藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證課件

第四章藥物定量分析與分析方法的驗(yàn)證 樣品 包括生物樣品 的前處理定量分析方法及驗(yàn)證內(nèi)容 藥物分析課件 仁濟(jì)藥學(xué)專業(yè) 第一節(jié)樣品的前處理方法哪些藥品需要前處理何為不經(jīng)有機(jī)破壞處理何為有機(jī)破壞處理生物樣品前處理 一 需要前處理的樣品含金屬藥物 富馬酸亞鐵 葡萄糖酸銻鈉 枸櫞酸鉍鉀 葡萄糖酸鋅 酒石酸銻鉀等 含鹵素藥物 泛影酸 三氯叔丁醇 碘番酸 磺溴酞鈉等 生物樣品 血樣 尿液 唾液 頭發(fā)等 二 不經(jīng)有機(jī)破壞處理的分析方法直接測定法 適用于金屬原子不直接與碳原子相連的或某些C M鍵結(jié)合不牢固的有機(jī)金屬藥物 經(jīng)氧化還原后測定法 Zn 適合于鹵素結(jié)合于芳環(huán)上的藥物 經(jīng)水解后測定法適合于鹵素與脂肪碳鏈相連的藥物 適用于金屬原子或鹵素與碳原子結(jié)合牢固的有機(jī)金屬藥物 濕法破壞干法破壞 三 經(jīng)有機(jī)破壞處理的分析方法 高溫?zé)胱品ㄑ跗咳紵?1 濕法破壞 1 硝酸 高氯酸法 2 硝酸 硫酸法 3 硫酸 硫酸鹽法 4 其它濕法 注意 濕法破壞的儀器一般為凱氏燒瓶 試劑應(yīng)不含被測離子或干擾測定的成分 由于礦酸量數(shù)倍于樣品 須做空白實(shí)驗(yàn)校正 操作須在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行 2 高溫?zé)胱品?適用于濕法不易破壞完全的有機(jī)物以及某些不能用硫酸進(jìn)行破壞的有機(jī)藥物 經(jīng)高溫灼燒灰化 使有機(jī)結(jié)構(gòu)分解而待測元素轉(zhuǎn)化為無機(jī)元素 3 氧瓶燃燒法 Oxygenflaskcombustionmethod 將有機(jī)藥物放入充滿氧氣的密閉燃燒瓶中進(jìn)行燃燒 并將燃燒所產(chǎn)生的欲測物質(zhì)吸收于適當(dāng)?shù)奈找褐?然后根據(jù)欲測物質(zhì)的性質(zhì) 采用適宜的分析方法進(jìn)行鑒別 檢查或含量測定 適用于含鹵素 硫 氮 硒等有機(jī)藥物的分析 儀器裝置 無灰濾紙 透明膠紙 燃燒 催化 稱樣燃燒分解操作 通O21 2min 燃燒 吸收液水 NaOH 含碘 溴 氯藥物 例鹽酸胺碘酮 碘苯酯 甲狀腺粉水 H2O2 含硫藥物 例磺溴酞鈉水 含氟藥物 硝酸溶液 含硒藥物 四 生物樣品分析前處理技術(shù)一般考慮根據(jù)生物樣品種類血 除蛋白質(zhì)尿 綴合物水解唾液 除去粘蛋白 根據(jù)測定方法免疫分析 靈敏 專屬 前處理要求簡單光譜分析 靈敏 選擇性差 前處理要求高色譜分析 準(zhǔn)確 精密 專屬 除蛋白質(zhì) 根據(jù)藥物理化性質(zhì)酸堿度 溶解性 揮發(fā)性 紫外吸收性質(zhì)等藥物的濃度如ng ug mg級測定目的如藥代動力學(xué) 代謝分型等 去除蛋白質(zhì)目的 使藥物從結(jié)合狀態(tài)下釋放出來減少提取過程中的乳化消除干擾 保護(hù)色譜柱常用去蛋白方法 加入與水相混溶的有機(jī)溶劑 使蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變化而使蛋白質(zhì)凝聚 與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物被釋放出來 甲醇 乙醇 乙腈 丙酮 丙醇 四氫呋喃 一般離心速度在10000r min 用具塞塑料離心管 前處理方法 加入中性鹽 如 NH4 2SO4 Na2SO4等 將與蛋白質(zhì)水合的水置換出來 使蛋白質(zhì)脫水而沉淀 加入強(qiáng)酸 10 三氯乙酸 6 高氯酸等 在低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pH時 與蛋白質(zhì)陽離子形成不溶性鹽而沉淀 加入Zn2 Cu2 在高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pH時 與蛋白質(zhì)陰離子形成不溶性鹽而沉淀 酶解法 蛋白水解酶 枯草菌溶素 使組織酶解 釋放出藥物 不會發(fā)生乳化 對與蛋白結(jié)合牢固的藥物可顯著改善回收率 綴合物水解綴合物主要是葡萄糖醛酸苷綴合物 硫酸酯綴合物 谷胱甘肽綴合物等 綴合物極性較大 難被有機(jī)溶劑提取 故需先進(jìn)行水解 常用水解方法有 酸水解 如HCl 作用強(qiáng) 快 專屬性差酶水解 常用葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶或該兩種酶的混合酶 酶水解慢 專屬 較溫和溶劑解 較溫和 前處理方法 有機(jī)破壞提取純化液 液提取液 固提取被測組分的濃集衍生化反應(yīng) 液固萃取 液液萃取 前處理方法 第二節(jié)定量分析方法 化學(xué)分析法光譜分析法色譜分析法 重量分析法容量分析法 紫外分析法UV熒光分析法FIA 高效液相色譜HPLC氣相色譜GC 2005年版 中國藥典 中成藥含量測定方法概況 容量分析法 滴定 概念 一定濃度的滴定液由滴定管加到待測藥物溶液中 按化學(xué)計(jì)量反應(yīng)完全 根據(jù)滴定液濃度 體積及化學(xué)計(jì)量計(jì)算被測藥物含量 關(guān)鍵問題 等當(dāng)點(diǎn)的確定 滴定點(diǎn) 指示劑顯示的滴定終點(diǎn) 指示劑的變色點(diǎn) 等當(dāng)點(diǎn) 反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量點(diǎn) 消耗的滴定液的摩爾數(shù) 被測物摩爾數(shù) 特點(diǎn) 操作簡便 快速 實(shí)驗(yàn)條件易實(shí)現(xiàn) 但是靈敏度低 通常用于高含量和中含量藥物滴定方式 直接滴定法剩余滴定法置換滴定法 含量的計(jì)算 定量關(guān)系 aAbB被測藥物滴定液 化學(xué)計(jì)量關(guān)系nA a nB bWA aMA WB bMB 滴定度 1mL某物質(zhì)的量濃度的滴定液相當(dāng)于被測藥物的重量 中國藥典用mg表示 滴定度的計(jì)算 T 滴定度 mg ml c 滴定液濃度 mol L M 被測物質(zhì)分子量 以I2 0 05mol l 計(jì) 反應(yīng)摩爾比1 1 例 直接滴定法含量 100 實(shí)際工作中配制的滴定液濃度與藥典中的規(guī)定濃度不一致 須引入滴定液濃度校正因子 f F 含量 基于滴定度的百分含量計(jì)算 回滴定法加入滴定液A與被測藥物完全反應(yīng) 再以滴定液B回滴剩余的滴定液A滴定液A與滴定液B的濃度是相當(dāng)?shù)?根據(jù)消耗回滴的滴定液體積進(jìn)行計(jì)算本法需進(jìn)行空白試驗(yàn)校正含量 100 光譜分析法利用物質(zhì)的光譜特性進(jìn)行定量介紹兩種光譜分析方法 紫外 可見分光光度法 分子的價電子吸收了光的能量 由低能量的基態(tài)躍遷到高能量的激發(fā)態(tài) 在相應(yīng)波長位置出現(xiàn)吸收帶形成的光譜 稱為紫外 可見吸收光譜 紫外吸收光譜圖 紫外 可見分光光度法波長范圍200 760nm定量分析基本原理 朗伯 比爾定律A ECL特點(diǎn) 靈敏度高 10 4 10 7g mL 準(zhǔn)確度高 儀器便宜 易操作 一 對溶劑的要求A盡量小 二 空白對照試驗(yàn)清零 三 測定波長確證 2nm 四 供試液的濃度A 0 3 0 7 吸收度的測定要求 含量測定吸收系數(shù)法 不需要對照品 測定 處吸收度 以該品種在規(guī)定條件下的吸收系數(shù)計(jì)算含量 100 含量測定對照品比較法 配制供試品溶液和對照品溶液 測定 處吸收度C待測 C對照 含量 100 要求濃度與吸光度成正比 因此供試品與對照品溶液中的被測成分應(yīng)盡可能一致 實(shí)際要求 10 含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線法 多點(diǎn)對照 繪制對照液濃度 吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線 3 5點(diǎn) 擬合回歸方程 求出供試液濃度 標(biāo)準(zhǔn)曲線 計(jì)算分光光度法多波長校正計(jì)算分光光度法 雙波長分光光度法三波長分光光度法導(dǎo)數(shù)光譜法解聯(lián)立方程法 熒光分析法熒光處于第一激發(fā)態(tài)的分子 躍遷回基態(tài)時發(fā)射的光稱為熒光 其能量小于激發(fā)光 波長長于激發(fā)光 除去激發(fā)光源 熒光立即熄滅 熒光激發(fā)光譜 激發(fā)光譜 熒光發(fā)射光譜 熒光光譜 熒光為發(fā)射光 利用熒光的物理特性進(jìn)行定性與定量測定的方法稱為熒光分析法 激發(fā)光譜 發(fā)射光譜 原理當(dāng)激發(fā)光強(qiáng)度 波長 所用溶劑及溫度等條件一定時 在較稀濃度范圍內(nèi)藥物的熒光強(qiáng)度與溶液中該物質(zhì)的濃度成正比 熒光強(qiáng)度 濃度 特點(diǎn) 靈敏度較紫外高 選擇性好 10 10 10 12g mL 取樣少 方法快速 應(yīng)在低濃度下進(jìn)行 干擾因素較多 須進(jìn)行空白校正 能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)較少 可采用熒光衍生化處理 含量測定對照品比較法由于絕對熒光強(qiáng)度難以測定 需要在每次測定前用一定濃度的對照品溶液校正儀器靈敏度 然后讀取對照品溶液 供試品溶液及各自溶劑的空白讀數(shù) C待測 C對照 由于濃度線性范圍較窄 應(yīng)在0 5 2 0之間 色譜分析法是一種分離分析方法利用各組分在固定相和流動相之間分配系數(shù)的差異得到分離 再逐個進(jìn)行分析介紹兩種色譜分析方法 高效液相色譜法 HPLC 氣相色譜法 GC 固定相 色譜過程 流動相 被分離組分 保留時間 定性 峰面積 或峰高 定量 色譜的保留行為 高效液相色譜法 HPLC 固定相 流動相及檢測器的選擇常用系統(tǒng)固定相 色譜柱 十八烷基鍵合硅膠C18流動相 甲醇 水 乙腈 水檢測器 紫外吸收檢測器 十八烷基及其他化學(xué)鍵合硅膠結(jié)構(gòu)示意圖 蒲公英圖 分析型色譜柱 各種類型色譜柱 色譜柱 內(nèi)徑 4 6mm長度 15mm 25mm柱填料粒度 5 10 m 燈室 流通池 檢測器紫外檢測器 UVD最常用 熒光檢測器 示差折光檢測器 電化學(xué)檢測器 二極管陣列檢測器 DVD 蒸發(fā)光散射檢測器 ELSD 和質(zhì)譜檢測器 MS 等 紫外檢測器外觀圖 高效液相色譜法 HPLC 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用規(guī)定的對照品對儀器進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整 理論板數(shù) n 分離度 R 重復(fù)性 RSD 拖尾因子 T 1 色譜柱的理論板數(shù) n n值越大柱效越高 應(yīng)高于規(guī)定的最小理論板數(shù) tR保留時間 Wh 2半高峰寬 2 分離度 R R值越大分離效果越好在規(guī)定的條件下 注入對照液或供試液 記錄色譜圖 按下式計(jì)算待測峰 定量峰 與相鄰峰的分離度 除另有規(guī)定外 應(yīng)大于1 5 3 重復(fù)性考察測量的精密度在規(guī)定條件下 取一定量的對照液 連續(xù)進(jìn)樣3 5次 除另有規(guī)定外 其峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD 應(yīng)不大于2 0 RSD計(jì)算公式 例題取某對照品溶液10 l 連續(xù)進(jìn)樣5次 記錄各次色譜峰峰面積如下 試判斷色譜系統(tǒng)重復(fù)性是否符合規(guī)定 X 19898 1S 586 789RSD 2 9 不符合規(guī)定 4 拖尾因子 T 考察色譜峰的對稱性T值越接近于1 0色譜峰的對稱性越好 測量的準(zhǔn)確度越高 采用峰高法測量時 應(yīng)檢查待測峰的T是否符合規(guī)定 除另有規(guī)定外 T應(yīng)在0 95 1 05之間 W0 05h為0 05峰高處的峰寬d1為峰極大至峰前沿之間的距離 選擇適宜的物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物 以待測組分和內(nèi)標(biāo)物的峰高比或峰面積比求算試樣含量的方法稱為內(nèi)標(biāo)法 內(nèi)標(biāo)法的關(guān)鍵是選擇合適的內(nèi)標(biāo)物 校正因子 f 其含義為 內(nèi)標(biāo)物峰面積與其濃度之比 As Cs 是對照品峰面積與其濃度之比 AR CR 的多少倍 含量測定內(nèi)標(biāo)加校正因子法 對照 內(nèi)標(biāo) 樣品 內(nèi)標(biāo) 樣品 內(nèi)標(biāo) 對照 內(nèi)標(biāo) C樣 f A樣 A 內(nèi) C 內(nèi) 校正因子f A內(nèi) C內(nèi) A對 C對 外標(biāo)法 1 外標(biāo)一點(diǎn)法被測成分與其峰面積成正比關(guān)系要求供試液與對照液濃度相近 樣品 對照 外標(biāo)法 2 標(biāo)準(zhǔn)曲線法繪制濃度 峰面積 峰高 標(biāo)準(zhǔn)曲線 擬合回歸方程并計(jì)算擬合常數(shù) 測定供試品峰面積 峰高 帶入方程 求出濃度 特點(diǎn)及要求 外標(biāo)法不使用校正因子 準(zhǔn)確性較高 操作條件變化對結(jié)果準(zhǔn)確性影響較大 對進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性控制要求較高 適用于大批量試樣的快速分析 基本原理各組分在固定相與載氣之間由于分配系數(shù)不同而按不同順序被帶出 分配系數(shù)小的組分先流出 分配系數(shù)大的后流出 以氣體為流動相的色譜法 氣相色譜法 GC 優(yōu)點(diǎn)靈敏度高 樣品用量少分離效能高 分離速度快 缺點(diǎn)受樣品蒸氣壓的限制不適于難氣化和熱穩(wěn)定的藥物 色譜柱 載氣及檢測器的選擇 氣源進(jìn)樣及氣化系統(tǒng)色譜柱和柱溫箱檢測器熱導(dǎo)檢測器氫火焰離子化檢測器電子捕獲檢測器 ChP 2005 對氣相色譜儀的一般要求色譜柱填充柱或毛細(xì)管柱 空心柱 固定液高沸點(diǎn)液體載氣氮?dú)鈾z測器氫火焰離子化檢測器 FID 檢測溫度高于柱溫一般250 350 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 同HPLC法含量測定 手動進(jìn)樣時 進(jìn)樣口溫度高 注射器插入膠墊后針尖部分受熱 以致針尖內(nèi)溶液受熱膨脹 部分溶液會被擠入進(jìn)樣口 使進(jìn)樣量發(fā)生偏差 以內(nèi)標(biāo)法為主 操作及計(jì)算方法同HPLC法 第三節(jié)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證 一 目的證明所用的分析方法適合相應(yīng)的檢驗(yàn)要求 一 起草新藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時 二 改變生產(chǎn)工藝時改變制劑處方修訂原分析方法時 二 用途 三 需驗(yàn)證的分析項(xiàng)目鑒別檢查 雜質(zhì)定量或限度檢查含量測定 原料藥或制劑中有效成分及制劑中其他成分 如降解產(chǎn)物 防腐劑等 四 驗(yàn)證指標(biāo) 準(zhǔn)確度精密度專屬性檢測限定量限線性范圍耐用性 重復(fù)性中間精密度重現(xiàn)性 一 準(zhǔn)確度該法測定結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近程度用百分回收率 表示 測定回收率R recovery 的具體方法可采用 回收試驗(yàn)法 和 加樣回收試驗(yàn)法 回收率 100 數(shù)據(jù)要求規(guī)定的范圍內(nèi) 至少用9次測定結(jié)果評價 如制備三個不同濃度樣品各測三次 原料藥用已知濃度的對照品測定 或?qū)⒈痉y定結(jié)果與另一已建立準(zhǔn)確度的方法的測定結(jié)果相比 制劑用已知量的被測物混合物測定 或與另一已建立準(zhǔn)確度的方法的測定結(jié)果相比 1 含量測定方法的準(zhǔn)確度 2 雜質(zhì)定量測定的準(zhǔn)確度向原料藥或制劑中加入已知量雜質(zhì)進(jìn)行測定 如果不能得到雜質(zhì)或降解產(chǎn)物 可用本法測定結(jié)果與另一成熟的方法進(jìn)行比較 二 精密度 偏差 d 標(biāo)準(zhǔn)偏差 SD 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD 變異系數(shù) CV 同一均勻樣品 經(jīng)多次取樣測定 所得結(jié)果之間的接近程度 重復(fù)性同人 儀器 時間 中間精密度同室 但不同人 儀器 時間 重現(xiàn)性不同地方協(xié)同檢驗(yàn) 三 專屬性 選擇性 在有其他成分 雜質(zhì) 降解產(chǎn)物 輔料等 可能存在時 該分析方法對待測組分準(zhǔn)確而專屬的測定能力 鑒別反應(yīng) 雜質(zhì)檢查 含量測定方法均應(yīng)考察 四 檢測限LOD 樣品中待測組分能被檢測出的最低量是限度試驗(yàn)參數(shù) 無需定量測定 常用 ppm ppb表示 儀器分析法 檢測限 D 靈敏度 S 噪音 N 或 把低濃度樣品信號與空白樣品信號進(jìn)行比較 按信噪比 S N 3 1或2 1時的相應(yīng)濃度或進(jìn)樣量為檢測限 非儀器分析法能觀察到實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的最低濃度為檢測限 五 定量限LOQ 樣品中被測組分能被定量測定的最低量 應(yīng)達(dá)到一定的準(zhǔn)確度和精密度 常用 ppm ppb表示 非儀器分析法用已知濃度的樣品確定定量限 將測定結(jié)果計(jì)算準(zhǔn)確度和精密度 儀器分析法按信噪比10 1時的相應(yīng)濃度或進(jìn)樣量為定量限 N LOD S N 3 LOQ S N 10 檢測限與定量限的區(qū)別在于A 定量限規(guī)定的最低測定濃度應(yīng)符合精密度要求B 定量限規(guī)定的最低測定量應(yīng)符合準(zhǔn)確度要求C 檢測限是以信噪比 2 1 來確定最低水平 而定量限是以信噪比 3 1 來確最低水平D 定量