DNA微陣列(或芯片)技術(shù)原理及應(yīng)用.ppt

DNA微陣列 或芯片 技術(shù)原理及應(yīng)用 DNA微陣列或芯片 DNAmicroarrayorchip 技術(shù)是近年發(fā)展起來的又一新的分子生物學(xué)研究工具 它是利用光導(dǎo)化學(xué)合成 照相平板印刷以及固相表面化學(xué)合成等技術(shù) 在固相表面合成成千上萬個寡核苷酸探針 或?qū)⒁合嗪铣傻奶结樣晌㈥嚵衅骰驒C器人點樣于尼龍膜或硅片上 再與放射性同位素或熒光物標(biāo)記的DNA或cDNA雜交 用于分析DNA突變及多態(tài)性 DNA測序 監(jiān)測同一組織細胞在不同狀態(tài)下或同一狀態(tài)下多種組織細胞基因表達水平的差異 發(fā)現(xiàn)新的致病基因或疾病相關(guān)基因等多個研究領(lǐng)域 摘要 1概念理論 DNA微陣列或芯片是指在大規(guī)模集成電路所控制的機器人在尼龍膜或硅片固相支持物表面 有規(guī)律地合成成千上萬個代表不同基因的寡核苷酸 探針 或液相合成探針后由陣列器 arrayer 或機器人點樣于固相支持物表面 這些 探針 可與用放射標(biāo)記物如32P或熒光物如熒光素 麗絲胺等標(biāo)記的目的材料中的DNA或cDNA互補核酸序列相結(jié)合 通過放射自顯影或激光共聚焦顯微鏡掃描后 對雜交結(jié)果進行計算機軟件處理分析 獲得雜交信號的強度及分布模式圖 以此反映目的材料中有關(guān)基因表達強弱的表達譜 2DNA微陣列或芯片的制作和原理2 1固相表面高密度寡核苷酸探針的合成及排列 采用光導(dǎo)化學(xué)合成和照相平板印刷技術(shù)可在硅片表面合成寡核苷酸探針 如圖1 當(dāng)光通過照相平板印刷的 面具 到達固相合成特定區(qū)域時 則激活這些區(qū)域內(nèi)的酶底物 如 甲基 6 氮胡椒酮甲羰基 而產(chǎn)生自由羥基和使受光保護的基團去除 繼而脫氧核酸鹽通過化學(xué)連接鍵添加于去保護位點上 當(dāng)光通過另一個新的 面具 到達酶底物的另一個區(qū)域發(fā)生同樣反應(yīng) 如此循環(huán)直到所需要的核酸全部被合成 而每次所添加的脫氧核酸是由 面具 上的順序所決定的 而后者又是由計算機根據(jù)設(shè)計者需要所控制的 因此一個限定長度的寡核苷酸則排列在預(yù)定位置上 對于N個堿基的探針 需4N個化學(xué)合成循環(huán)步驟可達到4n個探針數(shù) 如探針長度為4個堿基 化學(xué)合成循環(huán)步驟為16次 探針數(shù)為256個 如探針長度為8個堿基 則合成循環(huán)需32步即可達到65536個探針 這些探針在不同的照相平板印刷分辨率作用下 可在單位面積上合成不同的位點數(shù) 如分辨率為200 m 合成密度為2500個位點 cm2 如分辨率為20 m 合成密度為250000個位點 cm2等 由此構(gòu)成高密度寡核苷酸微陣列 2 2液相探針的合成及在固相表面的排列 由已知基因序列在液相中化學(xué)合成寡核苷酸鏈探針 或通過PCR技術(shù)擴增已知基因的編碼區(qū)部分序列 或克隆的基因組片段 均需通過純化產(chǎn)物后再定量分析 再由具有多個微細加樣孔的陣列復(fù)制器 arrayingandreplicatingdevice ARD 或陣列機 arrayer 及由電腦控制的機器人 準(zhǔn)確 快速地將不同探針樣品定量點樣于帶正電荷的尼龍膜或預(yù)處理好的硅片相應(yīng)位置上 再由紫外線膠聯(lián)固定后即得到DNA微陣列或芯片 2 3探針的雜交和檢測 DNA微陣列或芯片用于檢測基因表達 多態(tài)性或突變等實際上是一種反向斑點雜交技術(shù) 代表不同待檢測基因的 探針 被固定于微陣列或芯片上 而被檢測核酸DNA或由mRNA逆轉(zhuǎn)錄而來的cDNA群體用放射性32P 33P或熒光物標(biāo)記后與固相陣列雜交 如被檢測核酸中有與陣列上 探針 互補的序列存在 則二者以氫鍵結(jié)合 在被檢測核酸濃度 溫度 緩沖液及鹽濃度等相同條件下 結(jié)合在 探針 上的被檢測核酸量與其堿基構(gòu)成和靶 探針匹配的量所決定 對于一個相同長度的探針 GC含量較高 2 3探針的雜交和檢測 的與靶結(jié)合的強度高于AT含量較高者 靶 探針完全匹配者結(jié)合強度遠高于二者間存在不匹配 插入或缺失 結(jié)合在 探針 上的被檢測核酸可通過放射自顯影或激光共焦顯微鏡檢測雜交信號強弱和分布 再通過計算機軟件處理分析 得到有關(guān)基因的表達譜 3應(yīng)用3 1基因表達水平的檢測 DNA微陣列或芯片應(yīng)用于基因表達水平檢測的最大優(yōu)越性是可自動 快速檢測目的材料中成千上萬個基因的表達情況 DNA微陣列或芯片技術(shù)已在某些植物 細菌 真菌的整個基因組范圍內(nèi)對各基因表達水平進行快速的檢測 而在HGP完成之后 用于檢測在不同生理 病理條件下的人類所有基因表達變化的基因組芯片為期定不會遙遠 3 2尋找可能致病基因或疾病相關(guān)基因 用cDNA微陣列技術(shù)通過比較組織細胞基因的表達譜差異 可以發(fā)現(xiàn)新的可能致病基因或疾病相關(guān)基因 3 3基因點突變及多態(tài)性檢測 根據(jù)已知基因的序列信息可設(shè)計出含有成千上萬個不同寡核苷酸探針的DNA芯片 再用熒光標(biāo)記待測DNA 如二者完全匹配則雜交后結(jié)合牢固熒光強度高 如不全匹配則熒光強度弱或無 由此可判斷點突變的存在與否及部位和個數(shù) 根據(jù)這一原理如對N個堿基長度序列的每個堿基進行篩查 則需4 N個探針即可 3 4DNA序列測定 雖然Sanger Maxan Gilbert均有其標(biāo)準(zhǔn)的DNA測序方法 但對HGP這類大范圍的測序工作已顯過時 而用DNA微陣列或芯片快速測定待測DNA序列則具有十分誘人的前景 Pease等闡述了該方法的原理并指出它是在人類遺傳學(xué) 診斷學(xué) 病理檢測及DNA分子識別等方面發(fā)揮作用的強有力工具 Hacia等用含有48000個寡核苷酸的高密度微陣列分析了黑猩猩和人BRCA1基因序列差異 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在外顯子11約3 4kb長度范圍內(nèi)的核酸序列同源性在98 2 至83 5 之間 高度提示了二者在進化上的相似性 4展望 DNA微陣列或芯片幾乎可用于所有核酸雜交技術(shù)的各個方面 而在同時比較各組織或同一組織在不同狀態(tài)下上成千上萬個基因的表達狀況 DNA序列分析等方面具有更大的優(yōu)越性 有人譽贊 微陣列技術(shù)鋪平了通往21世紀(jì)的醫(yī)學(xué)之路 美國在該技術(shù)