GB5413.19-2010食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的測定.pdf

中華人民共和國國家標準中華人民共和國國家標準GB 5413.192010中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部 發(fā)布 2010-03-26 發(fā)布 2010-06-01 實施食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的測定 National food safety standard Determination of free biotin in foods for infants and young children, milk and milk products GB 5413.192010 I 前 言 本標準代替GB/T 5413.19-1997嬰幼兒配方食品和乳粉 游離生物素的測定。 本標準附錄A為規(guī)范性附錄。 本標準所代替標準的歷次版本發(fā)布情況為： GB 5413-1985、GB/T 5413.19-1997。 GB 5413.192010 1 食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的測定 1 范圍 本標準規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的測定方法。 本標準適用于嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的測定。 2 規(guī)范性引用文件 本標準中引用的文件對于本標準的應用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 僅所注日期的版本適用于本標準。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標準。 3 原理 利用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）對游離生物素的特異性和靈敏性，定量測定出試樣中待測物質(zhì)的含量。 在含有除待測物質(zhì)以外所有營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中， 微生物的生長與待測物質(zhì)含量呈線性關系，根據(jù)透光率與標準工作曲線進行比較，即可計算出試樣中待測物質(zhì)的含量。 4 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的二級水。 4.1 菌株：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），ATCC 8014。 4.2 生物素（d-Biotin 或 Vitamin H）標準品（C10H16N2O3S）：純度99 %。 4.3 培養(yǎng)基 4.3.1 乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基：見附錄 A。 4.3.2 乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基：見附錄 A。 4.3.3 生物素測定用培養(yǎng)基：見附錄 A。 注：一些商品化合成培養(yǎng)基效果良好，商品化合成培養(yǎng)基按標簽說明進行配制。 4.4 乙醇溶液（50 %）。 4.5 硫酸溶液（3 %）：量取 3mL 硫酸加入到水中，定容至 100 mL。 4.6 氫氧化鈉溶液（0.5 mol/L）：稱取 20 g 氫氧化鈉溶于 1000 mL 水中。 4.7 氯化鈉溶液（9 g/L）：稱取 9.0 g 氯化鈉溶解于 1000 mL 水中，分裝試管，每管 10 mL。121滅菌 15 min。 4.8 標準溶液的制備 4.8.1 生物素標準貯備液（100 g/mL）：稱取生物素標準品（4.2）用乙醇溶液（4.4）定容至生物素濃度為 100 g/mL，貯于冰箱中。 4.8.2 生物素標準中間液（1 g/mL）：吸取 1 mL 生物素標準貯備液（4.8.1），用乙醇溶液（4.4）定容至 100 mL。 4.8.3 生物素標準工作液（10 ng/mL）：吸取 1 mL 生物素標準中間液（4.8.2），用乙醇溶液（4.4）定容至 100 mL。 4.8.4 標準曲線工作液 GB 5413.192010 2 分兩個濃度， 高濃度溶液的濃度為 0.2 ng/mL； 低濃度溶液的濃度為 0. 1 ng/mL。 從工作液中 （4.8.3）吸取兩次各 5 mL，用水分別定容到 250 mL 和 500 mL。 注：所有標準溶液要儲存于冰箱內(nèi)。4.8.1、4.8.2、和 4.8.3 保存期三個月，4.8.4 臨用前配制。 5 儀器和設備 除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下： 5.1 天平：感量為 0.1 mg。 5.2 pH 計：精度0.02。 5.3 分光光度計。 5.4 渦旋混合器。 5.5 離心機：轉(zhuǎn)速2000 轉(zhuǎn)/分鐘。 5.6 恒溫培養(yǎng)箱：36 1 。 5.7 冰箱：2 5 。 5.8 無菌吸管：10 mL (具 0.1 mL 刻度) 或微量移液器或吸頭。 5.9 瓶口分液器：0 mL10 mL。 5.10 錐形瓶：200 mL。 5.11 容量瓶（A 類）：100 mL，250 mL，500 mL。 5.12 單刻度移液管（A 類）：容量 5 mL。 5.13 漏斗：直徑 90 mm。 5.14 定量濾紙：直徑 90 mm。 5.15 試管：18mm180 mm。 注：玻璃儀器使用前，用活性劑（月桂磺酸鈉或家用洗滌劑加入到洗滌用水中即可）對硬玻璃測定管及其他必要的玻璃器皿進行清洗，清洗之后在 200 干熱 2 h。 6 分析步驟 6.1 接種菌懸液的制備 6.1.1 將凍干菌株（4.1）活化后，轉(zhuǎn)接到乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（4.3.1）中，36 1 培養(yǎng)過夜。再轉(zhuǎn)接 23 代來增強活力。然后再將其從固體培養(yǎng)上轉(zhuǎn)接到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基（4.3.2）中培養(yǎng)。 6.1.2 將乳酸桿菌肉湯中的培養(yǎng)液以 2000 轉(zhuǎn)/分鐘離心 2 min3 min，傾出上清液，加入 10 mL 氯化鈉溶液 （4.7） ， 混勻， 再離心 2 min3 min， 如此清洗 3 次4 次， 吸適量該菌懸液于 10 mL 氯化鈉 （4.7）中，待測。 6.1.3 用分光光度計以氯化鈉溶液（4.7）做空白，于 550 nm 波長下測菌懸液（6.1.2）的透光率，使其透光率在 60 %80 %之間。 6.2 樣品的處理 6.2.1 干粉樣品 稱取一定量樣品（精確至 0.0001 g）于 250 mL 三角瓶中，該樣品應含 0.2 g0.5 g 生物素。繼續(xù)6.2.3 步驟。 6.2.2 液體樣品 吸一定量的液體樣品于 250 mL 三角瓶中，該樣品應含 0.2 g0.5 g 生物素。繼續(xù) 6.2.3 步驟。 6.2.3 樣品的提取 GB 5413.192010 3 加入硫酸溶液 （4.5） 100 mL， 121 水解 30 min， 冷卻后用氫氧化鈉溶液 （4.6） 調(diào)節(jié) pH 至 4.50.2，定量轉(zhuǎn)到 250 mL 容量瓶中，用水定容，充分混合。用濾紙過濾，棄去最初的幾毫升。吸取濾液 5 mL，加入約 20 mL 水，用氫氧化鈉溶液（4.6）調(diào) pH 為 6.80.2,定量轉(zhuǎn)到 100 mL 容量瓶中，用水定容。 6.3 標準曲線的制作 按表 1 順序加入水、標準曲線工作液（4.8.4）和生物素測定用培養(yǎng)基（4.3.3）于培養(yǎng)管中，一式三份。 表1 標準曲線的制作 試管號 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 水（mL） 5 5 4 3 2 1 0 2 1 0 標準曲線工作液 0.1 ng/mL（mL） 0 0 1 2 3 4 5 0 0 0 標準曲線工作液 0.2 ng/mL（mL） 0 0 0 0 0 0 0 3 4 5 培養(yǎng)基（mL） 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 6.4 待測液的制作 按表 2 順序加水、樣品溶液（6.2.3）和生物素測定用培養(yǎng)基（4.3.3）于培養(yǎng)管內(nèi)，一式三份。 每份樣品需帶樣品空白試管一只，管內(nèi)分別加入5 mL待測液和5 mL培養(yǎng)基。 表2 待測液的制作 試管號 1 2 3 4 樣品空白 水（mL） 4 3 2 1 0 樣品溶液（mL） 1 2 3 4 5 培養(yǎng)基（mL） 5 5 5 5 5 6.5 滅菌 將6.3和6.4中所有的試管蓋上試管帽，放入滅菌釜內(nèi)，121 滅菌5 min（商品培養(yǎng)基按標簽說明進行滅菌）。 6.6 接種 從滅菌釜內(nèi)取出試管，將試管迅速冷卻至30 以下。將接種菌懸液（6.1.2）用滴管或移液器向上述試管中各滴加一滴（約50 L），其中標準曲線管中未接種空白S1和樣品空白除外。 6.7 培養(yǎng) 將試管放入培養(yǎng)箱內(nèi)，36 1 培養(yǎng)19 h20 h。 6.8 測定 對每支試管進行視覺檢查，接種空白試管 S1 內(nèi)培養(yǎng)液應是澄清的，如果出現(xiàn)渾濁，則結(jié)果無效。 6.8.1 以接種空白試管 S1 做對照，測定最高濃度標準曲線試管的吸光度，兩小時后重新測定。兩次結(jié)果透光率差值若小于 2 %，則取出全部檢驗管測其吸光度 A。 6.8.2 以接種空白試管 S2 為空白，調(diào)節(jié)吸光度為 0，依次讀出其他每支試管的吸光度 A，樣品空白的吸光度 A 一并讀出。 6.8.3 用渦旋混合器充分混合每一支試管（也可以加一滴消泡劑）后，立即將培養(yǎng)液移入比色皿內(nèi)進行測定，波長為 550 nm，待讀數(shù)穩(wěn)定 30 s 后，讀出吸光度 A，每支試管穩(wěn)定時間要相同。以生物素標準品的含量為橫坐標，吸光度 A 為縱坐標作標準曲線。 6.8.4 待測液培養(yǎng)試管中，樣品空白試管吸光度應小于 0.05。若樣品空白試管吸光度大于 0.02，加入待測液 1 mL 的試管的吸光度值要減去其樣品空白試管吸光度值的 1/5， 加入待測液 2 mL 的試管的吸光GB 5413.192010 4 度值要減去其樣品空白試管吸光度值的 2/5，以此類推，作為計算結(jié)果的依據(jù)。根據(jù)待測液的吸光度 A，從標準曲線中查得該待測液中生物素的濃度， 再根據(jù)稀釋因子和稱樣量計算出試樣中生物素的含量。 吸光度值超出標準曲線管 S3S10 范圍的試樣管要舍去。 6.8.5 對每個編號的待測液試管，用每支試管的吸光度值計算每毫升該編號待測液生物素的含量，并計算該編號待測液的生物素含量平均值，每支試管測得的該濃度不得超過該平均值的15%，超過者要舍去。如果符合該要求的管數(shù)少于所有四個編號待測液總管數(shù)的 2/3，需要重新檢驗。如果符合該要求的管數(shù)大于等于原來管數(shù)的 2/3， 重新計算每一編號的有效試樣管中每毫升測定液生物素含量的平均值，以此平均值計算全部編號試樣管的總平均值 Cx，用于計算試樣中的生物素含量。 7 分析結(jié)果的表述 試樣中生物素的含量按公式 (1) 計算： 1001000=fmCXx (1) 式中： X試樣中生物素的含量，單位為微克每百克（g/100 g） ； Cx6.8.5 中計算所得的總平均值，單位為納克（ng） ； m試樣的質(zhì)量，單位為克（g） ； f稀釋倍數(shù)。 以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術平均值表示，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。 8 精密度 在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術平均值的 10 %。 9 其他 本標準檢出限為 20.0 g/kg。 GB 5413.192010 5 附錄 A （規(guī)范性附錄） 培養(yǎng)基和試劑 A.1 乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基 A.1.1 成分 胨化乳 15.0 g，酵母浸膏 5.0 g，葡萄糖 10.0 g，番茄汁 100 mL，磷酸二氫鉀 2.0 g，聚山梨糖單油酸酯 1.0 g，加水至 1000 mL，調(diào)節(jié) pH 至 6.80.2（25 5 ） 。 A.1.2 制法 在 A.1.1 中加入 10.0 g 瓊脂，加熱煮沸，使瓊脂溶化?；旌暇鶆蚝蠓盅b試管，每管 10 mL。121 高壓滅菌 15 min，備用。 A.2 乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基 A.2.1 成分 胨化乳 15.0 g，酵母浸膏 5.0 g，葡萄糖 10.0 g，番茄汁 100 mL，磷酸二氫鉀 2.0 g，聚山梨糖單油酸酯 1.0 g，加水至 1000 mL，調(diào)節(jié) pH 至 6.8 0.2（25 5 ） 。 A.2.2 制法 將 A.2.1 成分加熱煮沸，混合均勻后分裝試管，每管 10 mL。121 高壓滅菌 15 min。 A.3 生物素測定用培養(yǎng)基 A.3.1 成分 維生素測定用酪蛋白氨基酸 12.0 g，葡萄糖 40.0 g，乙酸鈉 20.0 g，L-胱氨酸 0.2 g，DL-色氨酸 0.