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第 五 章 花藥與花粉培養(yǎng),第一節(jié) 花藥與花粉培養(yǎng)的概念及意義 一、花藥與花粉培養(yǎng)的概念 花藥是植物花的雄性器官,包括二倍性的藥壁和藥隔組織以及單倍性的雄性性細胞花粉粒。 (一)花藥培養(yǎng): 是把整個花藥接種到培養(yǎng)基上,在離體培養(yǎng)條件下,分裂、分化,最終發(fā)育成完整植株的過程。花藥培養(yǎng)的外植體是植物雄性生殖器官的一部分。,(二)花粉培養(yǎng): 是把花粉(小孢子)從花藥中分離出米,接種到培養(yǎng)基上,在離體培養(yǎng)條件下,誘導形成單倍體的孢子體的過程。花粉培養(yǎng)是將花粉從花藥中游離出來,成為分散或游離態(tài)進行培養(yǎng)。,二、花藥和花粉培養(yǎng)的意義 作物單倍體只具有單套染色體組,本身沒有或很少有育種價值,但經(jīng)染色體加倍成為雙倍體后,與常規(guī)育種有機結合,就會顯示出巨大的優(yōu)勢。而作物單倍體尤其是雙單倍體與分子生物學、基因工程的密切結合,可使作物育種發(fā)生革命性的變化。,(一) 作物育種能迅速獲得純合體 (二)物種進化研究 (三)體細胞融合 (四)遺傳分析 (五)分子生物學研究 (六)植物基因克隆篩選,第二節(jié) 離體條件下的小孢子發(fā)育 一、離體小孢子發(fā)育途徑 在自然條件下被子植物雄配子的形成過程是: 孢原組織 花粉母細胞(減數(shù)分裂)四分孢子單核花粉粒(有絲分裂)二核花粉粒(1個營養(yǎng)核和1個生殖核) 生殖核再經(jīng)過一次有絲分裂形成3核的成熟花粉粒(1個營養(yǎng)核和2個生殖核)或稱雄配子體,在離體培養(yǎng)條件下,由于改變了花粉原來的生活環(huán)境,花粉的正常發(fā)育途徑受到抑制,由第一次分裂形成的花粉不再像正常發(fā)育過程中那樣由生殖核再分裂一次形成2個精子核,而是像胚細胞一樣持續(xù)分裂增殖。根據(jù)對多種植物花藥或花粉培養(yǎng)的觀察,發(fā)現(xiàn)小孢子的發(fā)育途徑主要有對稱發(fā)育途徑和不對稱發(fā)育途徑2類。,(一)對稱發(fā)育途徑 小孢子第一次有絲分裂為均等分裂,形成兩個相同的核,并接著發(fā)生細胞壁經(jīng)小孢子分割成兩個大小相似的細胞。這兩個細胞倘若在以后的幾次分裂中是同步的,則大多數(shù)以胚狀體的形式形成花粉胚;倘若這兩個細胞再次分裂不同步,其中一個停止分裂,另一個經(jīng)過相當長時間的持續(xù)分裂,則形成愈傷組織;再倘若這兩個細胞在進行多次核分裂的同時,發(fā)生核融合,其結果產(chǎn)生多倍體植株 。,(二)不對稱發(fā)育途徑 同自然情況一樣,小孢子第一次有絲分裂為不均等分裂,在花粉內(nèi)形成一個較大的營養(yǎng)核和一個較小的生殖核。根據(jù)兩個核進一步發(fā)育狀況,該途徑又分為生殖細胞發(fā)育途徑、營養(yǎng)細胞發(fā)育途徑、營養(yǎng)細胞和生殖細胞并發(fā)發(fā)育途徑3種:,1、生殖細胞發(fā)育途徑 營養(yǎng)細胞經(jīng)幾次分裂后便停止分裂,由生殖細胞繼續(xù)分裂,形成多細胞的(或稱多核)花粉,進一步發(fā)育形成愈傷組織或胚狀體 2、營養(yǎng)細胞發(fā)育途徑。 生殖細胞經(jīng)幾次分裂后便停止分裂,由營養(yǎng)細胞繼續(xù)分裂,形成多細胞的(或稱多核)花粉,進一步發(fā)育形成愈傷組織或胚狀體 3、營養(yǎng)細胞和生殖細胞并發(fā)發(fā)育途徑。 營養(yǎng)細胞和生殖細胞分別進行分裂,形成多細胞的(或稱多核)花粉,進一步發(fā)育形成愈傷組織或胚狀體。,小孢子正常發(fā)育途徑與離體培養(yǎng)條件下胚胎發(fā)育途徑比較,A:第一次有絲分裂為非均等分裂,形成一個營養(yǎng)核、一個生殖核 A-v:營養(yǎng)核重復分裂而生殖核敗育 A-G:生殖核重復分裂而營養(yǎng)核敗育 A-VG:生殖核和營養(yǎng)核共同分裂 C:營養(yǎng)核、生殖核分別或同時進行核內(nèi)復制,有絲分裂后核融合分別形成二倍體、三倍體、四倍體胚 B:第一次有絲分裂為均等分裂,形成兩個相似的營養(yǎng)型核,進而重復分裂形成單倍體胚或先核融合然后重復分裂形成多倍體胚 D:自然條件下小孢子的第二次分裂、淀粉粒及萌發(fā)形成的花粉管(即正常發(fā)育途徑),二、影響離體小孢子發(fā)育的因素 影響離體小孢子發(fā)育的因素主要有供體植株的基因型、供體植株的生長條件和生理狀態(tài)、供體植株的年齡、小孢子發(fā)育時期、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等。 (一)供體植株的基因型 供體植株的基因型是影響花藥和花粉培養(yǎng)的最重要的因素之一。一般來說裸子植物比較困難,而被子植物相對比較容易;同一物種不同品種間,甚至同一品種的不同株系間,花藥和花粉培養(yǎng)的難易程度也大不相同。,(二)生理狀態(tài) 供體植株的年齡及其所處的生長條件也能影響花藥對離體培養(yǎng)的反應。一般來說,幼年植株的花藥反應能力較好。在開花末季采集的花藥不但形成孢子體的頻率很低,而且發(fā)生反應的時間也較遲。在水稻和小麥等禾谷類植物中,大田植株比溫室植株、主莖穗比分蘗穗花粉愈傷組織的誘導率高。,(三)培養(yǎng)基成分 花藥和花粉培養(yǎng)所用的基礎培養(yǎng)基以MS最為普遍,其次是B5和N6培養(yǎng)基,其中N6培養(yǎng)基特別適合水稻的花藥培養(yǎng)。 不同植物種類及品種間所需的培養(yǎng)基成分存在很大差異。有些植物只需很簡單的培養(yǎng)基,例如煙草的花藥培養(yǎng),即使在僅含有蔗糖和螯合鐵的溶液中,也可誘導部分花粉啟動、形成少量的胚狀體。而對于大多數(shù)植物來說,則需要較為復雜的培養(yǎng)基成分。,(四)藥壁因子 大量的證據(jù)表明,在花粉胚發(fā)育過程中花藥壁起著重要的作用。 (五)花粉發(fā)育時期 在花藥和花粉培養(yǎng)過程中,小孢子所處的發(fā)育時期是影響培養(yǎng)效果的重要因素。只有處于一定發(fā)育階段的小孢子,才能對外界刺激較為敏感,從而改變其發(fā)育途徑,由配子體轉向孢子體方向,從而產(chǎn)生愈傷組織或胚狀體。,不同植物花藥或花粉培養(yǎng)的取材時期,(六)預處理 對花蕾或花藥進行預處理,能有效地促進花粉愈傷組織或胚狀體形成,提高培養(yǎng)的成功率。常用的預處理措施主要是低溫處理和熱激處理。低溫預處理是指在培養(yǎng)之前,將材料置低溫條件下(014)處理一段時間再進行接種。熱激處理則是指將接種后的花藥或花粉置于高溫條件下(3035)培養(yǎng)一段時間,然后再移至正常溫度下繼續(xù)培養(yǎng)。,(七)培養(yǎng)條件 1、溫度 對任何培養(yǎng),細胞生長的最適溫度都因物種而異。花藥和花粉培養(yǎng)的溫度一般以25為宜,但也有些植物對溫度有特殊的要求。 2、光照 誘導愈傷組織一般不需要光照,但光照有助于器官的分化。雖然在某些植物中,無論有無光照都能形成花粉植株,但在光照下植株的形成頻率較高,生長也更健壯。 3、植板密度 花粉培養(yǎng)中,接種的花粉密度和分化培養(yǎng)時愈傷組織或細胞團植板密度對植株生根有很大影響。,第三節(jié) 花藥與花粉培養(yǎng)的技術 一、花藥培養(yǎng)的方法 花藥培養(yǎng)是指在離體條件下,對完整花藥進行培養(yǎng)的技術。從組織器官角度來說,它屬于器官培養(yǎng)的范疇?;ㄋ幣囵B(yǎng)的方法大致可分為以下幾個步驟:,(一) 取材 是花藥或花粉培養(yǎng)成功的基礎。大量的實驗表明,培養(yǎng)內(nèi)含減數(shù)分裂期至雙核期花粉的花藥,均有可能誘導形成單倍體植株,但最佳時期則依物種類或品種不同而異,大多數(shù)為單核中、晚期。接種前,通常先用醋酸洋紅染色壓片法鏡檢,以確定花粉的發(fā)育時期,并找出花粉發(fā)育時期與花蕾大小等表觀特征的相互關系。然后取適宜時期的花蕾作為接種材料。,(二)預處理 適當?shù)念A處理可以顯著提高花藥的愈傷組織誘導率。常用的預處理方法是低溫冷藏,具體的處理溫度和時間長度因物種而異: 煙草79,714 天; 水稻710,1015 天; 黑麥13,714 天; 大麥3-7,714天。 但低溫預處理對小麥效果不穩(wěn)定,有時還有負效果。,(三) 材料滅菌 在無菌條件下,先將花蕾用70%酒精浸泡30秒左右,再用0.1%氯化汞表面消毒810分鐘,或用1%的次氯酸鈉消毒1015分鐘,然后用無菌水沖洗35次。,(四) 接種培養(yǎng) 無菌條件下將花藥從花蕾中取出,直接接種到誘導培養(yǎng)基上。取花藥時,應注意盡量避免損傷花藥,以免從受傷處產(chǎn)生藥壁愈傷組織;另外還要注意徹底去除花絲部分,因為接種與花絲相連的花藥時,往往不利于花藥內(nèi)小孢子的啟動,以及愈傷組織或胚狀體的形成?;ㄋ幣囵B(yǎng)的方式有固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)2種。 花藥培養(yǎng)一般是先暗培養(yǎng),待愈傷組織形成后,再轉入光照條件下培養(yǎng),促進器官分化。光照時間和培養(yǎng)溫度因培養(yǎng)材料而異。,(五)壯苗和移栽 花藥植株非常嬌嫩很難移栽,需采用逐步過渡的方式,使其適用從異養(yǎng)到自養(yǎng),因此,要通過壯苗階段。移栽的關鍵是保持高空氣濕度(80%90%)12周和低土壤濕度。,選幼年樹花蕾,消毒接種培養(yǎng),(單核期,或單核中晚期),花藥培養(yǎng)流程,二、花粉培養(yǎng)的方法 花粉培養(yǎng)(小孢子培養(yǎng)),即未成熟花粉的培養(yǎng),是指在離體條件下,對游離的小孢子進行培養(yǎng)的技術。與花藥培養(yǎng)相比,操作較為復雜,從組織器官角度來說,花粉培養(yǎng)屬于細胞培養(yǎng)的范疇。 花粉培養(yǎng)的全過程除了材料的選擇、滅菌與花藥培養(yǎng)基本相同外,還包括小孢子的分離、純化和培養(yǎng)3個步驟。,(一) 小孢子的分離 小孢子的分離有自然散落法、擠壓法和機械法等3種: 1.自然散落法。 花藥消毒后,無菌條件下取出花藥,接種在液體培養(yǎng)基中,當花藥自然開裂、釋放出花粉后,去除花藥壁,繼續(xù)培養(yǎng)或離心收集花粉后培養(yǎng)。,2.擠壓法。 花藥消毒后,置無菌培養(yǎng)皿或小燒杯中,加入少量小孢子提取液或培養(yǎng)液,用平頭大玻棒或注射器內(nèi)管輕輕擠壓,使花粉釋放出來,此法簡便易行,是少量分離小孢子常用的方法,但不適宜大規(guī)模游離小孢子的操作。,3.機械游離法。 有磁攪拌和小型攪拌2種,前者將花粉置于裝有小孢子提取液或培養(yǎng)液的三角瓶中,放入一根磁棒,至磁力攪拌器上,低速旋轉使花粉釋放出來。該法分離花粉比較徹底,但對花粉有不同程度的機械損傷。后者將花藥放入小型攪拌器中,加入適量的小孢子提取液或培養(yǎng)液。通過高速運轉,帶動花蕾花藥高速運動而破碎,使小孢子游離出來。,(二) 小孢子的純化 小孢子分離出來以后,需要經(jīng)過純化才能獲得純凈的小孢子。純化的一般方法是將分離出的小孢子用一定孔徑的尼龍網(wǎng)膜過濾到離心管里,于500-1000r/分鐘下離心2-3分鐘,去掉上清液;再加入小孢子清洗液,重新懸浮小孢子,離心1-2分鐘,重復清洗2-3次,最后倒出上清液,向離心管中加入液體培養(yǎng)基,用血球計數(shù)板計數(shù),將小孢子調(diào)整到一定密度,進行分裝、培養(yǎng)。,(三) 小孢子的培養(yǎng) 小孢子培養(yǎng)主要有淺層培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、雙層培養(yǎng)、看護培養(yǎng)、懸滴培養(yǎng)、條件培養(yǎng)等方法。 其中,淺層培養(yǎng)和平板培養(yǎng)2種方法較為常用?,F(xiàn)簡要介紹雙層培養(yǎng)和懸滴培養(yǎng)。,選幼年樹花蕾,取下花蕾(鏡檢),取花藥,藥壁向花粉提供營養(yǎng)物質; 通過藥壁吸收、貯存和轉化培養(yǎng)基中的外源物質,消毒,過濾離心,再生,花粉培養(yǎng)流程,小孢子培養(yǎng)的優(yōu)越性 排除了藥壁、藥隔、花絲等體細胞組織的干擾,獲得的再生植株都是來源于單倍體的小孢子(花粉); 花藥培養(yǎng)中,有時會因花藥中的某些物質而影響小孢子的啟動分裂,而小孢子培養(yǎng)則不存在這種問題; 小孢子培養(yǎng)中,由于小孢子是游離的單倍體細胞,除不受等位基因影響外,能均勻地接觸外部環(huán)境條件(如化學、物理誘變),因此是研究轉化和誘變的理想材料; 便于系統(tǒng)觀察小孢子在離體條件下的生長發(fā)育過程,是研究發(fā)育極好的材料體系: 小孢子培養(yǎng)從每個花藥中能獲得更多的再生植株。,三、 單倍體植株鑒定及染色體加倍 (一)單倍體植株鑒定方法 1染色體直接計數(shù)法: 通過植株的根尖或莖尖等細胞分裂旺盛處的細胞染色體直接計數(shù)是最有效的方法。 2 細胞形態(tài)學鑒定法 葉片保衛(wèi)細胞的大小、單位面積上的氣孔數(shù)及保衛(wèi)細胞中葉綠體的大小和數(shù)目與倍性具有高度的相關性。,3植株形態(tài)學鑒定法 不同倍性的植株在形態(tài)上有比較明顯的差別,主要表現(xiàn)在子葉、真葉、花等的形狀、大小和顏色,開花結實性,花粉著色能力及大小,果實形狀及種子的形態(tài)等。 4流式細胞儀鑒定 流式細胞儀可迅速測定葉片單個細胞的DNA含量,進而根據(jù)DNA含量曲線圖推斷細胞的倍性。,5生化或分子標記鑒定法 (1) 生化標記鑒定。 主要是用同工酶對再生植株來源和倍性鑒定。 (2)分子標記鑒定。 可用來鑒定再生植株 來源和倍性。近年來,隨著分子生物學技術的發(fā)展,不斷涌現(xiàn)的各種分子標記技 術(如RFLP、RAPD、AFLP、SSR等)作為遺傳育種的重要手段得到了廣泛應用。,6雜交鑒定法 分為自交鑒定和測交鑒定。前者適用于自花授粉植物,自交后代群體分離則該二倍體為雜合二倍體,否則為純合二倍體。有時也利用四倍體自交結實率較低的特性鑒定四倍體植株。測交鑒定適用于雌雄異株的植物,如石刁柏、啤酒花、獼猴桃等。方法是使雄株和雌株雜交,從F1分離比例來判斷親代雄株的基因型,從而判斷雄親是來自小孢子還是體細胞。,(二) 單倍體植株的染色體加倍 單倍體植株弱小、不育,沒有直接的利用價值,只有經(jīng)過染色體加倍,使之成為二倍體的可育植株,才能應用于育種。單倍體植株的染色體加倍主要有以下3種途徑。 1自然加倍 在誘導形成單倍體植株的過程中,往往有一些植株會自然加倍。,2人工誘導加倍 盡管在花藥和花粉培養(yǎng)中,單倍體可以自然加倍成二倍體,但對自然加倍率較低的一些植物來說,僅靠單倍體的自然加倍,不能滿足育種實踐的

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