山茱萸總苷的提取工藝及藥理研究.doc

山茱萸總苷的提取工藝及藥理研究 孫志明門秀麗 （河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北唐山063000） 【摘要】山茱萸總苷是中藥山茱萸的主要有效部位，藥效明顯，具有新藥開(kāi)發(fā)的意義。本文就山茱萸總苷在提取工藝、含量測(cè)定、藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)等方面進(jìn)行綜述。 關(guān)鍵詞山茱萸總苷；提??；藥動(dòng)學(xué)；藥效學(xué) 作者簡(jiǎn)介：孫志明（1971），男，河北聯(lián)合大學(xué)在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)。 通訊作者：門秀麗，教授、碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)?型糖尿病發(fā)生機(jī)制與防治。 中藥山茱萸為我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，有補(bǔ)肝腎，澀精氣，固虛脫之功效1，具有降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗休克、抗心律失常、抗菌、抗炎、抗癌、抗艾滋病、不育癥和治療骨質(zhì)疏松癥等藥理活性，其主要成分為環(huán)烯醚萜苷類、五環(huán)三萜酸及其酯類、鞣質(zhì)類、揮發(fā)油類及多糖類等2-4。作為主要藥效部位的山茱萸總環(huán)烯醚萜苷包括馬錢苷（loganin）、莫諾苷（morroniside）、獐牙菜苷（sweroside）、獐芽菜苦苷（swertiamarin）、馬鞭草苷（verbenalin）、脫水莫諾苷元、山茱萸新苷（cornuside）等十余種，統(tǒng)稱為山茱萸總苷(TotalglucosidesfromCornusofficinalis，TGC)。本文對(duì)山茱萸總苷的提取工藝、含量測(cè)定、藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。 1提取工藝 中藥苷類的提取一般采用含乙醇的水溶液提取，純化則采用大孔吸附樹(shù)脂富集的方法。 梁晉如等5采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化山茱萸總苷的提取及純化工藝。以乙醇濃度、液料比和提取時(shí)間為自變量，以莫諾苷、馬錢苷和獐牙菜苷的收率以及提取物得率為因變量，通過(guò)對(duì)自變量的總評(píng)歸一值進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，以響應(yīng)面優(yōu)選最佳的超聲提取工藝。以乙醇濃度、洗脫體積、上樣量為自變量，以莫諾苷、馬錢苷和獐牙菜苷的收率以及洗脫物得率為因變量，通過(guò)對(duì)自變量的總評(píng)歸一值進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，以響應(yīng)面優(yōu)選最佳的大孔樹(shù)脂純化工藝。確定提取工藝條件為乙醇濃度22%25%，液料比1215倍，提取時(shí)間3040min；純化工藝條件為乙醇濃度35%45%，洗脫體積79BV，上樣量4050mg/g。 不同型號(hào)的大孔樹(shù)脂對(duì)藥物的吸附程度不同。趙惠茹等6通過(guò)比較山茱萸總皂苷在9種不同型號(hào)大孔樹(shù)脂上的吸附與解吸性能篩選最佳樹(shù)脂，確定HPD-300型大孔樹(shù)脂具有良好的吸附與解吸性能，工藝參數(shù)為：上樣溶液質(zhì)量濃度為0.5g/mL，樹(shù)脂柱徑高比為1:7，吸附體積流量為2BV/h，每克干樹(shù)脂的最大吸附量為1.125g生藥。吸附飽和后，先用3BV蒸餾水洗脫去除水溶性雜質(zhì)，再用3.5BV50%乙醇進(jìn)行解吸附，純化后的山茱萸總皂苷保留率和精制度分別為92.6%和394.5%。HPD-300型大孔樹(shù)脂可作為純化山茱萸總皂苷的較佳分離材料。 姬長(zhǎng)新等7將山茱萸首先采用超高壓進(jìn)行處理，然后將高壓處理后的山茱萸采用纖維素酶進(jìn)行酶解提取，研究超高壓耦合纖維素酶處理對(duì)山茱萸得率的影響。結(jié)果表明，采用400MPa壓力處理3min，然后加入纖維素酶達(dá)到濃度1mg/mL，溫度55，pH4.5下酶解120min，山茱萸總皂甙的得率達(dá)到3.68%，是一種提取山茱萸總皂甙的新方法。 LiangJ等采用高速逆流色譜法，選擇二氯甲烷-甲醇-正丁醇-水-乙酸（5:5:3:4:0.1，v/v/v/v/v）組成的兩相溶劑系統(tǒng)，不到3h就從100mg山茱萸提取物中分離純化得到7.9mg獐牙菜苷，13.1mg莫諾苷和10.2mg馬錢苷共三種環(huán)烯醚萜苷，純度分別為92.3，96.3和94.2%。 2含量測(cè)定 中國(guó)藥典（xx版）規(guī)定以測(cè)定馬錢苷的含量來(lái)控制山茱萸藥材的質(zhì)量，以乙腈-水(15：85)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為240nm1。 李偉等建立反相高效液相色譜法測(cè)定山茱萸環(huán)烯醚萜總苷中馬錢苷和莫諾苷含量的方法，方法為L(zhǎng)ichrosphereC18柱(4.6mm150mm,5m)，流動(dòng)相為乙腈-水梯度洗脫(012min，乙腈10%55%)，檢測(cè)波長(zhǎng)240nm。結(jié)果馬錢苷和莫諾苷分別在0.0880.528g（r=0.9998）和0.0880.352g（r=0.9995）之間線性良好，可以用于控制山茱萸環(huán)烯醚萜總苷的質(zhì)量。 CaiH等建立HPLC串聯(lián)電噴霧電離質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定山茱萸中莫諾苷、馬錢苷、獐芽菜苷、7-O-甲基莫諾苷、山茱萸新苷和沒(méi)食子酸等八種成分的含量，采用電噴霧離子源(ESI)正離子模式，AgilentZorbaxExtendC18色譜柱，可在10min全部檢測(cè)完成，定量限0.004212.7875ng/mL，平均回收率97.1103.7%。 3藥動(dòng)學(xué) 中藥藥動(dòng)學(xué)對(duì)闡明中藥的有效性、有效成分的作用機(jī)制、解釋中藥復(fù)方配伍的合理性及中醫(yī)的辨證施治等都有重要意義，同時(shí)還為新活性成分的發(fā)現(xiàn)、新藥合成及新的前體藥物的制備提供理論和實(shí)踐的依據(jù)。 山茱萸總苷中馬錢苷和莫諾苷的吸收、分布、代謝和排泄均有報(bào)道。如山茱萸注射液中馬錢苷和莫諾苷在小鼠體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究，馬錢苷和莫諾苷均符合二室模型，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)t1/2()，t1/2()，k21，k12，k10，V，AUC，CL分別為3.2，25.1min，6.0，4.98，3.56/h，0.551L/kg，13.6mgh/L，1.96L/kgh；3.6，21.5min，5.93，3.83，3.80/h，0.647L/kg，27.2mgh/L，2.46L/kgh。組織分布方面，馬錢苷在腎中藥物濃度最高，其次在胃、肺、小腸等組織，腦組織中最少。大多數(shù)組織的藥物含量于給藥后90min最高，然后逐漸下降。莫諾苷在小腸中藥物濃度最高，其次在腎和胃等組織，心、肝、肺和脾中濃度較低，腦組織中未檢測(cè)到莫諾苷。馬錢苷在大鼠體內(nèi)的尿液排泄藥動(dòng)學(xué)表明，24h內(nèi)馬錢苷原型藥物經(jīng)尿排泄完全，排泄量主要集中在04h，約占總排泄量的81.5%；莫諾苷在24h內(nèi)原型藥物經(jīng)尿排泄完全，排泄量主要集中在03h，約占總排泄量的68.5%。馬錢苷可被腸道細(xì)菌酶水解生成苷元，苷元又進(jìn)一步代謝轉(zhuǎn)化，生成代謝物Mlog-2，Mlog-2最終被排出體外。莫諾苷可被腸道細(xì)菌酶水解形成苷元，經(jīng)環(huán)裂解，與NH3發(fā)生親核加成后環(huán)化及脫水縮合等步驟生成代謝物Mmor-1，苷元經(jīng)環(huán)裂解，安息香縮合，與NH3發(fā)生親核加成后環(huán)化生成代謝物Mmor-2，Mmor-1和Mmor-2最終排出體外。 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的處理方法除了傳統(tǒng)的3P97、DAS等以外，還可以采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)莫諾苷的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。 4藥效學(xué) 山茱萸總苷對(duì)糖尿病的作用。以高脂飼養(yǎng)結(jié)合STZ腹腔注射造模，于造模后2周分別灌胃給予降糖通脈膠囊、山茱萸總苷（0.05、0.1、0.2g/kg）治療，連續(xù)16周。結(jié)果顯示應(yīng)用山茱萸總苷后，糖尿病大鼠血糖降低，血清NO、NOS水平升高，血漿ET水平降低，心指數(shù)降低，心肌肥大程度減輕，對(duì)糖尿病心臟病變有一定的保護(hù)作用。郭潔等采用巨噬細(xì)胞和腎系膜細(xì)胞共培養(yǎng)體系，確定山茱萸環(huán)烯醚萜總苷顯著抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞遷移能力，不同劑量山茱萸環(huán)烯醚萜總苷(1.0、0.5、0.25mg/mL)對(duì)巨噬細(xì)胞遷移抑制率分別為42.09%7.25%、26.44%10.23%、20.84%6.84%；顯著抑制AGEs誘導(dǎo)的炎癥因子IL-6、IL-10、MCP-1和TNF-的分泌水平；Westernblot分析顯示山茱萸環(huán)烯醚萜總苷及AGEs受體特異性抗體顯著下調(diào)AGEs誘導(dǎo)的ICAM-1和TGF-1的蛋白表達(dá)。山茱萸環(huán)烯醚萜總苷可劑量依賴性地減輕AGEs誘導(dǎo)的大鼠腎系膜細(xì)胞HBZY-1炎癥反應(yīng)，對(duì)糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展具有一定的保護(hù)作用。MaW等研究表明山茱萸中的苷類抑制體外高糖培養(yǎng)HRMCs的IV型膠原抗體、纖維連接蛋白和IL-6。目前已經(jīng)證實(shí)山茱萸總苷中的莫諾苷是降糖作用的主要有效成分。 山茱萸總苷有抗炎、免疫抑制作用。小鼠給予總苷2、1g/kg劑量時(shí)能顯著地抑制NIH小鼠單核吞噬系統(tǒng)對(duì)剛果紅的廓清；1.00、0.50、0.25g/kg以及4.0、2.0g/kg各個(gè)劑量時(shí)能分別顯著抑制角叉菜膠所致小鼠及大鼠足爪腫脹；而在0.6、0.3g/kg劑量時(shí)，能明顯抑制由弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎所引起的注射局部的早期炎癥反應(yīng)和12d后的再度腫脹，又明顯抑制另側(cè)后肢因遲發(fā)性超敏反應(yīng)所引起的足腫脹。0.15g/kg劑量時(shí)，連續(xù)給藥12d后，表現(xiàn)出對(duì)再度腫脹及另側(cè)后肢腫脹的明顯抑制作用。證明了山茱萸總苷有良好的抗炎免疫作用。山茱萸總苷可以抑制T、B淋巴細(xì)胞增殖，抑制大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF、IL-1、IL-6等，具有免疫抑制作用。本研究結(jié)果表明山茱萸總苷可以明顯抑制rTNF-和rIL-1誘導(dǎo)ECV304表達(dá)ICAM-1和CD44表達(dá)，并呈明顯的量-效關(guān)系，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化表達(dá)ICAM-1和CD44可能是山茱萸總苷的免疫抑制機(jī)理的分子基礎(chǔ)之一。孟晶等建立封閉群大鼠SD-Wistar組間同種異體穿透性角膜移植模型，觀察脾淋巴細(xì)胞對(duì)絲裂原刀豆蛋白刺激的增殖反應(yīng)和單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)提出抑制淋巴細(xì)胞的增殖、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)、T淋巴細(xì)胞活化表達(dá)CD分子，IL-2受體的表達(dá)是山茱萸總苷抑制機(jī)體細(xì)胞免疫功能的主要機(jī)制之一。 山茱萸總苷抑制細(xì)胞凋亡的作用。陳克芳等采用原代培養(yǎng)乳鼠的心肌細(xì)胞，液狀石蠟封閉法建立缺血缺氧模型，將原代培養(yǎng)3d的心肌細(xì)胞分為對(duì)照組、缺氧組(1h、2h、3h、5h)及治療組，藥物濃度為生藥10g/L，TUNEL法檢測(cè)各組的凋亡率結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，缺氧組各時(shí)間點(diǎn)凋亡率明顯上升(P0.01)，與缺氧組比較，治療組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的凋亡率都有所下降(P0.01)，山茱萸總苷可以抑制心肌細(xì)胞的凋亡。ParkCH等證實(shí)莫諾苷抑制肝細(xì)胞凋亡。 山茱萸總苷對(duì)阿爾采末病的作用。褚燕琦等以山茱萸環(huán)烯醚萜苷與人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SKNSH細(xì)胞預(yù)孵育24h，再用岡田酸10nmol/L與SKNSH細(xì)胞共孵育6h，用Westernblot方法觀察磷酸化和非磷酸化tau蛋白表達(dá)，用間接免疫熒光法觀察神經(jīng)細(xì)胞微管的變化。提示山茱萸環(huán)烯醚萜苷能夠抑制神經(jīng)細(xì)胞tau蛋白過(guò)度磷酸化，保護(hù)細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)，因此可能具有治療Alzheimer病應(yīng)用前景。 山茱萸總苷對(duì)腦梗死的作用。李林等將大鼠灌胃給予山茱萸提取物（主要成分為環(huán)烯醚萜苷）7d后，制作光化學(xué)致腦梗死模型，采用分光光度法檢測(cè)腦組織中NO和一氧化氮合酶（NOS）的變化，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的變化。結(jié)果顯示山茱萸環(huán)烯醚萜苷通過(guò)減小腦梗死面積，降低腦皮層NO含量和NOS活性，并顯著減少核轉(zhuǎn)錄因子陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量發(fā)揮對(duì)腦梗死的治療作用。 山茱萸總苷促進(jìn)坐骨神經(jīng)損傷再生及修復(fù)。齊爽等將84只Balb/c小鼠隨機(jī)分為山茱萸總苷高、中和低劑量組及生理鹽水對(duì)照組，各組分別于術(shù)后3天、5天、1周、2周、4周、8周時(shí)間點(diǎn)采用免疫組化法檢測(cè)L4L6脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元內(nèi)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(Gap-43)表達(dá)；術(shù)后第4、8、12周行電生理檢查測(cè)定神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MCV)。結(jié)果顯示高、中劑量組Gap-43表達(dá)明顯多于低劑量和對(duì)照組(P0.05)，術(shù)后第4、8、12周高、中劑量組較低劑量組和對(duì)照組再生神經(jīng)傳導(dǎo)速度加快、波幅升高、潛伏時(shí)縮短(P0.05)。山茱萸總苷能夠促進(jìn)大鼠周圍神經(jīng)損傷后MCV的恢復(fù)，其機(jī)制可能為增加損傷脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中Gap-43的表達(dá)。 山茱萸總苷對(duì)干細(xì)胞的作用。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)是一種被認(rèn)為具有多種分化潛能的細(xì)胞，在特定條件下能夠分化為脂肪細(xì)胞、造骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞和造血基質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞，用于細(xì)胞治療和基因治療，可能會(huì)成為治療型糖尿病的有效手段。HuN等證實(shí)莫諾苷促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(RMSC)增殖。 5結(jié)語(yǔ) 山茱萸總苷在提取工藝、藥動(dòng)學(xué)及藥效學(xué)方面的研究日漸成熟，我國(guó)山茱萸資源豐富，如果將山茱萸總苷設(shè)計(jì)成合理的劑型，研發(fā)療效確切的新藥，必將有著廣闊的臨床應(yīng)用前景和生產(chǎn)前景，對(duì)開(kāi)發(fā)我國(guó)中藥資源有著重要意義。 參考文獻(xiàn) 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典M.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,xx:21. 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