高效液相色譜法測定化妝品中四種雌激素

1、第 34 卷 第12 期宜春學(xué)院學(xué)報(bào)Vol. 34，No.122012 年 12月Journal of Yichun CollegeDec. 2012高效液相色譜法測定化妝品中四種雌激素余曉，袁凱松，翟海云，盧綺雯，潘育方*( 廣東藥學(xué)院 物分析系，廣東 廣州 510006)摘 要: 目的: 建立反相高效液相色 法同時(shí)測定化 品中的 4 種雌激素 ( 雌 、雌三醇、炔雌醇、己 雌酚) 的方法。方法: 色 柱 Inertsil ODS C18( 4. 6 mm 250 mm，5 m) ，流 相為甲醇 水( 體 比為 60: 40) ，流速1mL /min，檢測波長279nm，柱溫:25 。結(jié)果:

2、 4 種雌激素成分在 0. 05 500 g /mL 度范 內(nèi)與其對應(yīng)分峰面 性關(guān)系良好。 品的平均加 回收率為 97. 3% 110. 6% ，RSD 為 2. 9% 4. 0% ，化 品中四種雌激素的檢出限 0. 02 0. 03mg /kg。 方法操作 便、靈敏度高，能 同時(shí) 化 品中 4 種雌性激素的含量。關(guān)鍵詞: 高效液相色 法; 雌激素; 化 品中圖分類號(hào): TQ658文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號(hào): 1671 380X ( 2012) 12 0091 03Determination of Four Female Sex Hormone in Cosmetics by HPLCYU Xi

3、ao，YUAN Kai song，ZHAI Hai yun，LU Qi wen，PAN Yu fang*( Guangdong College of Pharmacy，Guangzhou 510006，China)Abstract: Object: To establish the RP HPLC method for the simultaneous determination of four female sex hormones ( estrone，es-triol，ethiny，diethylstilbestrol) in cosmetics. Method: The Intersil

4、 ODS C18 ( 4. 6 mm 250 mm，5 m) column was used; themobile phase consisted of methanol water ( 60: 40) ; the flow rate was 1. 0mL /min and the detection wavelength was at 279 nm; thecolumn temperature was at25. Result: Four hormones showed good linear response in the range of 0. 05 500 g /mL，LOD were

5、0. 02 0. 03mg /kg. The average recoveries were97. 3 110. 6% ，and RSD were2. 9 4. 0% . Conclusions: The results indicate that the method is simple，sensitive and can be used for the quality control of four hormones in cosmetics.Key words: HPLC; Female Sex Hormone; Cosmetics近年來，化妝品安全問題日益引起人們關(guān)注。對人體分離條件進(jìn)

6、行了比較研究，建立了高效液相色譜法同時(shí)測定有害的物質(zhì)被禁止或限用于化妝品生產(chǎn)。我國化妝品衛(wèi)生四種雌激素成分的方法。方法重現(xiàn)性好，目標(biāo)物之間分離效規(guī)范 ( 2007 版) 1 共列出 1208 種禁用物質(zhì)、73 種限用物果好，靈敏度高，可應(yīng)用于各種類型化妝品中雌酮、雌三質(zhì)，這些物質(zhì)一般具有強(qiáng)烈的毒性、致突變性、致癌性、醇、炔雌醇、己烯雌酚四種雌激素的同時(shí)檢測。致畸性，或?qū)ζつw、粘膜可造成明顯損傷。其中，該規(guī)范1 試藥與儀器明確規(guī)定了性激素為化妝品中禁用物質(zhì)。但由于在化妝品高效液相色譜儀 ( 島津 LC 10ATvp 型輸液泵，島津中添加性激素能夠快速促進(jìn)毛發(fā)生長，防止皮膚老化，并SCL 10Av

7、p 型控制器，PAD 檢測器，島津 LC Solution 色譜有除皺、增加皮膚彈性或治療粉刺等作用，故常被非法添工作站) 、超聲儀 ( 昆山市超聲儀器有限公司) 、離心機(jī)加到各類化妝品中，而這些含雌激素化妝品的長久使用會(huì)( 鞏義市予華儀器有限公司) 、數(shù)控恒溫水浴鍋 ( 北京康林導(dǎo)致皮膚色素沉積、產(chǎn)生黑斑、皮膚萎縮變薄，甚至具有科技有限責(zé)任公司) 、電子分析天平、0. 45m 微孔濾膜及致癌性，如雌性激素化妝品已有報(bào)道致細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜配套注射器。2 5，對廣大消費(fèi)者甲醇為色譜純試劑 ( Dima 公司) ，水為超純水，其余癌、乳腺癌、睪丸癌和兒童性早熟等的健康產(chǎn)生巨大的潛在威脅。試劑均為分

8、析純。雌三醇對照品 ( 批號(hào) 100935 200701) 、6，分光光炔雌醇對照品 ( 批號(hào) 100052 200308) 、雌酮對照品 ( 批化妝品中性激素分析技術(shù)主要有薄層色譜法789 10，號(hào) 100849 200501 ) 、己烯雌酚對照品 ( 批號(hào) 100033 度法、氣相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜法11等。本文對多種不同類型化妝品的前處理、色譜200607) ，均購于中國藥品生物制品檢定所。電色譜收稿日期: 2012 09 12基金項(xiàng)目: 廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目 ( 2011B04030025) 。作者簡介: 余曉 ( 1972 ) ，男，博士，湖北人，講師，從事現(xiàn)代儀器分析技術(shù)

9、的教學(xué)與應(yīng)用研究; 通訊作者: * 潘育方 ( 1966 ) ，男，教授，從事藥物新劑型及安全性評價(jià)研究。91第 12 期宜春學(xué)院學(xué)報(bào)第 34 卷2 方法與結(jié)果2. 1 色譜條件色譜柱: Inertisl ODS C18 柱 ( 4. 6 250mm，5m) ，流動(dòng)相為甲醇 水 ( 體積比為 60: 40) ; 流速為 1mL /min，柱溫為 25 ，PDA 檢測器，檢測波長為 279nm，進(jìn)樣量為20L。樣品測定采用色譜峰的保留時(shí)間定性，并以紫外吸收光譜圖輔助定性，外標(biāo)法峰面積定量。此條件下，四種對照品、樣品的色譜圖見圖 1 2。1. 雌三醇; 2. 雌 ; 3. 炔雌醇; 4. 己 雌酚

10、圖 1 4 種激素標(biāo)準(zhǔn)品混合物的色譜圖2. 2 對照品和供試品溶液的制備分別稱取雌三醇、雌酮、炔雌醇、己烯雌酚對照品各2mg，置于 1mL 容量瓶中，分別用甲醇溶解并定容，配成質(zhì)量濃度各為 2mg /mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取上述各標(biāo)準(zhǔn)溶液適量到一系列 5mL 容量瓶中，用甲醇定容，配成一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別稱取 ( 膏狀、乳膏狀和水)化妝品試樣 1. 000g 于10. 0mL 具塞離心管中。每個(gè)試樣均準(zhǔn)確加 8. 0mL 甲醇，超聲提取 30min，于 3000r /min 轉(zhuǎn)速下離心 15min。轉(zhuǎn)移上清液于 10. 0mL 具塞離心管中，氮?dú)獯蹈?。?3. 0mL 甲醇超聲

11、 10min 溶解殘?jiān)?，溶解后轉(zhuǎn)至 5. 0mL 離心管中，繼續(xù)用氮?dú)獯蹈?。濃縮后用 1. 0mL 甲醇溶解，經(jīng) 0. 45m 微孔濾膜過濾，濾液供測定用。2. 3 線性關(guān)系及檢出限在設(shè)定色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為 0. 05 500g /mL，分別取 20L 進(jìn)行 HPLC 分析。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明四種雌激素均在 0. 05 500 g /mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于 0. 9999，得到各標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程和檢出限 ( S /N = 3) 如表 1 所示。表 14 種雌激素的回歸方程和相關(guān)系數(shù)雌激素回歸方程rLOD( mg /kg

12、)雌三醇Y = 8019X+ 10641. 00000. 020雌酮Y = 4651X+ 2790. 99990. 030炔雌醇Y = 7524X 5910. 99990. 025己烯雌酚Y = 21330X 13351. 00000. 0302. 4 精密度試驗(yàn)用濃度為 20 g /mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣 6 次，分別測定四種雌激素的峰面積，并計(jì)算出相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 2. 3 3. 8% 。2. 5 加樣回收率試驗(yàn)準(zhǔn)確稱取不同種類的不含雌激素的化妝品樣品 1. 000g，平行 6 份，分別添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分混勻后按照2. 2 項(xiàng)下制備供試品溶液，按色譜條件進(jìn)行測定，見圖 2( B

13、) 。雌三醇、雌酮、炔雌醇和己烯雌酚的平均回收率分別為 101. 8 110. 3% 、97. 3 105. 7% 、99. 1 106. 2% 和98. 1 110. 6，RSD 分別為 3. 9% 、3. 2% 、2. 9 和 4. 0% 。2. 6 樣品分析按本方法對祛痘、護(hù)膚、美白、清潔等類別的 9 種化妝品進(jìn)行了分析測定。用保留時(shí)間和檢出峰的光譜圖進(jìn)行定性分析，9 種化妝品均未檢出雌激素。從樣品分離色譜圖 2 可見樣品經(jīng)前處理后，化妝品基質(zhì)對雌激素的檢出無干擾。1. 雌三醇; 2. 雌 ; 3. 炔雌醇; 4. 己 雌酚圖 2化妝品樣品( A) 和加標(biāo)樣品( B) 的色譜圖3 討論3

14、. 1 樣品預(yù)處理實(shí)驗(yàn)曾嘗試采用中國化妝品衛(wèi)生品規(guī)范中的方法對各化1妝品樣品中的雌激素進(jìn)行提取 。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)提取過程中容易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，影響離心分離。且操作步驟較為復(fù)雜，結(jié)果的重現(xiàn)性較差。本實(shí)驗(yàn)選取甲醇作為溶劑處理化妝品樣品，在處理過程中樣品未出現(xiàn)類似的乳化現(xiàn)象，可順利進(jìn)行離心分離處理。此方法簡單易行，又避免操作過程中待測目標(biāo)物的損失，提取回收率較高。本方法能實(shí)現(xiàn)水劑、凝膠、膏劑和乳膏劑 4 種類型化妝品的預(yù)處理。9293第 12 期余 曉，袁凱松，翟海云，等: 高效液相色譜法測定化妝品中四種雌激素第 34 卷3. 2 色譜條件的選擇4 Waring RH，Harris RM. Endocrin

15、e disrupters: A human比較了不同流動(dòng)相對各雌激素成分分離的影響。實(shí)驗(yàn)risk? J. Mol Cell Endocrinol，2005，244( 112) : 2 9發(fā)現(xiàn)用甲醇 水流動(dòng)相體系比乙腈 水流動(dòng)相體系更有助5 Massart F，Parrino R，Seppia P，et al. How do environmental于雌三醇在色譜柱上的保留。比較了不同比例甲醇 水流estrogen disruptors induce precocious puberty? J. Miner-動(dòng)相對分析的影響，結(jié)果表明甲醇 水比例為 60 40 的條va Pediatr，200

16、6，58( 3) : 247 554件下，各組分即可達(dá)到很好的分離。流速大小直接影響柱6 王敏榮，單琴 . 薄層層析法測定化妝品中部分雌性激素及系統(tǒng)的壓力、各組分分離度及洗脫時(shí)間。在流動(dòng)相為甲J. 中國公共衛(wèi)生，1997，13( 12) : 749 750醇: 水 ( 體積比為 60 40 ) 條件下，考察了不同流速:7 劉軍 . 分光光度法測定化妝品中甾體激素含量J. 中0. 6、0. 8、1. 0、1. 2、1. 4 mL /min 對分離的影響，發(fā)現(xiàn)隨國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2000，10( 5) : 571 572著流速變慢，各組分的分離度加大，但保留時(shí)間延長。實(shí)8 吳維群，沈朝燁，楊玉林，等

17、 . GC MS 聯(lián)用技術(shù)檢測水驗(yàn)選擇流速為 1. 0mL /min，該條件下峰形較好及分離度較性化妝品中性激素成分的方法研究J. 環(huán)境與職業(yè)醫(yī)大，且出峰時(shí)間適宜。學(xué)，2004，21( 4) : 307 309參考文獻(xiàn):9 鹿毅，楊濤，張煌濤，等 . 高效液相色譜法同時(shí)測定化妝1 化妝品衛(wèi)生規(guī)范S. 北京: 中華人民共和國衛(wèi)生部，品中 9 種激素J. 光譜實(shí)驗(yàn)室，2010，27( 1) : 224 2292007，22010張亞增，徐衛(wèi)紅 . 高效液相色譜法測定化妝品中的雌二2 鄭星泉 . 化妝品衛(wèi)生檢驗(yàn)M. 天津: 天津大學(xué)出版醇和雌酮J. 實(shí)用醫(yī)技雜志，2004，11( 7) : 1159

18、社，1994，21911杭棟，汪小婭，倪鑫炯，等 . 鼠李糖脂應(yīng)用于微乳毛細(xì)管3 趙辨 . 臨床皮膚病學(xué)M. 南京: 江蘇科學(xué)技術(shù)出版電動(dòng)色譜快速測定化妝品中激素類物質(zhì)J. 分析化社，2001，935 936學(xué)，2011，39( 2) : 168 172( 上接第 84 頁)或抗體與漢坦病毒抗體 IgM 存在交叉反應(yīng)，甚至一3 討論些年齡較大的患者或患有結(jié)核、傷寒、梅毒的患者腎綜合征出血熱 ( HFRS) 又稱為流行性出血檢測漢坦病毒抗體 IgM 時(shí)也存在交叉反應(yīng)，而用熱，是一類以發(fā)熱、出血和腎功能損傷為特征的急PCR 檢測 HTV RNA 則未發(fā)現(xiàn)上述問題。性傳染病，病死率為 0. 1% 1

19、0. 0% ，廣泛流行于本次檢測的靈敏度 92. 65% 、特異性 100% 、2。依據(jù)臨床特陽性預(yù)測值 100% 、陰性預(yù)測值 95. 82% 、診斷有亞歐等許多國家，我國為重疫區(qū)征性癥狀和體征，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢查，參考流行病學(xué)效率 97. 26% ，均表明 HTV RNA PCR 檢測方法史進(jìn)行診斷，臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、休克、充血出是一項(xiàng)能夠滿足臨床用于腎綜合征出血熱診斷的血和急性腎衰竭，感染 HTV 2 4 天后可在血清中實(shí)驗(yàn)室檢測方法，HTV RNA 可以作為腎綜合征3。目前實(shí)驗(yàn)室特異性出血熱診斷的特異性診斷指標(biāo)，HTV RNA PCR檢出 IgM，7 10 天達(dá)高峰診斷主要是 ELISA 法或免疫熒光法檢測漢坦病毒檢測對于臨床診斷腎綜合征出血熱具有重要的臨床意義?？贵w IgM，缺乏其他特異性的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，PCR 檢測 HTV RNA 是直接檢測病毒 RNA，應(yīng)而參考文獻(xiàn):1 王大虎，董智強(qiáng)，王玉林，等 . 廣州流行性出血熱流行具有靈敏高，特異性強(qiáng)，只要檢測到就可證明有感趨勢分析J. 醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制