15、16第八章微生物遺傳.ppt

第八章微生物遺傳與變異,遺傳:,親代與子代相似.,變異:,親代與子代、子代間不同個(gè)體不完全相同.,遺傳(inheritance)和變異(variation)是生命的最本質(zhì)特性之一,遺傳型:,表型(表現(xiàn)型):,生物的全部遺傳因子及基因,具有一定遺傳型的個(gè)體,在特定環(huán)境條件下通過生長(zhǎng)發(fā)育所表現(xiàn)出的形態(tài)等生物學(xué)特征的總和.,表型是由遺傳型所決定,但也和環(huán)境有關(guān)。,微生物是遺傳學(xué)研究中的明星：,微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,營(yíng)養(yǎng)體一般為單倍體，方便建立純系。,很多常見微生物都易于人工培養(yǎng),快速、大量生長(zhǎng)繁殖。,對(duì)環(huán)境因素的作用敏感,易于獲得各類突變株，操作性強(qiáng)。,微生物是研究現(xiàn)代遺傳學(xué)和其它許多主要的生物學(xué)基本理論問題中最熱衷的研究對(duì)象。對(duì)微生物遺傳規(guī)律的深入研究，不僅促進(jìn)了現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物工程學(xué)的發(fā)展，而且為育種工作提供了豐富的理論基礎(chǔ)，促使育種工作從不自覺到自覺、從低效到高效、從隨機(jī)到定向、從近緣雜交到遠(yuǎn)緣雜交的方向發(fā)展。,研究微生物遺傳學(xué)的意義,第一節(jié)遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),一、DNA作為遺傳物質(zhì),二、RNA作為遺傳物質(zhì),三、朊病毒的發(fā)現(xiàn)與思考,一、DNA作為遺傳物質(zhì),（一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（transformation）：1928,F.Griffith，研究對(duì)象：Streptococcuspneumoniae（肺炎鏈球菌）SIII型菌株：有莢膜，菌落表面光滑，有致病性RII型菌株：無莢膜，菌落表面粗糙，無致病性,1928年，Griffith進(jìn)行了以下幾組實(shí)驗(yàn)：（1）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠注射活RII菌或死SIII菌小鼠存活對(duì)小鼠注射活SIII菌小鼠死亡對(duì)小鼠注射活RII菌和熱死SIII菌小鼠死亡抽取心血分離活的SIII菌,（2）細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),（3）S型菌的無細(xì)胞抽提液試驗(yàn),以上實(shí)驗(yàn)說明：加熱殺死的SIII型細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)可能存在一種轉(zhuǎn)化物質(zhì)，它能通過某種方式進(jìn)入RII型細(xì)胞并使RII型細(xì)胞獲得穩(wěn)定的遺傳性狀，轉(zhuǎn)變?yōu)镾III型細(xì)胞。,熱死SIII菌不生長(zhǎng)活RII菌長(zhǎng)出RII菌熱死SIII菌長(zhǎng)出大量RII菌和10-6SIII菌,活R菌+S菌無細(xì)胞抽提液長(zhǎng)出大量R菌和少量S菌,+活RII菌,平皿培養(yǎng),加S菌DNA加S菌DNA及DNA酶以外的酶加S菌的DNA和DNA酶加S菌的RNA加S菌的蛋白質(zhì)加S菌的莢膜多糖,活R菌,長(zhǎng)出S菌,只有R菌,1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty在離體條件下進(jìn)行了轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：,只有S型細(xì)菌的DNA才能將S.pneumoniae的R型轉(zhuǎn)化為S型。且DNA純度越高，轉(zhuǎn)化效率也越高。說明S型菌株轉(zhuǎn)移給R型菌株的，是遺傳因子。,（二）噬菌體感染實(shí)驗(yàn),A.D.Hershey和M.Chase，1952年,（1）含32P-DNA的一組：放射性85%在沉淀中,上清液中含15%放射性,沉淀中含85%放射性,沉淀中含25%放射性,以32S標(biāo)記蛋白質(zhì)外殼做噬菌體感染實(shí)驗(yàn),（2）含35S-蛋白質(zhì)的一組：放射性75%在上清液中,上清液中含75%放射性,為了證明核酸是遺傳物質(zhì)，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的煙草花葉病毒（TMV）進(jìn)行了著名的植物病毒重建實(shí)驗(yàn)。,二、RNA作為遺傳物質(zhì),MTVHRV,HRVMTV,用兩種雜合病毒感染寄主：（1）表現(xiàn)TMV的典型癥狀病分離到正常TMV粒子（2）表現(xiàn)HRV的典型癥狀病分離到正常HRV粒子。上述結(jié)果說明，在RNA病毒中，遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)也是核酸。,三、朊病毒的發(fā)現(xiàn)與思考,亞病毒的一種:具有傳染性的蛋白質(zhì)致病因子,迄今為止尚為發(fā)現(xiàn)該蛋白內(nèi)含有核酸。,其致病作用是因動(dòng)物體內(nèi)正常的蛋白質(zhì)PrPc改變折疊狀態(tài)為PrPsc所致,而這二種蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)并沒有改變.,1）蛋白質(zhì)是否可以作為遺傳物質(zhì)？prion是生命的一個(gè)特例？還是僅僅為表達(dá)調(diào)控的一種形式？,2）蛋白質(zhì)折疊與功能的關(guān)系,是否存在折疊密碼？,第二節(jié)微生物的遺傳物質(zhì),一、概念,基因組（genome）:一個(gè)物種的單倍體的所有染色體及其所包含的遺傳信息的總稱.,原核生物(如細(xì)菌),多為單倍體(在一般情況下只有一條染色體)真核微生物,多條染色體,例如啤酒酵母有16條染色體.有時(shí)為雙倍體,二、微生物基因組結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),1、原核生物(細(xì)菌、古生菌)的基因組,1)染色體為雙鏈環(huán)狀的DNA分子(單倍體);,鏈環(huán)狀的染色體在細(xì)胞中以緊密纏繞成的較致密的不規(guī)則小體形式存在于細(xì)胞中,該小體稱為擬核(nucliod),其上結(jié)合有類組蛋白蛋白質(zhì)和少量RNA分子,使其壓縮成一種手腳架形的致密結(jié)構(gòu)。,1)染色體為雙鏈環(huán)狀的DNA分子(單倍體);,2)基因組上遺傳信息具有連續(xù)性;,基因數(shù)基本接近由它的基因組大小所估計(jì)的基因數(shù),參見表8-1(通常以1000bp1500bp為一個(gè)基因進(jìn)行計(jì)算),微生物基因組DNA絕大部分用來編碼蛋白質(zhì)、RNA;用作為復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、終止子和一些由調(diào)節(jié)蛋白識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)等信號(hào)序列。,一般不含內(nèi)含子,遺傳信息是連續(xù)的而不是中斷的。,個(gè)別細(xì)菌(鼠傷寒沙門氏菌和犬螺桿菌)和古生菌的rRNA和tRNA中也發(fā)現(xiàn)有內(nèi)含子或間插序列,1)染色體為雙鏈環(huán)狀的DNA分子(單倍體);,2)基因組上遺傳信息具有連續(xù)性;,3)功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因組成操縱子結(jié)構(gòu);,4)結(jié)構(gòu)基因的單拷貝,rRNA基因的多拷貝;,5)基因組的重復(fù)序列少而短.,古生菌的基因組在結(jié)構(gòu)上類似于細(xì)菌.但是信息傳遞系統(tǒng)(復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯)則與細(xì)菌不同而類似于真核生物。,操縱子(operon):功能相關(guān)的幾個(gè)基因前后相連,再加上一個(gè)共同的調(diào)節(jié)基因和一組共同的控制位點(diǎn)（啟動(dòng)子、操作子等）在基因轉(zhuǎn)錄時(shí)協(xié)同動(dòng)作。,2、真核微生物（啤酒酵母）的基因組,1）典型的真核染色體結(jié)構(gòu)；,2）沒有明顯的操縱子結(jié)構(gòu)；,啤酒酵母基因組大小為13.5106bp，分布在16條染色體中。,3）有間隔區(qū)（即非編碼區(qū)）和內(nèi)含子序列；,4）重復(fù)序列多；,三、質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座因子,質(zhì)粒（plasmid）：,一種獨(dú)立于染色體外,能進(jìn)行自主復(fù)制的細(xì)胞質(zhì)遺傳因子,主要存在于各種微生物細(xì)胞中。,轉(zhuǎn)座因子（transposableelement）：,位于染色體或質(zhì)粒上的一段能改變自身位置的DNA序列,廣泛分布于原核和真核細(xì)胞中。,質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座因子是細(xì)胞中除染色體以外的另外二類遺傳因子,一）、質(zhì)粒的分子結(jié)構(gòu),1、結(jié)構(gòu),通常以共價(jià)閉合環(huán)狀(covalentlyclosedcircle,簡(jiǎn)稱CCC)的超螺旋雙鏈DNA分子存在于細(xì)胞中,質(zhì)粒分子的大小范圍從1kb左右到1000kb（細(xì)菌質(zhì)粒多在10kb以內(nèi)）,有三種結(jié)構(gòu)類型,CCC、開環(huán)和線型,2、質(zhì)粒的類型,嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒(stringentplasmid)：復(fù)制行為與核染色體的復(fù)制同步，低拷貝數(shù)松弛型質(zhì)粒(relaxedplasmid)：復(fù)制行為與核染色體的復(fù)制不同步，高拷貝數(shù),二）、質(zhì)粒的主要類型,在某些特殊條件下,質(zhì)粒有時(shí)能賦予宿主細(xì)胞以特殊的機(jī)能,從而使宿主得到生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。,質(zhì)粒所含的基因?qū)λ拗骷?xì)胞一般是非必需的；,質(zhì)粒所編碼的功能和賦予宿主的表型效應(yīng),致育因子(Fertilityfactor,F因子)抗性因子(Resistancefactor,R因子)產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒(Bacteriocinproductionplasmid)毒性質(zhì)粒(virulenceplasmid)代謝質(zhì)粒(Metabolicplasmid)隱秘質(zhì)粒(crypticplasmid),1、致育因子(Fertilityfactor，F(xiàn)因子),又稱F質(zhì)粒,其大小約100kb,這是最早發(fā)現(xiàn)的一種與大腸桿菌的有性生殖現(xiàn)象(接合作用)有關(guān)的質(zhì)粒。,攜帶F質(zhì)粒的菌株稱為F+菌株(相當(dāng)于雄性),無F質(zhì)粒的菌株稱為F-菌株(相當(dāng)于雌性).,F因子能以游離狀態(tài)(F+)和以與染色體相結(jié)合的狀態(tài)(Hfr)存在于細(xì)胞中,所以又稱之為附加體(episome)。,2、抗性因子(Resistancefactor,R因子),包括抗藥性和抗重金屬二大類,簡(jiǎn)稱R質(zhì)粒。,抗性質(zhì)粒在細(xì)菌間的傳遞是細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一。,R因子由相連的兩個(gè)DNA片段組成，即抗性轉(zhuǎn)移因子（resistencetransforfactor，RTF）和抗性決定R因子（r-determinant），RTF為分子量約為11106Dalton，控制質(zhì)粒copy數(shù)及復(fù)制，抗性決定質(zhì)粒大小不固定，從幾百萬到100106Dalton以上。其上帶有其它抗生素的抗性基因。,3、產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒（Bacteriocinproductionplasmid）,細(xì)菌素一般根據(jù)產(chǎn)生菌的種類進(jìn)行命名：,大腸桿菌（E.coli）產(chǎn)生的細(xì)菌素為colicins（大腸桿菌素），而質(zhì)粒被稱為Col質(zhì)粒。,由G+細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)菌素或與細(xì)菌素類似的因子與colicins有所不同，但通常也是由質(zhì)粒基因編碼，有些甚至有商業(yè)價(jià)值，例如一種乳酸細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)菌素NisinA能強(qiáng)烈抑制某些G+細(xì)菌的生長(zhǎng)，而被用于食品工業(yè)的保藏。,4、毒性質(zhì)粒（virulenceplasmid）,許多致病菌的致病性是由其所攜帶的質(zhì)粒引起的,這些質(zhì)粒具有編碼毒素的基因,其產(chǎn)物對(duì)宿主(動(dòng)物、植物)造成傷害。,產(chǎn)毒素大腸桿菌是引起人類和動(dòng)物腹瀉的主要病原菌之一,其中許多菌株含有為一種或多種腸毒素編碼的質(zhì)粒。,蘇云金桿菌含有編碼內(nèi)毒素(伴孢晶體中)的質(zhì)粒,根癌土壤桿菌所含Ti質(zhì)粒是引起雙子葉植物冠癭瘤的致病因子,Ti質(zhì)粒中的T-DNA可攜帶任何外源基因整合到植物基因組中，是植物基因工程中有效的克隆載體,5、代謝質(zhì)粒（Metabolicplasmid）,質(zhì)粒上攜帶有有利于微生物生存的基因,如能降解某些基質(zhì)的酶,進(jìn)行共生固氮,或產(chǎn)生抗生素(某些放線菌)等。,降解質(zhì)粒:將復(fù)雜的有機(jī)化合物降解成能被其作為碳源和能源利用的簡(jiǎn)單形式,環(huán)境保護(hù)方面具有重要的意義。,假單胞菌：具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯)、農(nóng)藥(2,4dichlorophenoxyaceticacid)、辛烷和樟腦等的能力。,6、隱秘質(zhì)粒（crypticplasmid）,隱秘質(zhì)粒不顯示任何表型效應(yīng),它們的存在只有通過物理的方法,例如用凝膠電泳檢測(cè)細(xì)胞抽提液等方法才能發(fā)現(xiàn)。它們存在的生物學(xué)意義,目前幾乎不了解。,在應(yīng)用上,很多隱秘質(zhì)粒被加以改造作為基因工程的載體(一般加上抗性基因),是一類能在DNA分子內(nèi)和DNA之間移動(dòng)位置的一段DNA序列。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和遺傳性質(zhì)分為三類:插入序列（IS）、轉(zhuǎn)座子（Tn）、Mu噬菌體IS和Tn共同特征：都帶有編碼轉(zhuǎn)座酶的基因；兩端都有反向末端重復(fù)序列,三）、轉(zhuǎn)座因子的類型和分子結(jié)構(gòu),1、插入序列（IS）只含有與轉(zhuǎn)座有關(guān)的基因和序列，能在細(xì)菌染色體、噬菌體DNA和質(zhì)粒上的許多位點(diǎn)移進(jìn)移出?？删幋a特殊的酶和調(diào)節(jié)蛋白，但不給細(xì)菌表型特征。2、轉(zhuǎn)座子（Tn）與插入序列主要不同在于它攜帶有能賦予宿主某種遺傳特性的基因，主要是抗性基因。能在細(xì)胞內(nèi)從一個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到另一個(gè)質(zhì)粒，亦可轉(zhuǎn)移到染色體或前噬菌體上。,3、Mu噬菌體具有轉(zhuǎn)座功能的一類可引起突變的溶原性噬菌體。這類噬菌體的Mu基因組不論進(jìn)入裂解周期或處于溶原狀態(tài)均可整合,第三節(jié)細(xì)菌基因轉(zhuǎn)移和重組,細(xì)菌的三種水平基因轉(zhuǎn)移形式,接合,轉(zhuǎn)導(dǎo),轉(zhuǎn)化,接合(conjugation)：,細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸(由F因子介導(dǎo)),轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)：,由噬菌體介導(dǎo),轉(zhuǎn)化(naturalgenetictransformation)：,游離DNA分子+感受態(tài)細(xì)胞,一、接合(conjugation),通過細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過程.,1.實(shí)驗(yàn)證據(jù),1946年,JoshuaLederberg和EdwardL.Taturm細(xì)菌的多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型雜交實(shí)驗(yàn),中間平板上長(zhǎng)出的原養(yǎng)型菌落是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換和重組所致！,證實(shí)接合過程需要細(xì)胞間的直接接觸的“U”型管實(shí)驗(yàn)(BernardDavis,1950),2.機(jī)制,(大腸桿菌的接合機(jī)制),接合作用是由一種被稱為F因子的質(zhì)粒介導(dǎo).,F因子的分子量通常為5107,上面有編碼細(xì)菌產(chǎn)生性菌毛(sexpili)及控制接合過程進(jìn)行的20多個(gè)基因。,含有F因子的細(xì)胞:“雄性”菌株(F+),其細(xì)胞表面有性菌毛;,不含F(xiàn)因子的細(xì)胞:“雌性”菌株(F-),細(xì)胞表面沒有性菌毛,F因子為附加體質(zhì)粒,既可以脫離染色體在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立存在,也可插入(整合)到染色體上.,F因子的四種細(xì)胞形式,a)F-菌株,不含F(xiàn)因子,沒有性菌毛,可通過接合作用接收F因子而變成雄性菌株(F+);,b)F+菌株,F因子獨(dú)立存在,細(xì)胞表面有性菌毛;,c)Hfr菌株,F因子插入到染色體DNA上,細(xì)胞表面有性菌毛。,d)F菌株,Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時(shí),形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子,特稱為F因子.細(xì)胞表面同樣有性菌毛。,3、雜交的結(jié)果1）F+F-雜交,雜交的結(jié)果:給體細(xì)胞和受體細(xì)胞均成為F+細(xì)胞.,理化因子的處理可將F因子消除而使F+菌株變成F-菌株.,F+菌株的F因子向F-細(xì)胞轉(zhuǎn)移,但含F(xiàn)因子的宿主細(xì)胞的染色體DNA一般不被轉(zhuǎn)移.,Hfr菌株的F因子插入到染色體DNA上,因此只要發(fā)生接合轉(zhuǎn)移過程,就可以把部分甚至全部細(xì)菌染色體傳遞給F-細(xì)胞并發(fā)生重組,由此而得名為高頻重組菌株。,2）HfrF-雜交,染色體上越靠近F因子的先導(dǎo)區(qū)的基因,進(jìn)入的機(jī)會(huì)就越多,在F-中出現(xiàn)重組子的的時(shí)間就越早，頻率也高。,F因子不易轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中,故HfrF-雜交后的受體細(xì)胞(或稱接合子)大多數(shù)仍然是F-。,3）FF-雜交,Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切割而脫離染色體時(shí),形成游離的但攜帶一小段染色體基因的F因子,特稱為F因子。,FF-與F+F-的不同:給體的部分染色體基因隨F一起轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞.,a)與染色體發(fā)生重組；,b)繼續(xù)存在于F因子上,形成一種部分二倍體；,細(xì)胞基因的這種轉(zhuǎn)移過程又常稱為性導(dǎo)(se-xduction)、F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)(F-duction),或F因子媒介的轉(zhuǎn)導(dǎo)(F-mediatedtransduction).,二、轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）,由噬菌體介導(dǎo)的細(xì)菌細(xì)胞間進(jìn)行遺傳交換的一種方式:一個(gè)細(xì)胞的DNA通過病毒載體的感染轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞中.,能將一個(gè)細(xì)菌宿主的部分染色體或質(zhì)粒DNA帶到另一個(gè)細(xì)菌的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體.,細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的二種類型:,普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo),局限性轉(zhuǎn)導(dǎo),1.普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)(generalizedtransduction),噬菌體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)給體染色體的任何部分到受體細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程.,(1)意外的發(fā)現(xiàn),1951年,JoshuaLederberg和NortonZin-der為了證實(shí)大腸桿菌以外的其它菌種是否也存在接合作用,用二株具不同的多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行的實(shí)驗(yàn):,用“U”型管進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)時(shí),在給體和受體細(xì)胞不接觸的情況下,同樣出現(xiàn)原養(yǎng)型細(xì)菌！,沙門氏菌LT22A是攜帶P22噬菌體的溶源性細(xì)菌另一株是非溶源性細(xì)菌,一個(gè)表面看起來的常規(guī)研究卻導(dǎo)致一個(gè)驚奇和十分重要發(fā)現(xiàn)的重要例證！,基因的傳遞很可能是由可透過“U”型管濾板的P22噬菌體介導(dǎo)的,普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)這一重要的基因轉(zhuǎn)移途徑的發(fā)現(xiàn),(2)轉(zhuǎn)導(dǎo)模型,轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體為什么“錯(cuò)”將宿主的DNA包裹進(jìn)去?,噬菌體的DNA包裝酶也能識(shí)別染色體DNA上類似pac的位點(diǎn)并進(jìn)行切割,以“headful”的包裝機(jī)制包裝進(jìn)P22噬菌體外殼,形成只含宿主DNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體顆粒(假噬菌體).,因?yàn)槿旧w上的pac與P22DNA的pac序列不完全相同,利用效率較低,這種“錯(cuò)裝”機(jī)率一般僅約10-6-10-8,普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的兩種后果:,進(jìn)入受體的外源DNA通過與細(xì)胞染色體的重組交換而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子,流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)(abortivetransduction),轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA不能進(jìn)行重組和復(fù)制,但其攜帶的基因可經(jīng)過轉(zhuǎn)錄而得到表達(dá)。,特點(diǎn):在選擇培養(yǎng)基平板上形成微小菌落,DNA不能復(fù)制,因此群體中僅一個(gè)細(xì)胞含有DNA,而其它細(xì)胞只能得到其基因產(chǎn)物,形成微小菌落。,2、局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)(specializedtransduction),溫和噬菌體感染,整合到細(xì)菌染色體特定位點(diǎn)上宿主細(xì)胞發(fā)生溶源化,溶源菌因誘導(dǎo)而發(fā)生裂解時(shí),在前噬菌體二側(cè)的少數(shù)宿主基因因偶爾發(fā)生的不正常切割而連在噬菌體DNA上,部分缺陷的溫和噬菌體,把供體菌的少數(shù)特定基因轉(zhuǎn)移到受體菌中,2、局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)(specializedtransduction),溫和噬菌體裂解時(shí)的不正常切割:包含gal或bio基因(幾率一般僅有10-6),缺陷噬菌體在宿主細(xì)胞內(nèi)能夠象正常的DNA分子一樣進(jìn)行復(fù)制、包裝，提供所需要的裂解功能,形成轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒.但沒有正常噬菌體的溶源性和增殖能力,感染受體細(xì)胞后，通過DNA整合進(jìn)宿主染色體而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。,局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)與普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要區(qū)別:,a)被轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因共價(jià)地與噬菌體DNA連接，與噬菌體DNA一起進(jìn)行復(fù)制、包裝以及被導(dǎo)入受體細(xì)胞中.而普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝的可能全部是宿主菌的基因。,b)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒攜帶特定的染色體片段并將固定的個(gè)別基因?qū)胧荏w,故稱為局限性轉(zhuǎn)導(dǎo).而普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)攜帶的宿主基因具有隨機(jī)性。,普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)的比較,溶源轉(zhuǎn)變(lysogenicconversion):,一個(gè)與轉(zhuǎn)導(dǎo)相似又不同的現(xiàn)象,溫和噬菌體感染細(xì)胞后使之發(fā)生溶源化,因噬菌體的基因整合到宿主染色體上,而使后者獲得了新性狀的現(xiàn)象。,溶源轉(zhuǎn)變與轉(zhuǎn)導(dǎo)的不同？,a)不攜帶任何供體菌的基因,b)這種噬菌體是完整的,而不是缺陷的,典型實(shí)例,Corynebacteriumdiphtheriae（白喉棒桿菌）：白喉毒素/溫和噬菌體,三、轉(zhuǎn)化(genetictransformation),定義:同源或異源的游離DNA分子(質(zhì)粒和染色體DNA)被自然或人工感受態(tài)細(xì)胞攝取,并得到表達(dá)的水平方向的基因轉(zhuǎn)移過程,自然遺傳轉(zhuǎn)化(naturalgenetictransformation),人工轉(zhuǎn)化(artificialtransformation),感受態(tài)細(xì)胞:具有攝取外源DNA能力的細(xì)菌細(xì)胞.,（competentcell）,自然感受態(tài)與人工感受態(tài)的不同？,自然感受態(tài)的出現(xiàn)是細(xì)胞一定生長(zhǎng)階段的生理特性，受細(xì)菌自身的基因控制；,人工感受態(tài)則是通過人為誘導(dǎo)的方法,使細(xì)胞具有攝取DNA的能力或人為地將DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。,1、自然轉(zhuǎn)化,1928年,Griffith發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象,目前已知有二十多個(gè)種的細(xì)菌具有自然轉(zhuǎn)化的能力.,進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化,需要二方面必要的條件:,建立了感受態(tài)的受體細(xì)胞,外源游離DNA分子,枯草芽孢桿菌的自然轉(zhuǎn)化過程(革蘭氏陽性菌的轉(zhuǎn)化模型),自然遺傳轉(zhuǎn)化的進(jìn)行涉及到細(xì)菌染色體上幾十個(gè)基因的功能及彼此間的相互協(xié)調(diào),因此被認(rèn)為是名副其實(shí)的細(xì)菌水平基因轉(zhuǎn)移途徑。,目前的研究熱點(diǎn)：,1)細(xì)菌為什么要耗費(fèi)如此多的染色體遺傳資源來進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化,即該過程的生物學(xué)意義到底何在?它對(duì)細(xì)菌自身有什么好處?,2)自然轉(zhuǎn)化過程的很多細(xì)節(jié)仍不清楚,包括細(xì)菌如何協(xié)調(diào)感受態(tài)的建立,外源DNA進(jìn)入和重組的具體過程等等,3)細(xì)菌中具有自然轉(zhuǎn)化能力的范圍,到底有那些菌具有自然轉(zhuǎn)化能力？,4)轉(zhuǎn)化DNA的來源和在自然環(huán)境中發(fā)生的自然轉(zhuǎn)化,2、人工轉(zhuǎn)化,用CaCl2處理細(xì)胞,電穿孔等是常用的人工轉(zhuǎn)化手段.,在自然轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上發(fā)展和建立的一項(xiàng)細(xì)菌基因重組手段,是基因工程的奠基石和基礎(chǔ)技術(shù)。,不是由細(xì)菌自身的基因所控制.,用多種不同的技術(shù)處理受體細(xì)胞,使其人為地處于一種可以攝取外源DNA的“人工感受態(tài)”.,第八章微生物遺傳與變異,第四節(jié)真核微生物的基因重組,主要方式：有性生殖準(zhǔn)性生殖,一、有性生殖一般指性細(xì)胞間的接合和隨之發(fā)生的染色體之間的獨(dú)立分配和染色體之間的交換，并產(chǎn)生新遺傳型后代的過程。,細(xì)胞（）細(xì)胞（）,有性接合染色體重組新遺傳型,能產(chǎn)生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌都可以進(jìn)行有性雜交,1、定義：是通過兩個(gè)不同菌株的體細(xì)胞發(fā)生融合，不經(jīng)過減數(shù)分裂而導(dǎo)致低頻率基因重組并產(chǎn)生重組子。存在范圍：常見于一些真菌尤其是半知菌中,二、準(zhǔn)性生殖（parasexualhybridization）,2、準(zhǔn)性生殖的過程：,異核體形成（質(zhì)配）異核體：同一菌絲有不同遺傳性狀的核在同一細(xì)胞質(zhì)中生長(zhǎng)。異核體的特點(diǎn)：具有感受性的兩種菌絲間才可形成異核體；具有野生型性狀，可在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；（基因互補(bǔ)功能）核融合形成雜合二倍體體細(xì)胞交換和單倍體化。,體細(xì)胞交換和單倍體化,雜合體細(xì)胞中有極少數(shù)細(xì)胞核在進(jìn)行有絲分裂的過程中，能發(fā)生體細(xì)胞染色體間的交換、分離（單倍體化）而產(chǎn)生具有新性狀的單倍體雜合子、雙倍體及非整倍體。,A,B,A+B,（同核體）,（異核體）,A,A,B,B,AB,A,A,B,B,（雜合二倍體）,單倍體雜合子,第五節(jié)微生物基因突變,一個(gè)基因內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)或DNA序列的任何改變.,基因突變:,基因突變是重要的生物學(xué)現(xiàn)象,它是一切生物變化的根源,連同基因轉(zhuǎn)移、重組一起提供了推動(dòng)生物進(jìn)化的遺傳多變性。,突變,自發(fā)突變,誘變,環(huán)境因素的影響,DNA復(fù)制過程的偶然錯(cuò)誤等而導(dǎo)致,一般頻率較低,通常為10-6-10-9。,某些物理、化學(xué)因素對(duì)生物體的DNA進(jìn)行直接作用，突變以較高的頻率產(chǎn)生。,1、特點(diǎn),1）非對(duì)應(yīng)性2）稀有性3）規(guī)律性4）獨(dú)立性5）遺傳和回復(fù)性6）可誘變性,一、基因突變的特點(diǎn),證明突變的性狀與引起突變的原因間無直接對(duì)應(yīng)關(guān)系！,如何證明基因突變的非對(duì)應(yīng)性?,三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn),變量實(shí)驗(yàn)、涂布實(shí)驗(yàn)、影印實(shí)驗(yàn),2、實(shí)驗(yàn)證據(jù),變量實(shí)驗(yàn)（fluctuationanalysis）SalvadorLuriaandMaxDelbruck（1943）,Newcombe的涂布實(shí)驗(yàn)(1949),影印實(shí)驗(yàn)(replicaplating)JoshuaLederbergandEstherLederberg(1952),二、常見的微生物突變類型,表型,基因型,1）營(yíng)養(yǎng)缺陷型(auxotroph),一種缺乏合成其生存所必須的營(yíng)養(yǎng)物(包括氨基酸、維生素、堿基等)的突變型,只有從周圍環(huán)境或培養(yǎng)基中獲得這些營(yíng)養(yǎng)或其前體物(precursor)才能生長(zhǎng)。,營(yíng)養(yǎng)缺陷型是微生物遺傳學(xué)研究中重要的選擇標(biāo)記和育種的重要手段,判斷表型的標(biāo)準(zhǔn):,在基本培養(yǎng)基上能否生長(zhǎng).,特點(diǎn)：,在選擇培養(yǎng)基(常為基本培養(yǎng)基)上不生長(zhǎng),負(fù)選擇標(biāo)記,突變株不能通過選擇平板直接獲得,營(yíng)養(yǎng)缺陷型(auxotroph),1),營(yíng)養(yǎng)缺陷型的表示方法：,基因型:,所需營(yíng)養(yǎng)物的前三個(gè)英文小寫斜體字母表示:hisC(組氨酸缺陷型,其中的大寫字母C同一表型中不同基因的突變）,表型:,同上,第一個(gè)字母大寫,且不用斜體：HisC.,在具體使用時(shí)多用hisC-和hisC+,分別表示缺陷型和野生型。,2）抗藥性突變型(resistantmutant),基因突變使菌株對(duì)某種或某幾種藥物,特別是抗生素，產(chǎn)生抗性。,特點(diǎn):,正選擇標(biāo)記(突變株可直接從抗性平板上獲得-在加有相應(yīng)抗生素的平板上,只有抗性突變能生長(zhǎng)。所以很容易分離得到。),表示方法:,所抗藥物的前三個(gè)小寫斜體英文字母加上“r”表示strr和strs分別表示對(duì)鏈霉素的抗性和敏感性。,3)條件致死突變型(conditionallethalmutant),在某一條件下具有致死效應(yīng),而在另一條件下沒有致死效應(yīng)的突變型。,常用的條件致死突變是溫度敏感突變,用ts(temperaturesensitive)表示,這類突變?cè)诟邷叵?如42)是致死的,但可以在低溫(如25-30)下得到這種突變。,特點(diǎn):,負(fù)選擇標(biāo)記,這類突變型常被用來分離生長(zhǎng)繁殖必需的突變基因,4)形態(tài)突變型(morphologicalmutant),造成形態(tài)改變的突變型,特點(diǎn)：,非選擇性突變突變株和野生型菌株均可生長(zhǎng),但可從形態(tài)特征上進(jìn)行區(qū)分。,舉例：,產(chǎn)蛋白酶缺陷突變株的篩選,5）其它突變類型,毒力、生產(chǎn)某種代謝產(chǎn)物的發(fā)酵能力的變化等在實(shí)際應(yīng)用中具有重要意義突變類型一般都不具有很明顯或可直接檢測(cè)到的表型。其突變株的獲得往往需要較大的工作量。,突變率定義：每一細(xì)胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的概率。突變率=突變細(xì)胞數(shù)/分裂前群體細(xì)胞數(shù)突變是獨(dú)立的。,三、基因突變的分子基礎(chǔ),1、自發(fā)突變,無人為因素下的低頻率突變?cè)颍海?）背景輻射（2）有害產(chǎn)物積累（3）堿基錯(cuò)配,分子基礎(chǔ),基因突變的原因是多種多樣的，從分子水平來說，突變是由于DNA分子堿基對(duì)發(fā)生變化所產(chǎn)生的結(jié)果。堿基置換（1）轉(zhuǎn)換AGTC即DNA鏈中的一個(gè)嘌呤被另一個(gè)嘌呤或是一個(gè)嘧啶被另一個(gè)嘧啶所置換；（2）顛換：ATACGCGT即一個(gè)嘌呤被一個(gè)嘧啶,或是一個(gè)嘧啶被一個(gè)嘌呤所置換。,2、誘發(fā)突變,誘變劑（mutagen）：凡能提高突變率的任何理化因子，就稱為誘變劑種類：誘變劑的種類很多，作用方式多樣。即使是同一種誘變劑，也常有幾種作用方式。,（1）堿基類似物如：5-溴尿嘧啶(5-BU)和5-氨基尿嘧啶（5AU）等作用方式：主要是在DNA復(fù)制時(shí)堿基類似物插入DNA中，引起堿基對(duì)配對(duì)錯(cuò)誤，造成堿基置換。,5-BU引起的轉(zhuǎn)換,（2）直接與DNA堿基起化學(xué)反應(yīng)的誘變劑,定義：一類可直接與核酸的堿基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的誘變劑，不論在機(jī)體內(nèi)或是在離體條件下均有作用。種類：例如亞硝酸、羥胺和各種烷化劑（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N硝基-N-亞硝基胍，N-甲基-N-亞硝基脲，乙烯亞胺，環(huán)氧乙酸，氮芥等）。作用：它們可與一個(gè)或幾個(gè)核苷酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而引起DNA復(fù)制時(shí)堿基配對(duì)的轉(zhuǎn)換，并進(jìn)一步使微生物發(fā)生變異。,亞硝酸可以使堿基發(fā)生氧化脫氨作用。HNO2胞嘧啶（C）尿嘧啶（U）:AHNO2腺嘌呤（A）次黃嘌呤（H）:CHNO2鳥嘌呤（G）黃嘌呤（X）:G,堿基轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制以亞硝酸為例,（3）移碼突變誘變劑,丫啶類染料，包括原黃素、丫啶黃、丫啶橙和-氨基丫啶等，以及一系列稱為ICR類的化合物，都是移碼突變的有效誘變劑。,丫啶類化合物的誘變機(jī)制：,由于它們是一種平面型三環(huán)分子，結(jié)構(gòu)與一個(gè)嘌呤嘧啶對(duì)十分相似，故能嵌入兩個(gè)相鄰DNA堿基對(duì)之間，造成雙螺旋的部分解開，從而在DNA復(fù)制過程中，會(huì)使鏈上增添或缺失一個(gè)堿基，結(jié)果就引起了移碼突變。,（4）紫外線紫外線的主要作用是使同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成共價(jià)結(jié)合的胸腺嘧啶二聚體，阻礙堿基間的正常配對(duì)，從而有可能引起突變或死亡。,3、誘變劑與致癌物質(zhì)Ames試驗(yàn),a)利用各種誘變劑獲得各類遺傳突變，進(jìn)行誘變育種；,c)危害人類自身的健康.,b)對(duì)有害微生物進(jìn)行控制；,很多種化學(xué)物質(zhì),能以各種機(jī)制導(dǎo)致DNA的突變,回復(fù)突變(reversemutation或backmuta-tion):突變體失去的野生型性狀，可以通過第二次突變得到恢復(fù)，這種第二次突變稱為回復(fù)突變.,美國(guó)加利福尼亞大學(xué)的BruceAmes教授于1966年發(fā)明，因此稱為Ames試驗(yàn),具體操作:檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphmurium)組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株hisC-的回復(fù)突變率,艾姆氏試驗(yàn)的基本方法,缺陷型菌株,營(yíng)養(yǎng)缺乏型平板,3723天,.,.:.:.:.;.;.:,.:.:.:.;.;.:,.,待測(cè)試劑,正?；貜?fù)突變,誘變劑誘變,艾姆氏試驗(yàn)已成為測(cè)試化學(xué)物質(zhì)誘變作用的標(biāo)準(zhǔn)方法，其原理是檢驗(yàn)待測(cè)試劑能否使?fàn)I養(yǎng)缺陷型菌株的回復(fù)突變?cè)黾印?Ames試驗(yàn),證明Ames試驗(yàn)重要性的應(yīng)用實(shí)例：,國(guó)外曾開發(fā)了一種降低婦女妊娠反應(yīng)的藥物“反應(yīng)停”,由于藥效顯著,在60-70年代十分流行,但隨后人們就發(fā)現(xiàn)畸形兒的出生率明顯增高,而且生產(chǎn)畸形兒的婦女大多曾服用“反應(yīng)?！薄：髞聿捎肁mes試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)的確具有很強(qiáng)的致突變作用,因此這種藥物被禁止使用.,一、誘變育種定義：是用物理或化學(xué)的誘變劑使微生物遺傳物質(zhì)（DNA）的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。,實(shí)踐意義:,第六節(jié)微生物育種,1.出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株用來育種處理的起始菌株,出發(fā)菌株應(yīng)具備：對(duì)誘變劑的敏感性高；具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力；,出發(fā)菌株的來源自然界直接分離到的野生型菌株：歷經(jīng)生產(chǎn)考驗(yàn)的菌株：已經(jīng)歷多次育種處理的菌株：,要求：菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并使細(xì)胞處于同步生長(zhǎng)；細(xì)胞分散且為單細(xì)胞，以避免表型遲延現(xiàn)象;,2.敏感期和合適對(duì)象的選擇,3.誘變劑的選擇劑量的表示法：一般應(yīng)預(yù)先作誘變劑用量對(duì)菌體死亡數(shù)量的致死曲線，選擇合適的處理劑量。致死率是最好的誘變劑相對(duì)劑量的表示方法。最適劑量的選擇：產(chǎn)量性狀的育種中多傾向于低劑量（致死率在7080%）,選擇誘變劑的種類：紫外線亞硝基胍簡(jiǎn)便有效的誘變方法：紫外線的照射最為方便。,4.菌種篩選,復(fù)篩的目的：確認(rèn)符合要求的菌株；復(fù)篩以質(zhì)為主，應(yīng)精確測(cè)定每個(gè)菌株的生產(chǎn)指標(biāo)。,篩選方案：將篩選工作分為初篩和復(fù)篩兩步進(jìn)行。初篩的目的：,與營(yíng)養(yǎng)缺陷突變有關(guān)的三類遺傳型個(gè)體：營(yíng)養(yǎng)缺陷型：如：lys-，bio-野生型：如：lys+;bio+;原養(yǎng)型：指營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌株回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的菌株，與野生型的表型相同。,營(yíng)養(yǎng)缺陷型(auxotroph)的篩選,與篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株有關(guān)的三類培養(yǎng)基,基本培養(yǎng)基（MM）-：凡是能滿足野生型菌株?duì)I養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基（CM）+：滿足一切營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株生長(zhǎng)的天然或半合成培養(yǎng)基。補(bǔ)充培養(yǎng)基（SM）x：在MM中有針對(duì)性地加入一或幾種營(yíng)養(yǎng)成分以滿足相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株生長(zhǎng)的合成培養(yǎng)基。,營(yíng)養(yǎng)缺陷型誘變篩選步驟及方法,auxo的鑒定,誘變