【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）土壤中溶無(wú)機(jī)磷細(xì)菌的分離、鑒定及陰溝腸桿菌溶無(wú)機(jī)磷基因的克隆微 生 物 學(xué)碩士論文

密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 土壤中溶無(wú)機(jī)磷細(xì)菌的分離、鑒定及陰溝腸桿菌溶無(wú)機(jī)磷基因的克隆 of of 摘 要 溶磷微 生物在土壤中磷循環(huán)相關(guān)的生物學(xué)系統(tǒng)中擔(dān)任著重要的角色 , 它可以將難溶磷素轉(zhuǎn)化為可溶性磷，提高磷肥利用率，本論文圍繞溶磷微生物開(kāi)展相關(guān)工作，取得以下結(jié)果 ： 本實(shí)驗(yàn)從北京部分地區(qū)采集 4種土樣分離純化出 30株溶解無(wú)機(jī)磷的細(xì)菌，對(duì)分離的細(xì)菌和本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株（ 22株）進(jìn)行溶無(wú)機(jī)磷定性和定量的篩選，對(duì)其中編號(hào)為 株細(xì)菌利用 結(jié)果表明 ,而 其中的 定其 16S 果也表明該菌株在分類(lèi)上歸屬陰溝腸桿菌（ 選取 座子進(jìn)行三親本雜交，構(gòu)建了約 20， 000個(gè)接合子的突變文庫(kù)，并進(jìn)行了相關(guān)的篩選工作，經(jīng)過(guò)多種方法沒(méi)有篩選到溶無(wú)機(jī)磷的突變菌株，推測(cè)控制細(xì)菌溶無(wú)機(jī)磷的性狀因素較多，需要新的方法挑選該類(lèi)表型的突變 。根據(jù)已發(fā)表的溶無(wú)機(jī)磷的基因增出該基因的核心片段 582分析與其他細(xì)菌中的該基因核苷酸的最高同源性 85%，將該片段標(biāo)記后經(jīng) 證 關(guān)鍵詞 ： 溶無(wú)機(jī)磷細(xì)菌， 16S 座子，溶無(wú)機(jī)磷基因 in an in of SM as In 30 of of of 2 of in in of of 6S n5 no 0,000 by by to of on of in 82bp CR 5% IG as in NA 16S 目 錄 第一章 緒論 . 1 究意義 . 1 究現(xiàn)狀 . 1 菌種群的現(xiàn)代鑒定技術(shù) . 8 因克隆技術(shù) . 10 究目的及 技術(shù)路線(xiàn) . 12 第二章 土壤中溶無(wú)機(jī)磷細(xì)菌的篩選 . 14 料 . 14 法 . 15 果 . 16 論 . 19 第三章 部分溶無(wú)機(jī)磷細(xì)菌的鑒定 . 21 法 . 21 果 . 27 果 . 29 論 . 29 第四章 溶無(wú)機(jī)磷細(xì)菌突變庫(kù)的建立 . 31 料 . 31 法 . 31 果與討論 . 33 第五章 因的克隆 . 35 料 . 35 法 . 36 果 . 42 論 . 44 第六章 結(jié)論 . 45 參考文獻(xiàn) . 46 致 謝 . 53 附錄 培養(yǎng)基及制法 . 54 附錄 部分試劑 . 56 附錄 生物自動(dòng)鑒定分析結(jié)果 . 60 作者簡(jiǎn)歷 . 63 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第一章 緒論 1 第一章 緒論 究意義 磷肥在當(dāng)今農(nóng)業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中仍是世界糧食增產(chǎn)的重要因素之一， 但磷肥生產(chǎn)不僅要消耗大量的磷礦資源，同時(shí)要消耗硫酸等工業(yè)原料，而且還導(dǎo)致氟等污染。磷礦粉直接施用還要受其本身的化學(xué)、物理性質(zhì)、土壤和植物等因素影響。魯如坤（ 1980）認(rèn)為目前生產(chǎn)上應(yīng)用最多最廣的是高水溶性磷肥，這類(lèi)磷肥施入固磷能力強(qiáng)的土壤后很快被固定為植物難利用的形態(tài) ,當(dāng)季利用率很低，一般僅為 1025%，我國(guó)南方廣泛分布的紅黃壤對(duì)磷肥的固定則尤為強(qiáng)烈。陳國(guó)潮認(rèn)為我國(guó)有 74%耕地土壤缺磷大部分也是由土壤磷固定造成的。如何開(kāi)發(fā)和利用這部分被土壤固定的磷無(wú)疑對(duì)于當(dāng)前我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有非常重要的意義。 大量的研究結(jié)果 證明：土壤中存在大量具有一定的的溶磷作用的微生物，主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面，一方面將有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)磷，二是溶解土壤中難溶性的無(wú)機(jī)磷酸鹽（ 957）。有人將其中能夠礦化有機(jī)磷化合物的微生物稱(chēng)之為溶有機(jī)磷微生物；能夠?qū)⒅参镫y以吸收的無(wú)機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)化為可直接吸收利用形態(tài)的微生物 ,稱(chēng)之為溶無(wú)機(jī)磷微生物 (或解無(wú)機(jī)磷微生物 )。當(dāng)然一些微生物不僅可以溶解無(wú)機(jī)磷也能吸收有機(jī)磷，二者之間并無(wú)嚴(yán)格的界定，通稱(chēng)為溶磷微生物。 1957）和 1963）等人的研究表明利用溶磷微生物的特性將 磷細(xì)菌作為生物肥料或接種劑不僅節(jié)約原料，克服大量施用化肥所帶來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題，而且可以用來(lái)提高難分選的中低品位的磷礦資源利用率；并通過(guò)微生物的修復(fù)作用，改善土壤環(huán)境，使土壤中有效磷含量提高，植物吸磷量增加，生物量和產(chǎn)量均有所提高，具有重大的理論和實(shí)踐意義。 究現(xiàn)狀 壤中的磷 土壤中的磷酸鹽化合物可分為原生和次生兩大部分。原生的磷礦物主要是磷灰石，其分子組成 F，極難溶于水， 為 120，但易溶于酸。次生的磷礦物又分為無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷。無(wú)機(jī)磷有沉淀態(tài)的和吸附態(tài)兩種形態(tài)， 前者主要是指與鐵、鋁和鈣結(jié)合的磷酸鹽，其中又有晶質(zhì)態(tài)和非晶質(zhì)態(tài)之分，晶質(zhì)的以粉紅磷酸鐵和磷鋁石等次生的含磷礦物為代表，非晶質(zhì)的可以無(wú)定型的磷酸鐵鹽為代表。此類(lèi)化合物的形成可能有兩種過(guò)程：一種是原生礦物的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，另一種是在水溶性磷肥施入酸性土壤以后產(chǎn)生的，或者在施入磷酸一鈣后，由于其成分溶解的特性，即使在石灰性土壤中也會(huì)發(fā)生。吸附態(tài)磷量的多少與土壤性質(zhì)和磷肥使用水平有關(guān)，它主要存在于粘粒礦物的表面。吸附磷量最高的土壤，如火山灰發(fā)育的土壤，它的最大吸附磷量可達(dá) 5000一般在自然土壤中吸附態(tài)的 磷量是有限的。在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第一章 緒論 2 土壤溶液中，還有極少量的水溶性磷酸根離子，其含量在土壤中一般較低（低于 這是作物磷素營(yíng)養(yǎng)的重要給源。在一般情況下，無(wú)機(jī)磷總量約占全磷的 5080%。有機(jī)磷化合物的組成很復(fù)雜，到現(xiàn)在為止，對(duì)其組成和性質(zhì)較清楚的進(jìn)展占有機(jī)磷的 1/2 左右，包括磷酸肌醇、磷脂和核酸，以及少量的磷蛋白和磷酸糖。有機(jī)磷的總量約占土壤全磷量的2050%。土壤中 510%的量是存在于微生物體內(nèi)， 3050%是以植酸態(tài)鈣鎂存在的（蔣柏藩，1981）。 現(xiàn)代的植物營(yíng)養(yǎng)理論認(rèn)為，植物吸收的養(yǎng)分主要是以土壤 液相中的離子態(tài)進(jìn)入植物體內(nèi)。在通常情況下，磷是以正磷酸鹽的形態(tài)存在于土壤中，磷酸根離子的形態(tài)受土壤的 為 2以絕大部分土壤液相中磷是以 2含量不僅受母質(zhì)的影響，還受耕作、施肥及自然的侵蝕、磷溶和淀積等影響。但是土壤的全磷量并不能作為土壤磷素供應(yīng)水平的確切指標(biāo)，這是因?yàn)橥寥乐械拇蟛糠至姿厥且赃t效態(tài)存在的。另外，當(dāng)無(wú)機(jī)磷肥施入土壤后，部分溶于土壤溶液中，土壤組分與其反應(yīng)又將其移出土壤液相，成為生物不 易利用的形態(tài)，即磷被固定。土壤磷固定的方式很多，有物理和化學(xué)吸附、陰離子交換、表面沉淀、獨(dú)立固相沉淀等。如以可變電荷礦物為主的土壤磷的固定主要是由于鐵、鋁氧化物、高嶺石、針鐵礦等礦物表面磷吸附的結(jié)果，這些被吸附的磷與鐵或鋁相結(jié)合，很難用一般的水相平衡解析下來(lái)。而對(duì)于部分酸性土壤、中性土壤和石灰性土壤磷的固定，則以磷酸鹽沉淀為主的方式。盡管磷固定的方式有多種，我們可以把這些方式歸結(jié)為兩類(lèi)：沉淀和吸附（魯如坤， 2000；陳國(guó)潮， 2001）。 在植被條件較好情況下，除了進(jìn)入雨水或深層土壤中，或從中因淋溶而損失的極 少量的磷以外，土壤磷的循環(huán)實(shí)際上是封閉的。在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，由于農(nóng)產(chǎn)品被取走，以及由于地表徑流和侵蝕的影響而使磷遭損失，因而農(nóng)作物參與的磷素循環(huán)是開(kāi)放的。通過(guò)施肥、畜禽糞便以及作物殘茬而進(jìn)入土壤的磷，一方面被土壤和微生物所固定，另一方面由于土壤生物的作用而得以分解和轉(zhuǎn)化。這兩個(gè)過(guò)程是土壤磷素循環(huán)中的主要過(guò)程， 簡(jiǎn)單的磷素循環(huán)見(jiàn)圖 1_1。 圖 1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第一章 緒論 3 磷微生物 土壤微生物與土壤磷之間關(guān)系的研究始于 20 世紀(jì)初。 現(xiàn)一些原本不溶的磷酸鹽和天然的磷礦石能 被一些細(xì)菌所溶解利用，之后 研究了微生物對(duì)植物吸收磷的影響，結(jié)果表明：生長(zhǎng)于不滅菌土壤中的植物干重比生長(zhǎng)于滅菌土壤中的植物增加了 72188%，吸磷量增加了 79340%。他認(rèn)為這是土壤微生物作用的結(jié)果，但他沒(méi)能對(duì)其作用機(jī)理作出解釋。 50 年代開(kāi)始，對(duì)細(xì)菌溶磷進(jìn)行了更為深入的研究，我國(guó)對(duì)溶磷細(xì)菌的研究也在此時(shí)開(kāi)展，先后有人從東北黑土和灰化土中分離出溶磷能力很強(qiáng)的溶磷芽胞桿菌，中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)生態(tài)研究所也從東北黑土中分離出一種極毛桿菌。進(jìn)入 80 年代開(kāi)始有人步入溶磷菌的分子機(jī)理方面的研究，對(duì)于溶 磷機(jī)制也有了進(jìn)一步的探討， 90 年代以后陸續(xù)從范圍較廣的菌株中克隆出一些相關(guān)基因，到目前為止對(duì)于溶磷的分子機(jī)理的工作仍在開(kāi)展并有了較為深刻的認(rèn)識(shí)。 磷微生物的種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量 具有溶磷能力的微生物包括細(xì)菌、真菌和放線(xiàn)菌，在土壤中的數(shù)量受土壤物理結(jié)構(gòu)、有機(jī)質(zhì)含量、土壤類(lèi)型、土壤肥力、耕作方式和措施等因素的影響。尹瑞玲發(fā)現(xiàn)我國(guó)旱地土壤溶磷菌平均為 107g，占土壤微生物總數(shù)的 2782%，其中細(xì)菌所占比例最大。溶磷細(xì)菌數(shù)量因土壤類(lèi)型而異，黑鈣土溶磷菌最多，為 107g，瓦堿土 最少，僅有 2104g。林啟美在研究不同生態(tài)系統(tǒng)的土壤中溶磷細(xì)菌數(shù)量時(shí)發(fā)現(xiàn)溶磷菌不僅總數(shù)差異很大，而且在細(xì)菌總數(shù)中占的比例也有很大的差異。另外溶磷菌的分布表現(xiàn)出強(qiáng)烈的根際效應(yīng) ,即根際土壤的數(shù)量比土體要多 ,但并不是根際微生物的優(yōu)勢(shì)菌落。 目前報(bào)道的溶磷細(xì)菌主要集中在芽胞桿菌屬 (假單胞菌屬 (埃希氏菌屬 (歐文氏菌屬 (土壤桿菌屬 (沙雷氏菌屬(黃桿菌屬 (腸細(xì)菌屬 (微球菌屬 (固氮菌屬 (沙門(mén)氏菌屬 (色桿菌屬 (產(chǎn)堿菌屬(節(jié)細(xì)菌屬 (多硫桿菌屬 (些種。 關(guān)于溶磷真菌的研究由于技術(shù)手段等問(wèn)題見(jiàn)于報(bào)道的相對(duì)較少，但其也有溶磷能力強(qiáng)的特點(diǎn)，目前研究主要集中在青霉屬 (曲霉屬 (根霉屬 (如加拿大的應(yīng)用面積和效果均很理想，范丙全（ 2001）則在石灰性土壤上進(jìn)行了溶磷微生物的篩選，并進(jìn)一步對(duì)溶磷草酸青霉菌的溶磷效果、溶磷能力、活化土壤難溶磷的種類(lèi)、對(duì)作物的生長(zhǎng)和溶磷機(jī)理進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。 958)首次報(bào)道了一株放線(xiàn)菌（ 酸種類(lèi)與溶磷的關(guān)系， 980)的研究顯示放線(xiàn)菌兼具有分解有機(jī)磷的能力， 982)分離到了第一株鏈霉菌，使培養(yǎng)基的 降低 ,能溶解磷酸三鈣和磷礦石，其后 983)報(bào)道他們分離了兩株放線(xiàn)菌（鏈霉菌）均具有溶磷作用。當(dāng)前對(duì)溶磷放線(xiàn)菌的研究對(duì)象絕大部分為鏈霉菌屬 (研究層次多集中在對(duì)新的溶磷菌株的篩選、溶磷效果分析等方面。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第一章 緒論 4 生物溶無(wú)機(jī)磷的機(jī)制 微生物溶磷機(jī)理非常復(fù)雜，有些微生物溶磷主要是質(zhì)子起作用，有些主要是有機(jī)酸起作用，而有些菌株則兩種機(jī)制都存在 ,還有些菌株由于生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生其它的螯合物質(zhì) ,從而導(dǎo)致磷礦粉的溶解。其它也有人認(rèn)為有機(jī)酸的種類(lèi)比產(chǎn)酸的量對(duì)于溶磷效果有 更重要的意義。 分泌有機(jī)酸是許多微生物代謝活動(dòng)常見(jiàn)的現(xiàn)象，細(xì)菌分泌的有機(jī)酸主要是草酸、酒石酸、丙二酸、乳酸和乙酸，真菌分泌的有機(jī)酸主要是草酸、丙二酸和乳酸。不同菌株之間分泌有機(jī)酸的數(shù)量和種類(lèi)差別都非常大，最高的達(dá) 124，最低的只有 。微生物在生長(zhǎng)代謝中產(chǎn)生的有機(jī)酸一方面可以溶解土壤中難溶性磷酸鹽，另一方面還具備鰲合作用（ 將分離得到的 100 多種細(xì)菌涂布于以鈣磷灰石為唯一磷源的培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)在菌落周?chē)a(chǎn)生溶磷圈，認(rèn)為這是產(chǎn)生 的乳酸和 2解的機(jī)理是酸化和鈣離子的螯合作用， 發(fā)現(xiàn)細(xì)菌產(chǎn)酸與溶磷有一定的相關(guān)性。林啟美等發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)介質(zhì)酸度升高是溶解磷礦粉的重要條件，但不是其必要條件。也有人發(fā)現(xiàn)溶磷量與培養(yǎng)介質(zhì)的 間缺乏相關(guān)性，甚至有與此相反的結(jié)果，例如某些細(xì)菌不分泌任何酸性物質(zhì)，幾乎不提高培養(yǎng)介質(zhì)的酸度，甚至降低了培養(yǎng)介質(zhì)的酸度，但仍然具有強(qiáng)烈的溶解磷礦粉活力。不同的有機(jī)酸與鐵、鋁、鈣、鎂等金屬離子結(jié)合能力存在巨大的差異。 現(xiàn)微生物分泌的有機(jī)酸種類(lèi)比數(shù)量更加重要。 現(xiàn)盡管微生物與葡萄糖酸的分泌存在顯著的相關(guān)性 (從介質(zhì)中吸收無(wú)機(jī)磷。如果將 調(diào)整為普通微生物代謝最適值，礦化速度將提高，同時(shí)從酸性改變到中性會(huì)增加磷酸的釋放。另外較高的溫度也促進(jìn)分解作用，如熱帶地區(qū)有機(jī)磷礦化速度高于 溫帶地區(qū)，富含有機(jī)磷的土壤生物礦化作用則非?；钴S。 磷素的礦化作用（或固定作用）與氮素有關(guān)。通常，磷素釋放在有利于氨化作用的條件下速度是最快的。因此，一些實(shí)驗(yàn)中可觀察到二者之間存在重要的相關(guān)性，礦化的氮是磷成為有效數(shù)量的 815 倍，同樣 C（ 釋放）和磷的礦化之間也有一定的相關(guān)性，大約100300： 1 的比例。這說(shuō)明在均衡的條件下微生物的礦化的 C:N:P 的比例類(lèi)似于這三種元素在腐殖質(zhì)中的比例。 土壤中許多有機(jī)磷可以在三種酶（磷酸酯酶，酯酸酶，磷酸激酶）的作用下轉(zhuǎn)變成植物可以利用的磷。如宋春勇（ 2001） 在缺磷土壤中施用植酸和卵磷脂時(shí)接種幾種菌根真菌（ ，對(duì)根際土壤測(cè)定表明：菌根菌增加了土壤酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性，從而促進(jìn)了土壤難溶性有機(jī)磷礦化及玉米和紅三葉草對(duì)磷的吸收。 菌磷代謝的特點(diǎn) 磷是微生物合成作用必不可少的重要元素，微生物區(qū)系的 形成 受棲居地中可利用的磷化合物數(shù)量的支配。如果磷濃度大于微生物營(yíng)養(yǎng)要求，則超過(guò)部分以無(wú)機(jī)磷酸鹽的方式釋放出來(lái)，如果不能滿(mǎn)足微生物區(qū)系生長(zhǎng)要求，則表現(xiàn)為固 定作用。在缺磷環(huán)境時(shí)，磷將會(huì)被微生物吸收利用。 1992）等研究細(xì)菌和浮游植物對(duì)難溶有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷的吸收時(shí)發(fā)現(xiàn)：細(xì)菌只在有機(jī)碳或者其他營(yíng)養(yǎng)鹽可利用性受到限制時(shí)，才對(duì)磷的利用限制。 磷饑餓狀態(tài)的綠藻和假單胞菌進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)假單胞菌對(duì)磷的吸收服從力學(xué)方程，而且二者在足夠的碳源的情況下都會(huì)發(fā)生對(duì)低濃度的磷和高濃度磷的競(jìng)爭(zhēng)。周岳溪等人（ 1994 年）對(duì)于廢水處理中的假單胞菌的磷攝取和釋放條件進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)缺磷的環(huán)境將會(huì)導(dǎo)致假單胞菌 的過(guò)量攝磷現(xiàn)象，而且無(wú)論經(jīng)過(guò)無(wú)碳厭氧、無(wú)碳好氧亦或無(wú)硫厭氧、無(wú)硫好氧的培養(yǎng)后，在富磷的培養(yǎng)基內(nèi)都會(huì)發(fā)生過(guò)量攝磷的現(xiàn)象。 菌磷代謝的分子調(diào)控 細(xì)胞中的磷代謝是復(fù)雜的 ， 但從根本上來(lái)說(shuō) ， 任何磷化合物的利用需要分兩步來(lái)進(jìn)行 ，即磷的吸收和無(wú)機(jī)磷合成 之后再利用 成多種化合物。對(duì)于微生物磷代謝調(diào)控一般來(lái)說(shuō)有兩種說(shuō)法：質(zhì)子動(dòng)勢(shì)和 節(jié)系統(tǒng)。在物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞的過(guò)程中 ， 主動(dòng)轉(zhuǎn)移是對(duì)于營(yíng)養(yǎng)吸收的一種主要的形式 ， 其所需的能量大多來(lái)源于質(zhì)子動(dòng)勢(shì) ( 它是質(zhì)子化學(xué)梯度和膜電勢(shì)梯度的總和。田淑媛 等經(jīng)研究實(shí)驗(yàn)后認(rèn)為 ， 從細(xì)菌學(xué)角度來(lái)說(shuō) ， 細(xì)菌質(zhì)子移動(dòng)力中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第一章 緒論 6 在吸磷和釋磷過(guò)程中起決定性作用 ， 主要是控制 粒在細(xì)胞內(nèi)的積累和消耗 ， 其研究認(rèn)為醋酸鹽的釋放量與凈磷酸鹽的消耗量成正比關(guān)系。厭氧條件下溶磷菌中的 速合成 ， 好氧時(shí)溶磷菌富養(yǎng)則消耗大量的 內(nèi)源物質(zhì) ， 產(chǎn)生 外部的磷主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)到體內(nèi)合成 時(shí)也對(duì)產(chǎn)堿菌 ( 粒進(jìn)行了研究 ， 發(fā)現(xiàn)在營(yíng)養(yǎng)充足的情況下 ， 采用動(dòng)力學(xué)分析醋酸鹽對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和 形成的影響 ， 其生長(zhǎng)的速率隨著醋酸鹽濃度的增加而降低 ， 并遵循指數(shù)生長(zhǎng)曲線(xiàn)。 夏琪等認(rèn)為細(xì)菌的磷代謝的分子調(diào)控機(jī)制由一種兩組分調(diào)節(jié)系統(tǒng) 控制。它是由結(jié)構(gòu)和功能類(lèi)似的兩種蛋白族的成員組成的一類(lèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng) ， 它控制著磷的最終歸宿。這一系統(tǒng)控制著一大類(lèi)細(xì)菌適應(yīng)性的反應(yīng) ， 磷的代謝始終與 控子息息相關(guān)。在分子生物學(xué)水平上 ， E. 酸鹽調(diào)節(jié)子稱(chēng)為 節(jié)子 ， 由 20 多個(gè)不相連的磷酸鹽調(diào)節(jié)基因組成 ， 這些調(diào)節(jié)基因受磷酸鹽饑餓的誘導(dǎo) ， 培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)磷酸根離子 (濃度逆向調(diào)節(jié)這群基因 ， 而 子正向激活它們。 子是 因的表達(dá) 產(chǎn)物 ， 是典型的 能結(jié)合在被調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子上游的特異靶序列。當(dāng)細(xì)菌感受到低磷脅迫時(shí) ，會(huì)起著自身磷酸化酶和蛋白激酶的雙重作用 ， 使 酸化 ， 磷酸化的 活節(jié)子的基因轉(zhuǎn)錄 ， 使細(xì)菌細(xì)胞加快磷轉(zhuǎn)運(yùn)速率和誘導(dǎo) 因合成大量的胞內(nèi)堿性磷酸酶并分泌到細(xì)胞的周質(zhì)空間。 磷效果的研究方法 微生物溶磷能力的測(cè)定一般可分為定性和定量?jī)煞N方法，定性的以平板法為代表，即將溶磷菌株在含有難溶性磷酸鹽或有機(jī)磷的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，測(cè)定周?chē)渲車(chē)a(chǎn)生透明圈的大小，這是一種簡(jiǎn)單而方便的定性檢測(cè)磷細(xì)菌的方法。在此基礎(chǔ)上，有人在培養(yǎng)基里添加緩沖劑以便更進(jìn)一步評(píng)價(jià)溶磷效果。 定量的測(cè)定包括液體培養(yǎng)法和土壤（或沙培）培養(yǎng)法，前者測(cè)定培養(yǎng)液中可溶性磷的含量，后者在土壤浸提液中測(cè)定其有效磷的含量。在液體培養(yǎng)法中如何將溶磷菌分解的無(wú)機(jī)磷浸提出來(lái)并加以測(cè)定，不同的研究者采用的方法可分為：培養(yǎng)液過(guò)濾法，離心取上清法，熏蒸、消煮法等。對(duì)處理后的培養(yǎng)液中磷含量則一般采用鉬藍(lán)比色法，其原理是利用一定的酸度條件下，加鉬酸銨于含磷的溶液中，溶液中的正磷酸與鉬酸絡(luò)合形成磷鉬雜多酸。在適宜試 劑濃度下，加入適當(dāng)?shù)倪€原劑（如抗壞血酸），使鉬磷酸中的一部分 子被還原為生成一種叫做“鉬藍(lán)”的物質(zhì)，當(dāng)將含不溶性無(wú)機(jī)磷的培養(yǎng)液經(jīng)鉬磷試劑處理后，則培養(yǎng)液發(fā)生顏色變化，通過(guò)比色法間接求出培養(yǎng)液中水溶性磷的含量。 同位素示蹤法：通過(guò)測(cè)定植物體內(nèi) 32P 的增加量來(lái)測(cè)定菌體的溶磷效果。具體方法是在含標(biāo)記有 32P 的不溶性磷化合物（有機(jī)磷或無(wú)機(jī)磷）的培養(yǎng)基內(nèi)接種供試菌株，使菌體在培養(yǎng)過(guò)程中吸收 32P，再用含 32P 的菌體培育植物幼苗，同時(shí)以?xún)H含 32P 而不含菌體的培養(yǎng)基為對(duì)照。測(cè)定該植株由標(biāo)記的菌體內(nèi)吸入的 32P 量比對(duì)照的增加量，即可得到結(jié)果。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第一章 緒論 7 磷細(xì)菌的促生作用 當(dāng)磷細(xì)菌作為生物肥施入田間時(shí)，在磷細(xì)菌和植物根系形成的微生態(tài)中，植物根部的脫落物和分泌物不斷地向磷細(xì)菌提供營(yíng)養(yǎng)，加速其生長(zhǎng)；同時(shí)磷細(xì)菌產(chǎn)生的剩余有效磷提供給植物，刺激植物快速生長(zhǎng)，溶磷反應(yīng)的產(chǎn)物不斷的被植物吸收，根際微生態(tài)中的溶磷動(dòng)力學(xué)的平衡點(diǎn)向形成產(chǎn)物的方向移動(dòng)。有的微生物在溶磷的同時(shí)還具有促生作用，從而利于農(nóng)作物的生長(zhǎng)。 大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示，溶磷微生物除了具有溶解土壤和外源難溶磷的作用，還有能夠提高作物產(chǎn)量的效果，其增產(chǎn)的機(jī)制是多方面的 ： 溶磷作用和促進(jìn)作物對(duì)磷的吸收 溶磷微生物的溶磷作用為作物提供了較多的磷素，對(duì)作物的生長(zhǎng)具有非常重要的作用，如 1995)報(bào)道，溶磷微生物與固氮菌單一接種和混合接種都能提高大麥的產(chǎn)量。他認(rèn)為二者交互作用的機(jī)理是為作物提供了較平衡的營(yíng)養(yǎng)和改善的作物根系對(duì) N、 P 的吸收。 分泌植物激素物質(zhì) 有些溶磷微生物除了具有溶磷活性還在植物根際分泌一些植物激素，從而起到促進(jìn)作物生長(zhǎng)的效果。 1976）從根際分離出 50 株溶磷細(xì)菌，對(duì)它們產(chǎn)生的激素進(jìn)行分析，結(jié)果表明，有 20 株分泌 霉素 細(xì)胞分裂素 ， 43 株產(chǎn) 9 株產(chǎn)生赤霉素， 45 株產(chǎn)細(xì)胞分裂素。而 1978）則觀察到溶磷菌株 兩株產(chǎn)生 3 1999）對(duì)從小麥根際分離出的 164 株溶磷菌進(jìn)行化學(xué)誘變，得到 5 株突變株，隨后進(jìn)行溶磷能力和 果顯示，野生菌和突變株都能產(chǎn)生 而可以認(rèn)為，某些菌株可通過(guò)分泌的激素物質(zhì)對(duì)植物的生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用。 溶磷微生物抑制病原菌生長(zhǎng) 一些研究表明，溶磷微生物 具有抑制土壤病原菌，降低病害的作用。 1968）在田間用溶磷菌 為玉米種子包衣，能夠顯著抑制由 f. sp 粉鐮刀菌）引起的玉米苗腐病，取得了與殺菌劑拌種相同的效果。類(lèi)似的研究也揭示出一些溶磷微生物具有抑制病原菌和減輕病害的作用，但這并不能肯定所有的溶磷微生物都具有這種特性。 植物和細(xì)菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)有相互關(guān)系，因?yàn)樗鼈兊纳L(zhǎng)經(jīng)常被同一種營(yíng)養(yǎng)源所限制，這種限制性營(yíng)養(yǎng)源主要是有效磷。有效 磷是刺激細(xì)菌和植物生長(zhǎng)的因子，但對(duì)植物的刺激作用遠(yuǎn)大于對(duì)細(xì)菌的作用。劉麗麗在純培養(yǎng)搖瓶試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)初期磷細(xì)菌在新的生長(zhǎng)環(huán)境 (磷礦粉為唯一磷源 )中，處于適應(yīng)期，此時(shí)有少量有效磷存在，這些磷源完全可以刺激磷細(xì)菌生長(zhǎng)。適應(yīng)期以后，磷細(xì)菌快速生長(zhǎng)，并在其生長(zhǎng)代謝過(guò)程中迅速將無(wú)效磷轉(zhuǎn)化為有效磷，隨時(shí)間的推移，有效磷的量也隨之升高。另有研究亦指出根際微生物的活性及其群落結(jié)構(gòu)對(duì)植物磷素營(yíng)養(yǎng)影響很大，即植物根際磷細(xì)菌的數(shù)量影響根際磷營(yíng)養(yǎng)的可給性。在這個(gè)過(guò)程中磷細(xì)菌可以將無(wú)效磷轉(zhuǎn)化為植物營(yíng)養(yǎng)磷，并且隨磷細(xì)菌數(shù)量增加而增加，在一 定范圍內(nèi)隨土壤中全磷特別是無(wú)效磷 (磷礦粉 )量的增加而增加。另一方面，對(duì)于長(zhǎng)期施用化肥，特別是已經(jīng)造成土壤板結(jié)的耕層，在施用磷細(xì)菌生物肥后，將對(duì)活化土壤、增加磷營(yíng)養(yǎng)的可給性帶來(lái)很大改善。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第一章 緒論 8 菌溶無(wú)機(jī)磷相關(guān)基因的研究 溶磷微生物的研究從上個(gè)世紀(jì) 80 年代進(jìn)入了分子生物學(xué)水平，其中對(duì)溶磷細(xì)菌促進(jìn)無(wú)機(jī)磷溶解的研究相對(duì)較多。其中 草生歐文氏菌（ 克隆到的咯并喹啉醌 )合成基因 (具代表性，其編碼產(chǎn)物可以促進(jìn)細(xì)菌對(duì)無(wú)機(jī)磷的溶解利用，該基因 編碼產(chǎn)物是 徑中葡萄糖脫氫還原酶的輔酶，能對(duì)細(xì)菌利用葡萄糖并產(chǎn)酸起到關(guān)鍵作用。 該基因亞克隆并融合到廣范圍質(zhì)粒載體（ 構(gòu)建重組質(zhì)粒 大腸桿菌中表達(dá)，然后再轉(zhuǎn)化到洋蔥假單胞菌（ 成團(tuán)腸桿菌（ ，利用三親本雜交技術(shù)，在以磷酸三鈣為唯一磷源的選擇性培養(yǎng)基中獲得的轉(zhuǎn)化子顯示出具有較大的溶磷圈。之后 隆到 因。 從洋蔥假單胞菌（ 中分離出基因 存在于細(xì)胞膜上的組氨酸通透酶系統(tǒng)中的膜結(jié)合蛋白 有高度同源性，推測(cè)它可能與膜的通透性相關(guān)，編碼某種調(diào)節(jié) 成的蛋白，但與目前已克隆到的 因無(wú)同源性。從上面的研究可以發(fā)現(xiàn)因?qū)?xì)菌溶磷機(jī)制并未完全清楚，所以克隆到的有關(guān)細(xì)菌促進(jìn)無(wú)機(jī)磷溶解的基因大多與細(xì)菌產(chǎn)酸有直接關(guān)系或起調(diào)解作用，至于其它種類(lèi)的溶無(wú)機(jī)磷基因尚未有明確報(bào)道。 菌種群的現(xiàn)代鑒 定技術(shù) 一般來(lái)說(shuō)，細(xì)菌種群的鑒定方法包括兩大類(lèi)，即表型的方法和遺傳學(xué)的方法。生物的表型信息來(lái)源于蛋白質(zhì)及其功能、各種不同的化學(xué)標(biāo)示、以及大量的諸如形態(tài)、生理生化、免疫等特征的表達(dá)，因此表型的方法就是對(duì)這些特征的測(cè)定。常用的表型方法主要有：全細(xì)胞可溶性電泳分析、多位點(diǎn)酶電泳分析、全細(xì)胞脂肪酸分析、血清學(xué)反應(yīng)、胞外多糖分析等。而遺傳學(xué)方法根據(jù)生物核酸分析的遺傳特征作為分類(lèi)指標(biāo)，能較為客觀地反映微生物的親緣關(guān)系。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用于發(fā)展，各種有關(guān)核酸的分析技術(shù)被大量引入到微生物分類(lèi)研究中。這些方法歸結(jié)起來(lái)是 在三個(gè)層面的細(xì)菌遺傳物質(zhì)上進(jìn)行分析的： 1）在細(xì)菌總基因組層面上的分析方法。主要包括隨機(jī)擴(kuò)增 段的多態(tài)性（ 紋圖譜分析、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（ 紋圖譜分析、基因組 堿基組成（ G+測(cè)定和基因組 交同源性分析等。 2）在具有進(jìn)化比較意義上的特定基因或序列層面上的遺傳分析。主要包括 16S 因、 23S 因及其基因間隔區(qū)序列等基因的序列分析及各類(lèi)酶切電泳圖譜分析或探針雜交方法。這些方法不僅可以在分類(lèi)中對(duì)大量菌株進(jìn)行遺傳學(xué)上的分群，而且是系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 建樹(shù)的主要依據(jù)。尤其是 16S 因的序列測(cè)定比較分析是目前細(xì)菌分類(lèi)的主要數(shù)據(jù)來(lái)源。 3）基于染色體外遺傳物質(zhì)層面上的研究，這里一般指細(xì)菌質(zhì)粒類(lèi)型的電泳圖譜分析。當(dāng)前分類(lèi)方法多種多樣，尤其是遺傳學(xué)分類(lèi)方法更是浩如煙海，目前還在不斷的發(fā)展中。在實(shí)際操作中，人們則將表型的方法和遺傳學(xué)的方法結(jié)合起來(lái)開(kāi)展工作。下面就本論文中涉及到的一些方法簡(jiǎn)介如下。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士論文 第一章 緒論 9 生物全自動(dòng)鑒定系統(tǒng) 用于細(xì)菌快速鑒定的方法和技術(shù)很多，近年已相繼開(kāi)發(fā)出一些微生物鑒定系統(tǒng)。例如統(tǒng)、 統(tǒng)、 統(tǒng)及 統(tǒng)等。其中 統(tǒng)利用細(xì)菌對(duì) 95種不同碳源的代謝情況來(lái)鑒定菌種，即每種菌種形成各自特有的代謝指紋圖譜，選用四唑紫作為細(xì)菌能否利用供試碳源的指示劑，其中碳源包括糖、醇、酸、胺、酯和大分子聚合物。種化學(xué)鑒定方法在于分析細(xì)菌代謝的氧化還原過(guò)程而不是他們的代謝副產(chǎn)物（如產(chǎn)酸、產(chǎn)氣）。細(xì)菌如果能利用供試碳源，則某種碳源的孔顯示紫色。經(jīng)計(jì)算機(jī)自動(dòng)與數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)已知菌比較，可把供試菌株鑒定到種、亞種水平上。 該系統(tǒng)主要由系統(tǒng)軟件、計(jì)算機(jī)系統(tǒng)、高精密閱讀器、微量檢測(cè)板、濁度計(jì)、 8 通道移液器及 其他輔助設(shè)備組成。其中系統(tǒng)軟件中主要包括革蘭氏陰性菌數(shù)據(jù)庫(kù)（ 革蘭氏陽(yáng)性菌數(shù)據(jù)庫(kù)（ 厭氧菌數(shù)據(jù)庫(kù)（ 、酵母菌數(shù)據(jù)庫(kù)（ 絲狀真菌數(shù)據(jù)庫(kù)（ 其他輔助運(yùn)行軟件。其中 4 個(gè)屬；G+菌包括 46 個(gè)屬。目前 生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)是一種具有較高標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化程度的專(zhuān)家鑒定系統(tǒng)，它能快速、準(zhǔn)確的鑒定菌種，國(guó)際上已承認(rèn)該鑒定系統(tǒng)。由于它因具有數(shù)據(jù)庫(kù)大，鑒定范圍廣，自動(dòng)化程度高、操作簡(jiǎn)便、快 速鑒定菌種等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床、獸醫(yī)、生物技術(shù)、藥物、食品和水、生物防治、植物病理、海洋生物、微生物生態(tài)和科研等方面。 于 16S 列的方法 原核生物 (細(xì)菌和古生菌 )核糖體的 有 3 種類(lèi)型： 23S、 16S 和 5S 們的大小分別為 2900、 1540