他物品是否染有活菌的一種方法。 l 符合無菌檢查法的規(guī)定僅表明了供試品在該檢驗(yàn)條件下 未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和真菌污染。 l 無菌檢查法建立

28、在批產(chǎn)品受微生物污染是均勻的假設(shè)上 （其實(shí)非均勻）。無菌檢出低污染的概率極低的。因此， 無菌檢查存在風(fēng)險(xiǎn)和局限性。 無菌檢查的局限性 l 無法對(duì)整批產(chǎn)品進(jìn)行100%檢驗(yàn) l 只進(jìn)行細(xì)菌和真菌的檢驗(yàn) l 培養(yǎng)基 l 培養(yǎng)條件（如溫度和時(shí)間）是有限的 l 我們的工作環(huán)境及操作是在相對(duì)無菌的狀態(tài)。 無菌檢查：注射劑、植入劑、部分外用藥 l 鼻用制劑：用于手術(shù)或創(chuàng)傷的鼻用制劑。 l 凝膠劑：用于嚴(yán)重創(chuàng)傷的凝膠劑。 l 乳膏劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的乳膏劑。 新增的無菌檢查中藥制劑 l 散劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的外用散劑。 l 鼻用制劑：用于嚴(yán)重創(chuàng)傷的鼻用制劑。 l 眼用制劑：用于傷口的眼用制劑。 l 軟

29、膏劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的乳膏劑。 l 氣霧劑、噴霧劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的氣霧劑、噴霧 劑。 GMP取樣 取樣注意事項(xiàng)，包括為降低取樣過程產(chǎn)生的各種風(fēng)險(xiǎn)所采取的預(yù)防 措施，尤其是無菌或有害物料的取樣以及防止取樣過程中污染和交 叉污染的注意事項(xiàng)； 在生產(chǎn)的每一階段，應(yīng)當(dāng)保護(hù)產(chǎn)品和物料免受微生物和其他污染。 附錄1無菌藥品 質(zhì)量控制 第八十條 無菌檢查的取樣計(jì)劃應(yīng)當(dāng)根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果制定，樣品 應(yīng)當(dāng)包括微生物污染風(fēng)險(xiǎn)最大的產(chǎn)品。無菌檢查樣品的取樣至少應(yīng) 當(dāng)符合以下要求： （一）無菌灌裝產(chǎn)品的樣品必須包括最初、最終灌裝的產(chǎn)品以及灌 裝過程中發(fā)生較大偏差后的產(chǎn)品； （二）最終滅菌產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)從可能的滅菌冷

30、點(diǎn)處取樣； （三）同一批產(chǎn)品經(jīng)多個(gè)滅菌設(shè)備或同一滅菌設(shè)備分次滅菌的，樣 品應(yīng)當(dāng)從各個(gè)/次滅菌設(shè)備中抽取。 一般隨機(jī)抽樣，保證樣品的代表性和原始性，復(fù)試樣品應(yīng)盡量重現(xiàn) 原取樣。 注意事項(xiàng) 只要供試品的性狀允許，應(yīng)采用薄膜過濾法（首選） 只要供試品的性狀允許（溶解性、抑菌性），應(yīng)將所有容器內(nèi)的全 部?jī)?nèi)容物過濾 驗(yàn)證用供試品用最大量 陽性對(duì)照分開培養(yǎng) 大腸埃希菌代替銅綠假單胞菌（G+敏感，保證結(jié)果有效） 無菌檢測(cè)14天（補(bǔ)償生長(zhǎng)條件、潛在的低生長(zhǎng)者、修復(fù)受損細(xì)胞） 優(yōu)先選用密閉式過濾器，或一次性過濾器 濾膜材質(zhì)（抗用低吸附），濾膜的完整性，沖洗量。 直接法接種供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，每

31、管裝量硫乙 醇酸鹽流體培養(yǎng)基不少于15ml，改良馬丁培養(yǎng)基不少于10ml，可用 濃縮培養(yǎng)基，或增加培養(yǎng)容器數(shù)。 結(jié)果判斷 l 陽性管生長(zhǎng)良好，陰性管不得長(zhǎng)菌，否則試驗(yàn)無效。 l 以一次檢出為準(zhǔn)，不得復(fù)試。（低檢出率，實(shí)驗(yàn)環(huán)境、條 件改善 l 當(dāng)符合下列至少一個(gè)條件時(shí)，方可判試驗(yàn)結(jié)果無效； 無菌檢查試驗(yàn)所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物 監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求。 回顧無菌試驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)有可能引起微 生物污染的因素。 陰性對(duì)照管有菌生長(zhǎng)。 供試品管中生長(zhǎng)的微生物經(jīng)鑒定后，確認(rèn) 是因無菌試驗(yàn)中所使用的物品和（或）無 菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。 結(jié)果保證 有效的結(jié)果 可靠的結(jié)論 培養(yǎng)基保證 結(jié)果判斷 SO

32、P操作 人 方法驗(yàn)證的一般程序與環(huán)節(jié) 需前處理 不需前處理 有抑菌作用樣品 無抑菌作用 去除抑菌作用 檢查 驗(yàn)證前處理方法對(duì)污染菌生長(zhǎng)、檢出的影響。 可以通過驗(yàn) 證實(shí)驗(yàn)判斷 驗(yàn)證抑菌活性去除的 有效性，以及去除方法 對(duì)污染菌生長(zhǎng)、檢出的 影響。 無菌檢查驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)： 供試 品 直接 接種 法 薄膜 過濾 法 100ml /筒 試驗(yàn)組（供試品 +菌） 金黃色葡萄球菌、 銅綠假單胞菌、 大腸、枯草桿菌、 生孢梭菌、白色念 珠菌、黑曲霉 培養(yǎng)基 對(duì)照組 陽性菌 對(duì)照組 （加菌同 試驗(yàn)組） 規(guī)定T培 養(yǎng)35天 觀察 結(jié)果 書寫驗(yàn)證 報(bào)告 稀釋劑 對(duì)照組 微生物限度檢查 微生物限度檢查：口服、外用 l 控

33、制項(xiàng)目 雜菌數(shù)：細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)。 控制菌（致病菌）：大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌、金黃色葡 萄球菌、銅綠假單胞菌、梭菌、白色念珠菌。 l 制定原則：非無菌藥品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)是基于藥品的給 藥途徑及對(duì)患者潛在的危害而制定的。 l 依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)檢查控制菌 l 不含藥材原粉的制劑 l 含藥材原粉的制劑：丸劑 l 含動(dòng)物藥的制劑 l 外用制劑 滴眼劑 一般局部用藥 直腸給藥制劑 尿道、陰道給藥制劑 滴鼻劑 l 不同制劑的限度 注意事項(xiàng) l采用稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供 試品的抑菌活性 l供試液從制備到加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基不得超過1小時(shí) l供試液制備若需用

34、水浴加溫時(shí)，溫度不應(yīng)超過45 l供試品須符合微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，應(yīng)采用使微生物生長(zhǎng)的更高稀釋級(jí)進(jìn)行 驗(yàn)證。（10-3，1000） l無合適方法消除抑菌性的檢驗(yàn)方法，選擇回收率更接近要求的方法和條件應(yīng)對(duì)生產(chǎn)工藝 和產(chǎn)品特性進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和產(chǎn)品質(zhì)量。 l報(bào)告規(guī)則（平均數(shù)，300cfu） l培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間變化 l檢驗(yàn)量（中藥膜劑，沙門菌） l樣品稀釋級(jí)的選擇（驗(yàn)證） l離心法500轉(zhuǎn)/分，3分鐘（中藥混懸劑重新驗(yàn)證，只適用細(xì)菌） l控制菌-培養(yǎng)基的適用性（促生長(zhǎng)能力、指標(biāo)能力和抑制能力）參照培養(yǎng)基（比較菌 落形態(tài)、大小、指標(biāo)劑反應(yīng)、生長(zhǎng)速度）最長(zhǎng)（抑）、最短（生）培

35、養(yǎng)時(shí)間。 l疑似菌確認(rèn)，選擇認(rèn)可的菌種鑒定方法，陽性對(duì)照試驗(yàn)至少進(jìn)行到分離的步驟。 微生物限度檢查法驗(yàn)證 l 細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證 定量回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn) l 控制菌檢查方法驗(yàn)證 定性能否生長(zhǎng)、專屬性實(shí)驗(yàn) 回收率計(jì)算 試驗(yàn)組的菌回收率=（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品組平均菌落 數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù)100% 稀釋級(jí)對(duì)照組的菌回收率=（稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)/菌 液組的平均菌落數(shù)）100% 在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組、試驗(yàn)組的回收率均 不低于70%，若任一次試驗(yàn)中回收率低于70，應(yīng)重新選擇方 法再驗(yàn)證。 方法驗(yàn)證：控制菌 l 控制菌：大腸埃希菌，銅綠假單胞菌、沙門菌、大腸菌群、

36、生孢梭菌 l 計(jì)數(shù)方法：平皿法、薄膜過濾法。特殊：生孢梭菌（加菌 量：10100cfu，只要求生長(zhǎng)不要求回收率 l 制定原則：非無菌藥品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)是基于藥品的給 藥途徑及對(duì)患者潛在的危害而制定的。 l 依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)檢查控制菌 原料藥/賦形劑量微生物檢查 微生物能否在原料或賦 形劑中生長(zhǎng)或存活？ 提供支持?jǐn)?shù)據(jù)，不必做微生物限度 檢查和制定認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn) 原料或賦形劑是否無菌？ 不需進(jìn)一步做微生物限度檢查法或 制定認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn) 原料/賦形劑合成/工藝相關(guān) 步驟本身是否會(huì)減少微生物 按照協(xié)議后藥典各論制訂微生物限 度認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn) 按照協(xié)議后藥典各論制 訂微生物限度認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn) 逐批檢查微生物限度和 指示菌 抽批檢驗(yàn)

37、微生物限度和 指示菌 是否有科學(xué)證明減少 步驟會(huì)造成原料/輔料 中微生物量認(rèn)可限度 （未檢出覺指示菌）？ 提供支持?jǐn)?shù)據(jù)，不必做微生物限度 檢查和制訂認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn) 所監(jiān)控的微生物量/指示菌 量是否都低于規(guī)定限度？ 是 否 是 是 是 否 是 是 非無菌制劑的微生物檢查 制劑中是否含防腐劑或本 身是否有抗微生物能力？ 制訂防腐劑認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)和認(rèn)證在低于或等 于指定的最小防腐劑濃度時(shí)是否有效， 并證明制劑本身的抗微生物能力 逐批進(jìn)行微生物限度實(shí)驗(yàn) 按照協(xié)議后藥典各論制訂微生物限 度認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn) 不必做微生物限度檢查 和制訂認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn) 是否每批都符合微生 物限度標(biāo)準(zhǔn)？ 提供支持?jǐn)?shù)據(jù)，不必做微生物限度 檢查和制訂認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn) 是 否 是 否 是 制劑是否為固