sds聚丙烯酰胺凝膠電泳簡單原理和步驟上課講義.ppt

實(shí)驗(yàn)十五 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 一 概述 蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳 PAGE 是蛋白質(zhì)分析過程中最常用的技術(shù) 通常在電泳分離時(shí) 其遷移率主要取決于蛋白質(zhì)本身所帶的電荷多少 分子量大小和形態(tài) 但如在PAGE中加入陰離子去污劑SDS SDS將蛋白質(zhì)的二硫鍵 氫鍵及梳水鍵打開 使蛋白質(zhì)變性 SDS將包裹在變性蛋白表面 使蛋白質(zhì)成為剛性分子 同時(shí) 由于SDS帶有大量負(fù)電荷 使蛋白質(zhì)本身帶有的電荷可忽略 至此情況下 不同蛋白質(zhì)分子的遷移率主要決定于帶有的SDS量 即蛋白質(zhì)分子的大小 因此利用SDS PAGE可測定蛋白質(zhì)的分子量 二 試劑 丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺單體溶液 Acr和Bis 稱取丙烯酰胺30g 甲叉雙丙烯酰胺0 8g 加水至100ml 過濾后存于棕色瓶中 于4 保存 4X分離膠緩沖液稱取Tris18 17g 加入10 SDS貯備液4ml 用12mol LHCl調(diào)pH至8 8 定容至100ml 4X濃縮膠緩沖液稱取Tris6 06g 加入10 SDS4ml 用l2mol LHCI調(diào)pH至6 8 定容至100ml 10 過硫酸銨稱取過硫酸銨0 5g 加水至5ml 本儲(chǔ)存液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用 10X電極緩沖液稱取Tris30g 甘氨酸144g 加入10 SDSl00ml 定容至1000ml 2X樣品緩沖液稱取蔗糖2g 或甘油2m1 加入10 SDS2ml 溴酚藍(lán)0 25mg 濃縮膠緩沖液2 5ml 巰基乙醇0 5ml 加水定容至10ml 染色液稱取考馬斯亮藍(lán)R 2502 5g 加入甲醇450ml 冰乙酸l00ml 水650ml 脫色液甲醇100ml 冰乙酸100ml 加水800m1 三 操作步驟 1 分離膠的制備 1 根據(jù)所分離的蛋白質(zhì)分子量選擇分離膠的濃度 制備不同濃度的凝膠所需的儲(chǔ)備液可參考下表 該配方可配制0 75mm厚 10cmX7cm的凝膠 在配制凝膠時(shí) 將水 30 Acr和Bis儲(chǔ)液 4X分離膠儲(chǔ)液混合完全后 真空脫氣5分鐘 然后加入過硫酸胺和TEMED 立即準(zhǔn)備灌制凝膠 2 將混合液充分混合后 緩慢地倒入已經(jīng)固定在夾心垂直平板電泳槽里的狹槽中 注意在本操作過程中不能產(chǎn)生任何氣泡 然后盡快地在分離膠的上面輕輕地覆蓋一層水 3 置于室溫下15 30分鐘 使凝膠聚合完全 在水相和凝膠的交界處有一明顯的亮線 除去上層水相 然后再用水或濃縮膠緩沖液 0 125mol m1Tris HCI pH6 8 0 1 SDS 洗凝膠表面 準(zhǔn)備灌制濃縮膠 不同濃度凝膠的制備 2 濃縮膠制備的方法 1 將丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺單體儲(chǔ)備液0 6ml 濃縮膠緩沖液888u1 水2ml 10 過硫酸銨56ul TEMEDl0ul混合均勻后 立即灌膠 2 將預(yù)先制備好的濃縮膠慢慢地灌進(jìn)狹槽中 然后將所需的樣品梳 形成加樣孔 插于夾心槽上部 并上下輕輕拉動(dòng)梳子 小心地去除粘附在梳齒頂部的小氣泡 待聚合完全后即可拔去梳子 準(zhǔn)備電泳 3 樣品制備及電泳 1 樣品處理 蛋白質(zhì)樣品和分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在上樣電泳前均需變性 通常是將樣品蛋白質(zhì)溶液與等體積的樣品緩沖液混合后置于eppendorf管中 將混合物置于95 100 加熱5分鐘 立即置于冰上 或于 20 儲(chǔ)存 以便再次分析時(shí)使用 2 上樣 樣品制備好以后 即可上樣電泳 先將樣品梳子移去 用雙蒸水淋洗每個(gè)樣品孔 然后在樣品孔中加入電泳緩沖液 同時(shí)在電泳槽中也加滿電泳緩沖液 處理完畢后 根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要加樣電泳 3 電泳 通常使用穩(wěn)流的方式進(jìn)行電泳 電流一般為18mA 時(shí)間大約3 4小時(shí) 4 凝膠的染色與脫色 電泳完畢后 倒去電泳緩沖液 取出夾心槽 小心地取出凝膠 置于染色液中染色4小時(shí) 并不時(shí)地輕輕晃動(dòng) 染色完畢后 倒去染色液 用少量水淋洗凝膠 然后置于脫色液中脫色 并輕輕晃動(dòng) 脫色至藍(lán)色背景消失為止 此凝膠即可用于分析 考馬斯亮藍(lán)檢測靈敏度為0 3 1ug