RT-PCR原理和實(shí)驗(yàn)步驟

.RT-PCR原理與實(shí)驗(yàn)步驟一、知識(shí)背景：1、基因表達(dá)：DNARNAProtein單拷貝基因表達(dá)存在逐步放大機(jī)制，如一個(gè)蠶絲心蛋白基因 104個(gè)絲心蛋白mRNA（每個(gè)mRNA存活4d，可以合成105個(gè)絲心蛋白）共合成109個(gè)絲心蛋白。因此單拷貝基因的mRNA表達(dá)水平對(duì)于其功能水平的調(diào)控是非常重要的。2、PCR技術(shù)(Polymerasechainreaction)：即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在模板、引物和四種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)，其特異性由兩個(gè)人工合成的引物序列決定。反應(yīng)分三步：A.變性：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA；B.退火：將反應(yīng)混合液冷卻至某一溫度，使引物與模板結(jié)合。C.延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2存在下，退火引物沿5 3方向延伸。以上三步為一個(gè)循環(huán)，如此反復(fù)。3、逆轉(zhuǎn)錄酶和RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：1、依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈；2、Rnase水解活性：水解RNA:DNA雜合體中的RNA；3、依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈cDNA.二、RT-PCR的準(zhǔn)備：1.引物的設(shè)計(jì)及其原則：1) 引物的特異性決定PCR反應(yīng)特異性。因此引物設(shè)計(jì)是否合理對(duì)于整個(gè)實(shí)驗(yàn)有著至關(guān)重要的影響。在引物設(shè)計(jì)時(shí)要充分考慮到可能存在的同源序列，同種蛋白的不同亞型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA對(duì)引物的特異性的影響。盡量選擇覆蓋相連兩個(gè)內(nèi)含子的引物，或者在目的蛋白表達(dá)過程中特異存在而在其他亞型中不存在的內(nèi)含子。2) 引物設(shè)計(jì)原則的把握引物設(shè)計(jì)原則包括:a、引物長(zhǎng)度:一般為1530bp，引物太短會(huì)影響PCR的特異性，引物太長(zhǎng)PCR的最適延伸溫度會(huì)超過Taq酶的最適溫度，也影響反應(yīng)的特異性。b、堿基分布：四種堿基最好應(yīng)隨機(jī)分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特別是連續(xù)出現(xiàn)3個(gè)以上的單一堿基。GC含量（Tm值）：4060，PCR擴(kuò)增的復(fù)性溫度一般是較低Tm值減去510度。c、3 端要求：3 端必須與模板嚴(yán)格互補(bǔ)，不能進(jìn)行任何修飾，也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能。末位堿基是A時(shí)錯(cuò)配的引發(fā)效率最低，G、C居中間，因此引物的3端最好選用A、G、C而盡可能避免連續(xù)出現(xiàn)兩個(gè)以上的T。d、引物自身二級(jí)結(jié)構(gòu)：引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則會(huì)自身折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)或引物自身復(fù)性。e、引物之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)：兩引物之間不應(yīng)有多于4個(gè)連續(xù)堿基互補(bǔ)，3端不應(yīng)超過2個(gè)。f、同源序列：引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性應(yīng)小于連續(xù)8個(gè)的互補(bǔ)堿基存在。g、5端無嚴(yán)格限制：5末端堿基可以游離，但最好是G或C，使PCR產(chǎn)物的末端結(jié)合穩(wěn)定。還可以進(jìn)行特異修飾（標(biāo)記、酶切位點(diǎn)等）等等。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇適當(dāng)?shù)囊?。常用引物設(shè)計(jì)軟件如Primer5.0，Oligo6.0等對(duì)于這些條件都可以自行設(shè)置。2、耗材：實(shí)驗(yàn)所用的接觸樣品的耗材如凍存管、槍頭、EP管之類事先都需經(jīng)過0.1%DEPC水浸泡處理，除去RNA酶，防止操作過程中RNA降解。然后經(jīng)高壓滅活（滅菌和滅活DEPC）。3、試劑準(zhǔn)備：變性液、水飽和酚、乙酸鈉、氯仿、異丙醇、75%酒精、經(jīng)DEPC處理并高壓的水。三、RNA的提取方法RTPCR中從細(xì)胞分離的RNA的質(zhì)量至關(guān)重要，包括RNA的純度和完整性。RNA分離的最關(guān)鍵因素是盡量減少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常穩(wěn)定，分布廣泛，除細(xì)胞內(nèi)源性RNA酶外，環(huán)境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA時(shí)，應(yīng)盡量創(chuàng)造一個(gè)無RNA酶的環(huán)境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制內(nèi)源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通過RNA酶的阻抑蛋白R(shí)nasin和強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑如異硫氰酸胍抑制內(nèi)源性RNA酶。 RNA的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)原理和步驟來源：生物谷 訪問量：3688評(píng)論(0)分享1一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆罩参锟俁NA非變性膠電泳的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理RNA電泳可以在變性及非變性兩種條件下進(jìn)行。非變性電泳使用1.0%-1.4%的凝膠，不同的RNA條帶也能分開，但無法判斷其分子量。只有在完全變性的條件下，RNA的泳動(dòng)率才與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。因此要測(cè)定RNA分子量時(shí)，一定要用變性凝膠。在需快速檢測(cè)所提總RNA樣品完整性時(shí)，配制普通的1%瓊脂糖凝膠即可。三、實(shí)驗(yàn)材料、器具及藥品蘑菇的總RNA溶液。 電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭，微波爐，紫外透射檢測(cè)儀等。 瓊脂糖，1XTAE電泳緩沖液，0.5g/ml溴化乙錠（EB）10X載樣緩沖液。四、實(shí)驗(yàn)步驟（1）用1TAE電泳緩沖液制作瓊脂糖凝膠，加1TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠。（2）在超凈工作臺(tái)上，用移液器吸取總RNA樣品4l于封口膜上。在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上再加入5l 1TAE電泳緩沖液及1l 的10X載樣緩沖液，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔。（3）打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至100V，使RNA由負(fù)極向正極電泳，約30min后將凝膠放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射檢測(cè)儀上觀察RNA電泳結(jié)果。RNA的變性瓊脂糖凝膠檢測(cè)試劑：（1）MOPS緩沖液（10*）:0.4mol/L 嗎啉代丙烷磺酸（MOPS） (Ph7.0)，0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。（2）上樣染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚藍(lán)，0.4%二甲苯藍(lán)。（3）甲醛。（4）去離子甲酰胺。v電泳槽清洗：去污劑洗干凈（一般浸泡過夜）水沖洗乙醇干燥3%H2O2灌滿室溫放置10分鐘0.1%DEPC水沖洗。操作：（1） 將制膠用具用70%乙醇沖冼一遍，晾干備用。（2） 配制瓊脂糖凝膠。稱取0.5g瓊脂糖，置干凈的100ml 錐形瓶中，加入40ml蒸餾水，微波爐內(nèi)加熱使瓊脂糖徹底溶化均勻。待膠涼至60-70 ，依次向其中加入9ml 甲醛、5ml 10X MOPS緩沖液和0.5ul 溴化乙錠，混合均勻。灌制瓊脂糖凝膠。（3） 樣品準(zhǔn)備： 取 DEPC處理過的500ul小離心管，依次加入如下試劑： 10x MOPS緩沖液2ul，甲醛3.5ul,甲酰