食品毒理學(xué)詳案文檔.doc

教 案20142015學(xué)年第1學(xué)期課程編號(hào)： 授課專(zhuān)業(yè)： 食品科學(xué)與工程專(zhuān)業(yè) 授課班級(jí)： 2012級(jí)食品質(zhì)量與安全 任課教師： 宋慕波 二級(jí)學(xué)院： 化學(xué)與生物工程學(xué)院 教 研 室： 食品科學(xué)與工程教研室 課程基本信息課程名稱(chēng)食品毒理學(xué)課程類(lèi)型必修課公共課（ ） 專(zhuān)業(yè)課（ ）選修課限選課（ ） 任選課（ ）授課方式理論課講授（ ）實(shí)驗(yàn)（踐）課（ ）考核方式考試（ ）考查（ ）課程教學(xué)總學(xué)時(shí)數(shù)48學(xué)分?jǐn)?shù)3學(xué)時(shí)分配理論講授： 48 學(xué)時(shí) 實(shí)驗(yàn)（踐）： 0 學(xué)時(shí) 上機(jī)： 0 學(xué)時(shí)一、教材基本信息教材選用李建科主編中國(guó)計(jì)量出版社（2012年12月）出版的食品毒理學(xué)（第1版）（“十一五”高等學(xué)校通用教材）。本教材以系統(tǒng)性、科學(xué)性、新穎性和普遍適用性為原則，在系統(tǒng)介紹食品毒理學(xué)基本概念、原理和方法的基礎(chǔ)上、理論聯(lián)系實(shí)際，全面介紹了與食品安全相關(guān)的毒理學(xué)問(wèn)題；同時(shí)，也力求反映毒理學(xué)研究和安全性評(píng)價(jià)的最新進(jìn)展，力求將相關(guān)學(xué)科的最新技術(shù)應(yīng)用到食品毒理學(xué)研究中來(lái)。列如本書(shū)第九章將分子生物學(xué)的最新成果在食品毒理學(xué)的應(yīng)用做了非常全面的介紹。全書(shū)共分二十章。第一章至第五章闡述學(xué)科定義、術(shù)語(yǔ)以及論述毒物的體內(nèi)過(guò)程，毒物動(dòng)力學(xué)及毒理機(jī)制；第六章至第十章介紹食品安全性毒理學(xué)試驗(yàn)方法、安全性評(píng)價(jià)程序和規(guī)范，食品中有互有害物質(zhì)安全限量標(biāo)準(zhǔn)制定的方法，步驟和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估；第十一章至第十九分別介紹食品中天然存在的有毒有害物質(zhì)、外源性危害物（包括食品添加劑，農(nóng)藥、獸藥錢(qián)留，有害元素，霉菌毒素加工污染，食品容順和包裝材料等）的毒理學(xué)問(wèn)題；安全標(biāo)準(zhǔn)及預(yù)防和控制措施；第二十章介紹食品毒理學(xué)漢行病學(xué)調(diào)查方法。本教材內(nèi)容全面，融系統(tǒng)性、科學(xué)性、新穎性和普遍性為一體，非常適合作為我校食品科學(xué)與工程類(lèi)本科生教材。二、課程目標(biāo)食品毒理學(xué)是研究食品中外源化學(xué)物質(zhì)的性質(zhì)、來(lái)源于形成以及他們的不良反應(yīng)與可能的有益作用和機(jī)制，并確定這些物質(zhì)的安全限量和評(píng)價(jià)食品安全性的一門(mén)科學(xué)是食品安全的重要組成部分，也是食品質(zhì)量與安全專(zhuān)業(yè)學(xué)生的必修課程。通過(guò)本課程的學(xué)習(xí)使學(xué)生能夠掌握通過(guò)毒理學(xué)角度分析食品中可能含有的外源化學(xué)物質(zhì)對(duì)食用者健康的危害，檢驗(yàn)和評(píng)價(jià)食品的安全性或安全范圍的知識(shí)和技能。具體目標(biāo)如下： （1）掌握食品毒理學(xué)的基本概念，了解食品毒理學(xué)的研究?jī)?nèi)容、研究方法和發(fā)展趨勢(shì)。 （2）培養(yǎng)學(xué)生從毒理學(xué)的觀點(diǎn)出發(fā)，掌握食品中外源化學(xué)物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)化、毒作用機(jī)制、毒性特點(diǎn)和一些基本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路和方法。（3）了解在食品工業(yè)的流程中的毒理安全性，掌握相關(guān)預(yù)防手段。例如在生產(chǎn)、包裝和運(yùn)輸過(guò)程中容易出現(xiàn)的食品安全問(wèn)題。（4）教學(xué)過(guò)程中注重培養(yǎng)學(xué)生自學(xué)能力、知識(shí)的應(yīng)用于創(chuàng)新能力。讓學(xué)生及時(shí)了解食品毒理學(xué)的最新國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展。三、教學(xué)重點(diǎn)及難點(diǎn)重點(diǎn)講授毒理學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)，包括毒物的體內(nèi)過(guò)程、毒物動(dòng)力學(xué)和化學(xué)物質(zhì)的毒理機(jī)制等內(nèi)容。同時(shí)，與食品工業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐聯(lián)系緊密的內(nèi)容，例如食品安全性評(píng)價(jià)程序與規(guī)范、食品中有害物質(zhì)的限量標(biāo)準(zhǔn)和食品包裝材料的毒理學(xué)安全性等也是本課程的教學(xué)重點(diǎn)。難點(diǎn)：毒物的體內(nèi)過(guò)程、毒物動(dòng)力學(xué)和化學(xué)物質(zhì)的毒理機(jī)制等章節(jié)內(nèi)容較多、概念比較抽象，需要重點(diǎn)講授，幫助學(xué)生理解。注：表中（ ）選項(xiàng)請(qǐng)打“”。附件3：章節(jié)或分次(課時(shí))詳細(xì)教案 食品毒理學(xué) 課程授課教案周次11課次1課時(shí)3課型理論課 討論課 實(shí)驗(yàn)課 習(xí)題課 其他章節(jié)名稱(chēng)第8章 毒理學(xué)評(píng)價(jià)的分子生物學(xué)方法一、教材分析本課程選用的食品毒理學(xué)教材，特別強(qiáng)調(diào)了對(duì)毒理學(xué)最新發(fā)展趨勢(shì)的相關(guān)內(nèi)容。毒理學(xué)評(píng)價(jià)的分子生物學(xué)方法是毒理學(xué)的研究前沿，是幫助學(xué)生了解食品毒理學(xué)研究趨勢(shì)的重要章節(jié)。本書(shū)第8章分為三節(jié)全面介紹了應(yīng)用在食品毒理學(xué)中的分子生物學(xué)技術(shù)，內(nèi)容都是在毒理學(xué)研究中應(yīng)用的最新技術(shù)。食品毒理學(xué)是一門(mén)交叉學(xué)科，了解其他學(xué)科研究的最新成果能夠拓展學(xué)生的視野。 本章之前同學(xué)們對(duì)食品毒理學(xué)的基本概念和基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)方法有了充分的理解，在這個(gè)基礎(chǔ)之上進(jìn)行最新技術(shù)的介紹非常適合。二、教學(xué)目的及要求1.了解應(yīng)用于毒理學(xué)評(píng)價(jià)的分子生物學(xué)技術(shù)；2.掌握亞細(xì)胞組分制備、核算提取和PCR技術(shù)的原理和簡(jiǎn)單操作技術(shù)； 3.了解這些技術(shù)在各自應(yīng)用領(lǐng)域發(fā)揮的作用。三、教學(xué)重點(diǎn)與難點(diǎn)重點(diǎn)：亞細(xì)胞組分制備、核算提取和PCR技術(shù)的原理的理解，了解各分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用范圍。難點(diǎn)：分子生物學(xué)技術(shù)原理；實(shí)驗(yàn)操作材料和儀器的認(rèn)知。 三、教學(xué)方式方法、手段結(jié)合多媒體講授與課堂討論結(jié)合進(jìn)行授課。 四、教學(xué)過(guò)程第一節(jié)亞細(xì)胞組分的制備1.分子生物學(xué)理論和技術(shù)的概念以及在毒理學(xué)評(píng)價(jià)方面的應(yīng)用（10min）分子生物學(xué)時(shí)在分子水平上研究生命現(xiàn)象的科學(xué)。通過(guò)研究生物大分子(核酸、蛋白質(zhì))的結(jié)構(gòu)、功能和生物合成等方面來(lái)闡明各種生命現(xiàn)象的本質(zhì)。進(jìn)十幾年來(lái)，分子生物學(xué)理論和技術(shù)飛速發(fā)展，為生物、醫(yī)學(xué)和毒理學(xué)的研究和發(fā)展提供了新的思維和研究工具。（舉例：人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成對(duì)醫(yī)學(xué)的影響；轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用對(duì)食品科學(xué)的影響。）同時(shí)，隨著基因芯片技術(shù)、蛋白芯片技術(shù)和基因測(cè)序技術(shù)的引入，大大提高了現(xiàn)代毒理學(xué)研究的整體水平。因此，未來(lái)會(huì)有更多的分子生物學(xué)技術(shù)運(yùn)用于毒理學(xué)評(píng)價(jià)中，了解這些前沿技術(shù)非常有必要。2.亞細(xì)胞組分的制備（20min）2.1亞細(xì)胞組分的概念回顧在第三章學(xué)習(xí)過(guò)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，通過(guò)細(xì)胞器的概念指導(dǎo)學(xué)生認(rèn)識(shí)亞細(xì)胞組分的概念。細(xì)胞是由許多亞細(xì)胞組分組成的，如核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、溶酶體及高爾基體等，它們?cè)诰S持細(xì)胞正常生理功能方面起著重要的作用。2.2研究亞細(xì)胞組分對(duì)毒理學(xué)評(píng)價(jià)的意義因?yàn)閬喖?xì)胞結(jié)構(gòu)承載著重要作用，因此許多外源化學(xué)物引起機(jī)體的損害作用有可能與亞細(xì)胞組分的結(jié)構(gòu)與功能損傷有關(guān)。(舉例：亞細(xì)胞組分作為遺傳毒性測(cè)定中的代謝活化系統(tǒng)，如S9的普遍運(yùn)用)因此，為了深入了解外源化學(xué)物的毒作用機(jī)理需要對(duì)亞細(xì)胞組分進(jìn)行研究。2.3亞細(xì)胞組分的分離 為什么要對(duì)亞細(xì)胞組分進(jìn)行分離？為了深入的研究外源化學(xué)物的靶位點(diǎn)、探討化學(xué)無(wú)毒性效應(yīng)，需要將細(xì)胞中各亞細(xì)胞組分分離和純化是十分必要的。2.4細(xì)胞膜的制備2.4.1細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)回顧第三章細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。（提問(wèn)：細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)模型是什么？）細(xì)胞膜又稱(chēng)細(xì)胞質(zhì)膜（plasma membrane）。細(xì)胞表面的一層薄膜。有時(shí)稱(chēng)為細(xì)胞外膜或原生質(zhì)膜。細(xì)胞膜的化學(xué)組成基本相同，主要由脂類(lèi)、蛋白質(zhì)和糖類(lèi)組成。2.4.2 細(xì)胞膜的分離技術(shù)在毒理學(xué)研究中經(jīng)常分離的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)包括：肝細(xì)胞膜、紅細(xì)胞膜、脂質(zhì)體細(xì)胞膜，脂質(zhì)體和突觸體膜。細(xì)胞組分的分離技術(shù)包括：離心技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)和細(xì)胞電泳。本節(jié)可主要講授離心技術(shù)。通過(guò)肝細(xì)胞膜的分離講解密度梯度離心的原理。（提問(wèn):為什么針對(duì)肝細(xì)胞膜的研究較多?）肝臟是機(jī)體主要的代謝器官，肝細(xì)胞膜的制備，對(duì)于研究膜蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義。密度梯度離心的原理(結(jié)合密度梯度離心flash 動(dòng)畫(huà)講解)：密度梯度離心是用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過(guò)重力或離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離。（在此強(qiáng)調(diào)：不同的亞細(xì)胞組分會(huì)停留在不同的密度層中，因此分離。）這類(lèi)分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種密度梯度離心常用的介質(zhì)為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求：a能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時(shí)，粘度不高；b PH 中性或易調(diào)為中性；c濃度大時(shí)滲透壓不大；d對(duì)細(xì)胞無(wú)毒。肝細(xì)胞分離的基本步驟和原理（結(jié)合密度梯度離心flash 動(dòng)畫(huà)講解）：肝細(xì)胞的離心介質(zhì)選用蔗糖。根據(jù)密度梯度離心的原理，由于肝細(xì)胞的相對(duì)密度為1.16左右，分布于37%-41%的蔗糖之間；通過(guò)其標(biāo)志酶的活性即可很好的標(biāo)定肝細(xì)胞膜所在層。討論題目:在肝細(xì)胞提取過(guò)程中選用了標(biāo)志酶，那么其它技術(shù)如放射性核素標(biāo)記法有什么缺點(diǎn)？第二節(jié) 核酸的提取與制備1.核酸提取的技術(shù)概述(10min)核酸的提取是分子生物學(xué)中很重要的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，也是其他分子生物學(xué)分析方法的前提。核酸樣品的提取質(zhì)量非常重要，直接關(guān)系到分析檢測(cè)的成敗。因此，需要掌握這項(xiàng)技術(shù)的一些基本操作原則。2.核酸提取技術(shù)操作過(guò)程重點(diǎn)(20min)盡量簡(jiǎn)化操作步驟；（舉例：在樣品研磨時(shí)應(yīng)迅速完成）減少物理因素對(duì)核酸的降解。（舉例：操作時(shí)盡量輕的攪動(dòng)溶液，操作應(yīng)保持在低溫環(huán)境等）減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解。（舉例：過(guò)高或過(guò)低的PH值對(duì)核酸提取質(zhì)量的不良影響）防止核酸的生物降解。（舉例：RNA酶在自然界中大量存在，包括人的唾液，如果在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不帶口罩，容易造成樣品的嚴(yán)重降解）3.核酸提取的原理(20min)提出問(wèn)題:如果要將一種物質(zhì)從混合物種提取出來(lái)有哪兩種途徑？采用某種手段直接將這種物質(zhì)從混合物種抽提出來(lái)。將混合物的其它成分去除，留下的部分即為我們需要的物質(zhì)。提取核酸的原理符合第種思路。提出第二個(gè)問(wèn)題：細(xì)胞組織中除了核酸外其余的成分有哪些？答：細(xì)胞中大量存在的蛋白質(zhì)、多糖、脂類(lèi)等生物大分子。因此明確提取核酸的原理就是要去除這些蛋白質(zhì)、多糖、脂類(lèi)等生物大分子。核酸提取的主要步驟:切取組織5g左右,剔除結(jié)締組織,吸水紙吸干血液,剪碎放入研缽(越細(xì)越好)。 倒入液氮,磨成粉末,加10ml分離緩沖液。 加1ml 10% SDS, 混勻,此時(shí)樣品變得很粘稠。 加50ul或1mg 蛋白酶 K, 37保溫1-2小時(shí), 直到組織完全解體。 加1ml 5mol/L NaCl, 混勻,5000rpm離心數(shù)秒鐘。 取上清液于新離心管，用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提。待分層后,3000rpm離心 5分鐘。 取上層水相至干凈離心管, 加2倍體積乙醚抽提(在通風(fēng)情況下操作)。 移去上層乙醚,保留下層水相。 加1/10 體積3mol/L NaAc, 及2倍體積無(wú)水乙醇顛倒混合沉淀DNA。室溫下靜止10-20分鐘，DNA沉淀形成白色絮狀物。 用玻棒鉤出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水紙上吸干,溶解于1ml TE中,-20保存。 學(xué)生可以簡(jiǎn)要了解各個(gè)步驟，但要理解主要試劑的用途，例如SDS的作用是使蛋白變性，積酚:氯仿:異戊醇是用來(lái)分離脂類(lèi)。核酸提取操作的注意事項(xiàng)（引導(dǎo)學(xué)生討論為什么需要注意這些事項(xiàng)）: 裂解液要預(yù)熱,以抑制DNase,加速蛋白變性,促進(jìn)DNA溶解。(避免生物降解) 各操作步驟要輕柔,盡量減少DNA的人為降解。（避免物理降解） 取各上清時(shí),不應(yīng)貪多,以防非核酸類(lèi)成分干擾。（避免樣品污染） 異丙醇,乙醇等要預(yù)冷,以減少DNA的降解,促進(jìn)DNA與蛋白等的分相及DNA沉淀。（避免物理降解） 提取DNA過(guò)程中所用到的試劑和器材要通過(guò)高壓烤干等辦法進(jìn)行無(wú)核酸酶化處理。 （強(qiáng)調(diào)這是為了避免生物降解）4.核酸提取的濃度檢測(cè)(10min)核酸在波長(zhǎng)為260nm處有吸收峰，可以通過(guò)測(cè)定在波長(zhǎng)為260nm處的吸光值來(lái)計(jì)算核酸濃度，計(jì)算公式為：DNA濃度=A260 50。污染物的檢測(cè)可用波長(zhǎng)從200-300nm的掃描紫外分光光度測(cè)定法，測(cè)定A260nm與A280nm的紫外光吸收之比，比值接近1.8表示DNA純度高，不含蛋白雜質(zhì)。 第三節(jié) 基因突變分析與PCR檢測(cè)1.基因突變分析(15min)回顧第五章第二節(jié)所講的基因突變的種類(lèi)包括：堿基置換、移碼突變和變短突變。引出用于基因突變檢測(cè)的幾種分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)：DNA測(cè)序、原位雜交、基因芯片等。這部分內(nèi)容不做為教學(xué)重點(diǎn)，僅做簡(jiǎn)單介紹，由學(xué)生自學(xué)。2.有害微生物的PCR檢測(cè)(20min)說(shuō)明常規(guī)檢測(cè)有害微生物方法繁瑣、費(fèi)時(shí)等不足，提出PCR檢測(cè)法快速和精確等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)比較讓同學(xué)明白隨著食品安全性要求的不斷提高，PCR技術(shù)將在食品有害微生物檢測(cè)領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用。2.1 PCR技術(shù)原理（結(jié)合PCR原理flash動(dòng)畫(huà)講授） 首先介紹在人體內(nèi)DNA復(fù)制所需要的條件，引出PCR技術(shù)是一種體外的DNA復(fù)制技術(shù)。簡(jiǎn)要介紹PCR技術(shù)的發(fā)展歷程，突出rTaq酶的發(fā)現(xiàn)對(duì)PCR技術(shù)發(fā)展的重要意義。介紹PCR反應(yīng)體系的組成：需要引物、模板、緩沖液（Buffer）、rTaq酶、dNTP。重點(diǎn)讓學(xué)生理解各各組分在反應(yīng)體系中的作用。舉例說(shuō)明PCR技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用：檢測(cè)細(xì)胞增生李斯特菌；檢測(cè)金色葡萄球菌；檢測(cè)大腸桿菌。通過(guò)這寫(xiě)實(shí)例引導(dǎo)學(xué)生思考PCT檢測(cè)技術(shù)可能存在的問(wèn)題：污染問(wèn)題；假陰性問(wèn)題；靈敏度問(wèn)題；加測(cè)效果問(wèn)題。小結(jié)（10min）本章學(xué)習(xí)了分子生物學(xué)方法在毒理學(xué)評(píng)價(jià)方面的應(yīng)用，這些交叉學(xué)科中最新成果的運(yùn)用對(duì)毒理學(xué)研究有很大的推動(dòng)作用。我們主要學(xué)習(xí)了亞細(xì)胞組分制備技術(shù)、核酸的提取技術(shù)和PCR檢測(cè)技術(shù)，這些技術(shù)的原理需要進(jìn)行充分的理解。通過(guò)學(xué)習(xí)我們也知道了這些技術(shù)主要運(yùn)用與食品毒理學(xué)的那些方面，在實(shí)踐中發(fā)揮著什么樣的作用。 同時(shí)，我們也清楚的看到這些技術(shù)所存在的問(wèn)題和改進(jìn)的方向。五、版書(shū)設(shè)計(jì)第八章 毒理學(xué)評(píng)價(jià)的分子生物學(xué)方法 1.分子生物學(xué)方法概述。毒理學(xué)研究為何要借助分子生物學(xué)理論和技術(shù)？第一節(jié) 亞細(xì)胞組分的制備 1. 亞細(xì)胞組分的概念； 2. 細(xì)胞膜的分離； （1）細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)-細(xì)胞膜包含哪些毒理學(xué)研究的信息？ （2）亞細(xì)胞組分分離的方法：離心法、流式細(xì)胞技術(shù)、細(xì)胞電泳； （3）密度梯度離心法的原理； 例如：肝細(xì)胞膜的制備； 第二節(jié) 核酸的提取與制備1. 核酸提取的技術(shù)概述-核酸提取是分子生物學(xué)分析方法的前提條件； 2.核酸提取技術(shù)操作過(guò)程簡(jiǎn)化操作步驟； 減少物理因素對(duì)核酸的降解。減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解。防止生物降解。