《CR及質(zhì)粒提取》PPT課件.ppt

PCR技術(shù),聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，是分子克隆技術(shù)中的常用技術(shù)之一。 PCR具有反應(yīng)快速、靈敏、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。,實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆誔CR原理，學(xué)習(xí)PCR操作過程。 實(shí)驗(yàn)原理：在微量離心管中，加入適量的緩沖液，模板DNA，dNTPs ，Taq DNA聚合酶，一對(duì)引物，以高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個(gè)反應(yīng)為一個(gè)循環(huán)，經(jīng)過2535次循環(huán)，最終使特異區(qū)段的DNA擴(kuò)增數(shù)百萬倍，滿足分子生物學(xué)下游操作。,PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：,1. PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系,2. PCR擴(kuò)增程序設(shè)置,預(yù)變性 94 5 變 性 94 30 退 火 60 30 延 伸 72 40“ 補(bǔ)充延伸 72 10 8 保存,30個(gè)循環(huán),堿裂解法提取質(zhì)粒DNA,質(zhì)粒 (plasmid) 是存在于細(xì)菌染色體外的環(huán)狀雙鏈DNA。具有可自主復(fù)制、傳給子代、也可丟失及在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移等特性，與細(xì)菌的遺傳變異有關(guān)。 作用： 攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的主要載體，在基因克隆、表達(dá)中具有重要作用。,基因克隆操作步驟（五字經(jīng)） 分載體和目的基因的分離 切限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用 接載體和目的基因拼接成重組體 轉(zhuǎn)重組體的轉(zhuǎn)化 篩DNA重組體篩選與鑒定,質(zhì)粒的提取方法很多，大多包括3個(gè)主要步驟：細(xì)菌的培養(yǎng)、細(xì)菌的收集和裂解、質(zhì)粒DNA的分離和純化。 本實(shí)驗(yàn)以堿裂解法為例，介紹質(zhì)粒的提取過程。,實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆諌A裂解法提取質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用。,實(shí)驗(yàn)原理：在堿性環(huán)境中，細(xì)菌染色體DNA變性分開，而質(zhì)粒DNA雖變性但仍處于纏繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質(zhì)在SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，最后用酚、氯仿抽提純化得到質(zhì)粒DNA。,1. 將1.5 ml過夜培養(yǎng)菌液放于EP管中，10 000 r/min離心1分鐘，棄去上清液。 2. 加100 l 溶液，劇烈震蕩使菌體懸浮均勻，室溫放置5分鐘。 3. 加200 l 溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用），輕柔顛倒混勻46次，室溫放置5分鐘。 4. 加入150l預(yù)冷的溶液 ，輕柔顛倒混勻46次，冰上放置10分鐘。,操作過程,溶液I： 50 mmol/L葡萄糖 25 mmol/L Tris-Cl，pH 8.0 10 mmol/L EDTA， pH 8.0 溶液II： 0.2 mol/L NaOH 1% SDS 溶液III：29.4g乙酸鉀，11.5ml冰乙酸， H2O至100ml。,5. 12 000 r/m離心15 分鐘(如果上清液仍然渾濁，可將上清液移出，再次離心5分鐘）。將上清液轉(zhuǎn)移至EP管中，加等體積酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）抽提一次（12 000r/min離心10分鐘）。 6. 吸出上清液，加2.5倍體積的無水乙醇，混勻，室溫放置10分鐘，12 000r/min離心10分鐘，沉淀DNA。 7. 70%乙醇洗滌沉淀2次，自然揮干。 8. 所得DNA溶于3050 l TE中，-20保存?zhèn)溆谩?操作過程,TE溶液：10 mm