基因診斷和基因治療.ppt

第二十一章 基因診斷與基因治療GeneticDiagnosisandGeneTherapy 基因 gene 基因是為生物活性產(chǎn)物編碼的DNA功能片斷 這些產(chǎn)物主要是蛋白質(zhì)或各種RNA 基因變異致病類型 內(nèi)源基因的變異基因結(jié)構(gòu)突變基因表達(dá)異常 外源基因的入侵 第一節(jié) 基因診斷GeneDiagnosis 二 分類DNA診斷 以DNA為檢測(cè)對(duì)象的診斷方法 RNA診斷 以mRNA為檢測(cè)對(duì)象的診斷方法 一 基因診斷的概念和特點(diǎn) 一 定義利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法 直接檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常 從而對(duì)疾病作出診斷的方法 三 特點(diǎn)針對(duì)性強(qiáng)特異性高靈敏度高適用性強(qiáng) 診斷范圍廣 二 基因診斷常用技術(shù)方法 一 核酸分子雜交技術(shù) 二 聚合酶鏈反應(yīng) 三 基因測(cè)序 四 基因芯片 五 DNA指紋 一 核酸分子雜交 molecularhybridization 技術(shù) 核酸分子雜交可用以檢測(cè)樣本中是否存在與探針序列互補(bǔ)的同源核酸序列 核酸探針是一類具有放射性標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記的并與目的目的DNA或RNA分子序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段 探針是能夠同某種待研究的核酸序列或蛋白多肽鏈特異結(jié)合的任何分子 經(jīng)標(biāo)記之后可用來檢測(cè)目的DNA RNA或蛋白質(zhì)分子 實(shí)驗(yàn)流程 提取DNA 限制酶切 凝膠電泳 膜轉(zhuǎn)移 雜交 放射自顯影 分析 建立在核酸雜交技術(shù)基礎(chǔ)上的常用基因診斷方法 1 限制性內(nèi)切酶 restrictionendonuclease 酶譜分析法2 DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 restrictionfragmentlengthpolymorphism RFLP 分析法3 等位基因特異寡核苷酸 allelespecificoligonucleotide ASO 探針雜交法 1 限制性內(nèi)切酶酶譜分析法 是利用限制性內(nèi)切酶和特異性DNA探針來檢測(cè)是否存在基因變異的一種方法 Mst 酶切位點(diǎn) CCTNAGG 5 3 正常基因 突變基因 1 15kb 1 35kb 鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析 A T 0 2kb 1 15kb 1 35kb 正常人 突變攜帶著 患者 鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析 2 DNA RFLP分析法 中性突變是指在人基因組中 平均每200對(duì)堿基可發(fā)生一對(duì)變異的現(xiàn)象 DNA多態(tài)性是指中性突變導(dǎo)致個(gè)體間核苷酸序列的差異 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性是指DNA多態(tài)性若發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)上 酶切水解該DNA片段就會(huì)產(chǎn)生長(zhǎng)度不同的片段 RFLP分析法 3 ASO雜交法 根據(jù)已知基因突變位點(diǎn)的核苷酸序列 人工合成相應(yīng)于正常和突變基因堿基序列的兩種寡核苷酸探針 用它們分別與受檢者DNA進(jìn)行分子雜交來檢測(cè)是否存在等位基因突變 ASO雜交法 探針 MNMNMNMN正?；蚣兒贤蛔冸s合突變基因缺陷 新的突變類型 二 聚合酶鏈反應(yīng) polymerasechainreaction PCR 是利用特異的引物 特異地?cái)U(kuò)增目的DNA的方法 實(shí)驗(yàn)流程 提取DNA PCR 凝膠電泳 顯色 分析 5 Primer1 5 Primer2 5 5 TemplateDNA 1 基本工作原理 2 常用的PCR方法 常規(guī)PCR 巢式PCR 多重PCR 多種PCR 不對(duì)稱PCR 反轉(zhuǎn)錄PCR 定量反轉(zhuǎn)錄PCR mRNA差異顯示PCR 原位PCR 實(shí)時(shí)PCR等等 3 在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上的常用基因診斷方法 PCR SSCP法 PCR ASO法PCR RFLP法PCR 限制酶譜法PCR STR 短串聯(lián)重復(fù)序列 shorttandemrepeat SSCP是指相同長(zhǎng)度的單鏈DNA因其堿基序列不同 甚至單個(gè)堿基不同 都可能形成不同的空間構(gòu)象 從而在中性聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)泳動(dòng)速率不同的現(xiàn)象 單鏈構(gòu)象多態(tài)性 singlestrandconformationpolymorphism SSCP PCR SSCP分析 是指PCR產(chǎn)物變性后 經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳 正常基因和變異基因的遷移位置不同 借此可分析確定致病基因的存在 正常人 純合突變 雜合突變 Leber遺傳性神經(jīng)病患者PCR SSCP分析 線粒體DNA第11778位G A所致 三 基因測(cè)序 genesequencing 即測(cè)定某一基因的堿基序列 實(shí)驗(yàn)流程 提取DNA 分離出有關(guān)基因 測(cè)序 分析診斷基因測(cè)序的方法 化學(xué)裂解法DNA鏈末端合成終止法DNA自動(dòng)測(cè)序 四 基因芯片 genechip 基因芯片 又稱DNA芯片 DNA陣列 寡核苷酸微芯片 DNAchip DNAarrays oligonucleotidemicro chip 是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針 有規(guī)律地排列固定于支持物上 然后與待測(cè)的標(biāo)記樣品的基因按堿基配對(duì)原理進(jìn)行雜交 再通過激光聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描 并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的熒光信號(hào)作出比較和檢測(cè) 從而迅速得出定性和定量的結(jié)果 基因芯片的應(yīng)用 1 在診斷中的應(yīng)用核酸序列分析 基因表達(dá)分析 尋找新基因 突變基因和基因多態(tài)性檢測(cè)等2 在藥學(xué)研究中的應(yīng)用藥物篩選 藥物作用機(jī)制研究 耐藥菌株 藥敏檢測(cè) 毒理學(xué)研究 環(huán)境化學(xué)毒物的篩選 基因掃描等 五 DNA指紋 DNAfingerprint 在人基因組DNA中有高度可變的 小衛(wèi)星 區(qū)域 采用 小衛(wèi)星 基因探針 在同一限制酶切產(chǎn)物的DNA雜交圖譜上 同一個(gè)體不同組織來源的DNA的譜帶完全一致 而不同個(gè)體之間 同卵雙生除外 譜帶都不相同 如同人的指紋具有高度個(gè)體特異性一樣 因此這種雜交圖譜被稱為DNA指紋或遺傳指紋 geneticfingerprint 簡(jiǎn)言之 DNA指紋或遺傳指紋是指采用 小衛(wèi)星 基因探針進(jìn)行DNA分子雜交 Southern印跡 Southernblotting 所得的圖譜 實(shí)驗(yàn)流程 提取DNA 限制酶切 凝膠電泳 膜轉(zhuǎn)移 雜交 放射自顯影 分析 三 基因診斷的應(yīng)用 遺傳疾病腫瘤感染性疾病傳染性流行病判斷個(gè)體疾病易感性器官移植組織配型法醫(yī)學(xué)中個(gè)體識(shí)別 親子鑒定 總結(jié) 基因診斷的概念 特點(diǎn) 常用的技術(shù)方法及應(yīng)用 復(fù)習(xí)題 1 名詞解釋 基因診斷 DNA診斷 RNA診斷 RFLP分析 SSCP 基因芯片 DNA指紋2 簡(jiǎn)述基因診斷的特點(diǎn) 常用技術(shù)方法及可用于診斷的疾病 簡(jiǎn)述基因變異致病的類型及內(nèi)源性基因變異的類型 簡(jiǎn)述限制性內(nèi)切酶譜分析法 ASO探針雜交法 PCR SSCP分析 基因芯片 DNA指紋等的實(shí)驗(yàn)流程 第二節(jié) 基因治療GeneTherapy 一 基因治療的概念早期是指用正常的基因整合入細(xì)胞基因組 以校正和置換致病基因的一種治療方法 目前廣義上來講是指將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi) 使其在體內(nèi)發(fā)揮作用 以達(dá)到治療疾病目的的方法 一 基因治療的概念 二 基因治療的基本方法1 基因矯正 genecorrection 2 基因置換 genereplacement 3 基因增補(bǔ) geneaugmentation 4 基因失活 geneinactivation 1 基因矯正 genecorrection 指將致病基因的異常堿基進(jìn)行糾正 而正常部分予以保留 納米鉗 AGCTGTGAAGTCGTGTCGACACTTCAGCAC abnormalgene Genecorrection normalgene CG 2 基因置換 genereplacement 指用正常的基因通過體內(nèi)基因同源重組 原位替換致病基因 使細(xì)胞內(nèi)的DNA完全恢復(fù)正常狀態(tài) Genereplacement 3 基因增補(bǔ) geneaugmentation 將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其他細(xì)胞 不去除異?；?而是通過目的基因的非定點(diǎn)整合 使其表達(dá)產(chǎn)物彌補(bǔ)缺陷基因的功能或使原有基因表達(dá)增強(qiáng) Geneaugmentation 4 基因失活 geneinactivation 指將特定的序列導(dǎo)入細(xì)胞后 在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平阻斷某些基因的異常表達(dá) 已達(dá)到治療疾病的目的 幾種常見的基因失活技術(shù) 反義核酸技術(shù)核酶技術(shù)三鏈技術(shù)干擾RNA技術(shù)肽核酸基因敲除 反義 antisence 核酸技術(shù) 是指用人工合成的RNA或DNA來阻斷基因的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制 使編碼基因不能轉(zhuǎn)錄為mRNA 因而不能翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì) 反義RNA技術(shù) 反義RNA是指與mRNA互補(bǔ) 且能抑制與疾病發(fā)生直接相關(guān)基因表達(dá)的RNA 反義RNA技術(shù)是指利用反義RNA在mRNA水平上封閉基因表達(dá) 最終可通過調(diào)節(jié)劑量 來治療由基因突變或過度表達(dá)所致的疾病或嚴(yán)重感染性疾病 Geneinactivation abnormalmRNAUCGACACAUUCAGCAC 反義RNAAGCUGUGUAAGUCGUG Abnormalprotein Abnormalprotein 核酶 ribozyme 技術(shù) 通過核酶分子結(jié)合到靶RNA分子中適當(dāng)?shù)牟课?形成錘頭核酶結(jié)構(gòu) 催化對(duì)靶RNA分子的剪切 從而破壞靶RNA分子達(dá)到治療疾病的目的 5 3 5 3 靶RNA 核酶分子 核酶技術(shù) 三鏈技術(shù) triplexapproach 又稱為反基因策略 antigenestragegy 是利用脫氧寡核苷酸能與雙螺旋雙鏈DNA專一性序列結(jié)合 形成三鏈DNA 從而在轉(zhuǎn)錄水平或復(fù)制水平阻止基因轉(zhuǎn)錄或復(fù)制的技術(shù) 能形成三鏈DNA的脫氧寡核苷酸稱為三鏈DNA形成脫氧寡核苷酸 triplex formingoligonucleotide TFO 復(fù)制 轉(zhuǎn)錄 三鏈DNA技術(shù) 干擾RNA interferenceRNA RNAi 技術(shù) RNAi是指在特定因子作用下 有導(dǎo)入胞內(nèi)的雙鏈RNA降解生成的約22nt左右的SiRNAs singlestrandRNAi RNAi技術(shù)是指利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原則 使RNAi和靶DNA結(jié)合 同時(shí)誘導(dǎo)激活體內(nèi)的基因沉默因子 從而使靶DNA降解 dsRNA RNAi DNA RNA DNA降解 干擾RNA技術(shù) RNAi RNAi技術(shù)的特點(diǎn) 特異性強(qiáng)效率性高作用時(shí)間長(zhǎng)可通過細(xì)胞屏障而發(fā)揮作用 肽核酸 peptidenucleicacid PNA 技術(shù) PNA是指DNA 肽復(fù)合物 PNA技術(shù)是利用多肽與DNA的特異性結(jié)合 專一地抑制某一基因的表達(dá) 肽 肽核酸技術(shù) 基因敲除 geneknock out 技術(shù) 指有目的的去除動(dòng)物體內(nèi)某種基因的技術(shù) 三 基因治療的其他方法 1 自殺基因 的應(yīng)用某些病毒或細(xì)菌的基因所表達(dá)的酶能將對(duì)人體無毒或低毒的藥物前體在人體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性產(chǎn)物 從而導(dǎo)致攜帶該基因的受體細(xì)胞也被殺死 故稱這類基因?yàn)樽詺⒒?自殺基因無毒 低毒的藥物前體 細(xì)胞毒性產(chǎn)物 細(xì)胞死亡 2 基因疫苗的應(yīng)用將編碼外源性抗原的基因插入到含真核表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒上 然后將質(zhì)粒直接導(dǎo)入人或動(dòng)物體內(nèi) 讓其在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抗原蛋白 誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答 重組表達(dá)質(zhì)粒 外源性抗原基因 基因疫苗 二 基因治療的基本程序 一 治療性基因的選擇目的基因的選擇 二 基因載體的選擇 三 靶細(xì)胞的選擇 四 基因轉(zhuǎn)移 五 外源基因表達(dá)的篩選利用載體中的標(biāo)記基因有neor標(biāo)記基因時(shí) 用418進(jìn)行篩選 六 回輸體內(nèi)靜脈回輸自體骨髓移植埋入皮下組織 病毒載體 非病毒載體 體細(xì)胞生殖細(xì)胞 間接體內(nèi)療法 exvivo 直接體內(nèi)療法 invivo 常見基因載體的優(yōu)缺點(diǎn)載體優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組小并且簡(jiǎn)單僅感染分裂細(xì)胞穩(wěn)定整合于宿主基因組隨機(jī)整合可能導(dǎo)致突變生物學(xué)特性清楚常常只有短暫表達(dá)可高效轉(zhuǎn)入復(fù)制中的細(xì)胞病毒滴度低107pfu ml對(duì)宿主無害可能會(huì)于有復(fù)制能力的病毒重組腺病毒相關(guān)病毒基因組小未知可特異整合于人染色體19q需腺病毒輔助復(fù)制以人細(xì)胞作為宿主攜帶外源基因能力有限無毒 無致病性難得到高滴度病毒 腺病毒適用于原位使用 尤其是肺不與宿主基因整合在不分裂細(xì)胞中可進(jìn)行高效率只有短暫表達(dá)的體內(nèi)感染無特異性靶細(xì)胞病毒滴度高1010pfu ml病毒蛋白可引起免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)生物學(xué)特性清楚插入外源基因能力有限脂質(zhì)體無感染能力無特異性靶細(xì)胞理論上無DNA大小限制轉(zhuǎn)染效率低毒性低僅有短暫表達(dá) 體內(nèi)應(yīng)用困難受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)無感染能力轉(zhuǎn)染效率低特異性轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞體內(nèi)應(yīng)用困難理論上無DNA大