金線蓮與菌根真菌共生萌發(fā)的營養(yǎng)及生態(tài)調(diào)控

序號：編碼：“挑戰(zhàn)杯”大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽決賽作品申報書作品名稱：金線蓮與菌根真菌共生萌發(fā)的營養(yǎng)及生態(tài)調(diào)控所在學(xué)院：農(nóng)學(xué)院申報者姓名（集體名稱）：蘇嘉欣陳志輝陳曉君林依敏類別：√自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文 □哲學(xué)社會科學(xué)類社會調(diào)查報告和學(xué)術(shù)論文□科技發(fā)明制作A類□科技發(fā)明制作B類

說明1.申報者應(yīng)在認(rèn)真閱讀此說明各項內(nèi)容后按要求詳細(xì)填寫。2．申報者在填寫申報作品情況時只需根據(jù)個人項目或集體項目填寫A1或A2表，根據(jù)作品類別（自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文、哲學(xué)社會科學(xué)類社會調(diào)查報告和學(xué)術(shù)論文、科技發(fā)明制作）分別填寫B(tài)1、B2或B3表。所有申報者可根據(jù)情況填寫C表。3.表內(nèi)項目填寫時一律用鋼筆或打印，字跡要端正、清楚，此申報書可復(fù)制。4.序號、編碼由競賽組委會填寫。5．學(xué)術(shù)論文、社會調(diào)查報告及所附的有關(guān)材料必須是中文（若是外文，請附中文本），請以4號楷體打印在A4紙上，附于申報書后，字?jǐn)?shù)在8000字左右（文章版面尺寸14.5×22cm）。

A2申報者情況（集體項目）說明：1．必須由申報者本人按要求填寫；2．申報者代表必須是作者中學(xué)歷最高者，其余作者按學(xué)歷高低排列；3．本表中的學(xué)籍管理部門簽章視為申報者情況的確認(rèn)。申報者代表情況姓名蘇嘉欣性別女出生年月1987.7學(xué)院農(nóng)學(xué)院系別、專業(yè)、年級06級生態(tài)系生態(tài)學(xué)歷本科在讀學(xué)制4入學(xué)時間 2006.9作品名稱金線蓮與菌根真菌共生萌發(fā)的營養(yǎng)及生態(tài)調(diào)控畢業(yè)論文題目蚯蚓菌根黑麥草聯(lián)合修復(fù)PCBs污染土壤的效應(yīng)通訊地址廣州天河五山路486號，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)躍進(jìn)南34208郵政編碼510642辦公電住地通訊地址廣州天河五山路486號，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)躍進(jìn)南34208郵政編碼510642住宅電話02038694884其他作者情況姓名性別年齡學(xué)歷所在單位陳曉君女1986.12本科在讀農(nóng)學(xué)院林依敏女1988.01本科在讀農(nóng)學(xué)院陳志輝男1985.07本科在讀園藝學(xué)院資格認(rèn)定學(xué)院學(xué)籍管理部門意見以上作者是否為2009□是□否（部門簽章）年月日院系負(fù)責(zé)人或?qū)熞庖姳咀髌肥欠駷檎n外學(xué)術(shù)科技或社會實踐活動成果□是□否負(fù)責(zé)人簽名：年月日

B1．申報作品情況（自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文）說明：1．必須由申報者本人填寫；2．本部分中的科研管理部門簽章視為對申報者所填內(nèi)容的確認(rèn)；3．作品分類請按作品的學(xué)術(shù)方向或所涉及的主要學(xué)科領(lǐng)域填寫；4．碩士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全稱作品分類（D）A．機械與控制（包括機械、儀器儀表、自動化控制、工程、交通、建筑等）B．信息技術(shù)（包括計算機、電信、通訊、電子等）C．?dāng)?shù)理（包括數(shù)學(xué)、物理、地球與空間科學(xué)等）D．生命科學(xué)（包括生物、農(nóng)學(xué)、藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、健康、衛(wèi)生、食品等）E．能源化工（包括能源、材料、石油、化學(xué)、化工、生態(tài)、環(huán)保等）作品撰寫的目的和基本思路作品的科學(xué)性、先進(jìn)性及獨特之處利用金線蓮與真菌共生克服組培苗產(chǎn)周期長，成本高，移栽成活率低，植株抗病蟲能力低的缺點。從一個新的角度研究其栽培繁殖方法，為金線蓮規(guī)?；斯ぴ耘嗵峁┬峦緩剑瑢鉀Q野生金線蓮自然資源匱乏問題有重要意義。作品的實際應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義金線蓮（AnoectochilusroxburghiiHayata），藥材名為金線蓮、本山石松、藥虎、藥王、鳥人參等，為蘭科花葉開唇蘭屬植物。金線蓮植株葉背呈紫紅色，葉24枚，呈卵形或卵圓形，全草可入藥，常作為滋補強壯劑，其味甘微苦，性平微寒，具有解毒、止痛、鎮(zhèn)咳等功效。民間多用于治療肺結(jié)核、肺熱咳嗽、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、小兒驚風(fēng)、跌打損傷、蛇咬傷等多種疾病，均有很好的療效。近年來，金線蓮用于治療高血壓、糖尿病及腫瘤等疑難病癥所取得的成效，日益引起醫(yī)藥界的重視。民間稱其為“神藥”，在臺灣稱為“中藥之王”，目前臺灣市場上其鮮草的價格為每50克300400元新臺幣。其藥用功效在《全國中草藥匯編》（1998年版）中有記載記載。日本醫(yī)藥科技人員還從金線蓮中分離出有藥效的成分并申請了專利。除藥用之外，金線蓮也是一種觀賞價值極高的室內(nèi)觀葉珍品，被稱為珠寶蘭。目前臺灣南投縣和福建、廣西等地開始采用組培苗進(jìn)行人工栽培以滿足市場需求，然而，組培苗成本和價格高居不下，每株苗約需0.5～0.8元人民幣，每畝用苗量約20萬苗，栽培1畝在種苗上的投入就需10多萬元，同時組培苗移栽到大田后成活率低、生長周期長和易發(fā)病等方面在技術(shù)上無法取得突破，使金線蓮栽培業(yè)者面臨著巨大的風(fēng)險，嚴(yán)重制約著金線蓮事業(yè)的向前發(fā)展。本項目模擬金線蓮在自然界與真菌共生繁殖之方式，通過分離、鑒定與金線蓮共生的菌根真菌，并同時用共生真菌侵染組培苗幼苗，以建立共生關(guān)系得到共生苗，并通過人工調(diào)控真菌與植物共培養(yǎng)營養(yǎng)配方與環(huán)境參數(shù)，提高金線蓮組培苗與真菌的侵染率并培育成為菌根共生壯苗，提高種苗移栽后的存活率和抗病力，降低金線蓮栽培的種苗成本和種植風(fēng)險，為實現(xiàn)金線蓮的規(guī)?；N植提供理論基礎(chǔ)。本作品的實施，提高培育所得幼苗的移栽成活率高、生長速度和抗病、抗逆能力，克服金線蓮原材料生產(chǎn)的技術(shù)“瓶頸”，促進(jìn)金線蓮得開發(fā)和利用，即可以滿足市場和消費需要，有望為企業(yè)創(chuàng)作可觀的經(jīng)濟效益，對于弘揚我國中醫(yī)藥文化具有重要的社會意義，也在很大程度上對我國瀕危的野生金線蓮種植資源起到較大的保護(hù)作用。學(xué)術(shù)論文文摘作品在何時、何地、何種機構(gòu)舉行的會議上或報刊上發(fā)表及所獲獎勵鑒定結(jié)果請?zhí)峁τ诶斫?、審查、評價所申報作品具有參考價值的現(xiàn)有技術(shù)及技術(shù)文獻(xiàn)的檢索目錄李煥椹，劉國柱，周正仁.臺灣藥用植物之探討.國立中國醫(yī)藥研究所.臺北市.1976陳裕，林坤瑞，管其寬，林鏡明。金線蓮生物學(xué)特性及生境特點研究。亞熱帶植物通訊，1994,23(1)：1824陳裕，林坤瑞，管其寬，林鏡明。金線蓮的開花特性。亞熱帶植物通訊，1996，25(1)：3537胡珊梅，張啟國，袁文杰，周涵韜，周興旺，陳鷺真。珍稀中草藥金線蓮的RAPD研究。中草藥，2000，31（12）：1316戴國興。珍貴藥用植物金線連之組織培養(yǎng)繁殖。中華農(nóng)學(xué)會報，1986，137：4254肖三元.金線蘭組織培養(yǎng)及快速繁殖研究.廣西熱作科技.1998（1）：1214林蘭英等.金線蓮組織培養(yǎng)中若干因素的研究.亞熱帶植物通訊.1993.22（2）：711肖翌柱等.臺灣金線蓮之組織培養(yǎng).中華農(nóng)業(yè)研究.1995.44（3）：279286于雪梅,郭順星.內(nèi)生真菌促進(jìn)珍稀中草藥金線蓮生長發(fā)育的菌根結(jié)構(gòu)研究.中國北京:2000.張集慧,王春蘭,郭順星,etal.蘭科藥用植物的5種內(nèi)生真菌產(chǎn)生的植物激素.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報.1999，21(6):460465于雪梅,郭順星.金線蓮與內(nèi)生真菌共生培養(yǎng)體系的建立.中國中藥雜志.2000，25(2)：8284.郭順星;于雪梅;高微微;陳曉梅;王春蘭;孟志霞;肖培根.菌根真菌在金線蓮大面積栽培中的應(yīng)用.國家發(fā)明專利，公開號：CN1961651，公開日期：2007.05.16Beyrle,H.F.,Smith,S.E.,Peterson,R.L.andFranco,C.M.M.ColonisationfoOrchismorioprotocormsbyamycorrhizalfungus:effectsofnitrogennutritionandglyphosateinmodifyingtheresponses.CanadianJournalofBotany.1995.73:11281140.Hadley,G.Nonspecificityofsymbioticinfectioninorchidmycorrhiza.NewPhytologist1970(69):10151023TakeshitaT.etal.Hypoglycemicsandlipidmetabolismimprovingagentscontaining3glucosyloxy4hydroxybutyricacidoritsderivastivesfromplant.Jpn.KokaiTokkyoKoho（即：日本公開專利公報）JP1995,7,76522申報材料清單（申報論文一篇，相關(guān)資料名稱及數(shù)量）科研管理部門簽章年月日

C.當(dāng)前國內(nèi)外同類課題研究水平概述說明：1.申報者可根據(jù)作品類別和情況填寫；2.填寫此欄有助于評審。金線蓮的生產(chǎn)和研究中心在臺灣省，近年來，臺灣當(dāng)局有關(guān)部門對金線蓮的開發(fā)研究給予了相當(dāng)大力的支持，得到臺灣官方立項多個項目的支持。在內(nèi)地，福建省是開展金線蓮研究最活躍的地方。福建省科委曾于1991年立項支持該省亞熱帶植物研究所陳裕課題組開展了金線蓮家種配套新技術(shù)及生物學(xué)研究；幾年前，廈門市衛(wèi)生局立項資助廈門市藥品檢驗所胡珊梅等應(yīng)用分子生物學(xué)實驗方法進(jìn)行金線蓮品種鑒別的研究。苗生產(chǎn)是金線蓮人工栽培的重要環(huán)節(jié)，金線蓮組織培養(yǎng)育苗技術(shù)已趨于成熟。臺灣在組織培養(yǎng)繁殖金線蓮方面開始得很早，肖三元、林蘭英和臺灣的蕭翌柱等分別對金線蓮的組織培養(yǎng)進(jìn)行研究，在臺灣南投縣已經(jīng)形成采用組培苗進(jìn)行金線蓮規(guī)模栽培的精致農(nóng)業(yè)。但金線蓮組培苗致命的缺陷是不抗病，栽培期間容易受到莖腐病為害。據(jù)觀察，莖腐病總是發(fā)生在栽培基質(zhì)所掩蓋的地下莖部位，加之金線蓮莖葉具有很強的持水能力，當(dāng)?shù)叵虑o部嚴(yán)重腐爛時植株上部莖葉也不會出現(xiàn)明顯的萎蔫，因此，在莖腐病發(fā)病的初期很難覺察。同時由于金線蓮是藥用植物，因此在管理時不能夠經(jīng)常噴藥防病，而當(dāng)出現(xiàn)病癥時，噴灑農(nóng)藥已經(jīng)是為時過晚了。金線蓮的大規(guī)模人工栽種仍然面臨極大的挑戰(zhàn)，如何培育抗病壯苗乃成功之關(guān)鍵。組培苗與真菌共生形成菌根苗，其抗病能力則大大增強，不易受到病菌的危害，成活率大大提高。菌根真菌是目前真菌學(xué)和植物生理學(xué)之交叉學(xué)科的研究熱點之一，在植物種苗的培育和引種移植方面具有重要意義。共生菌根在天麻人工栽培上的應(yīng)用是目前蘭科植物中最為成功的事例。真菌侵入蘭科植物組織過程中，產(chǎn)生的纖維素酶和果膠酶有助于真菌在原球莖中的定殖；同時真菌的入侵也會誘導(dǎo)植物的防御反應(yīng)和誘導(dǎo)抗侵入，主要表現(xiàn)在細(xì)胞壁的增厚、胼胝質(zhì)淀積、水解酶和植保素的產(chǎn)生等，從而加強了植株的抗病和抗逆能力。真菌與胚的相互作用就如進(jìn)攻和防御的戰(zhàn)場一樣，最后有三種不同的結(jié)果：(a)菌根相互作用：真菌成功侵入并在在原球莖的薄壁細(xì)胞中形成菌絲球，之后被溶解利用，促進(jìn)植株的生長。(b)寄生物的相互作用：真菌成功侵入后在相互作用的過程中，蘭花細(xì)胞由于菌絲的過度生長而導(dǎo)致原球莖的死亡。(c)抗性反應(yīng)：真菌會被排斥在蘭花組織之外。這種相互作用可能在一群類原球莖中同時發(fā)生，值得注意的是，這種植物真菌的關(guān)系具有動力學(xué)的和相對不穩(wěn)定的特性。在任何蘭花種類中，發(fā)生的比例都受到營養(yǎng)和環(huán)境因子的影響，人工控制培養(yǎng)條件，特別是在培養(yǎng)基中調(diào)節(jié)碳源和氮源的化合物的種類和濃度，能夠改變以上三種不同種類原球莖的比例；因此，共生機制的研究和共生平衡關(guān)系的建立一直是蘭花菌根研究的主要課題。與組培苗相比較，共生苗具有抗病、抗逆、適應(yīng)能力強和生長較快的優(yōu)點。但目前尚未見有關(guān)絲核菌（Rhizoctoniasp.）侵染金線蓮建立共生關(guān)系的報道。采用真菌與組培苗建立共生關(guān)系是獲得共生金線蓮苗的一條途徑，于雪梅等對金線蓮內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離，并研究了其生物學(xué)活性及所產(chǎn)生的植物激素，還試圖建立金線蓮組培苗與內(nèi)生真菌共生培養(yǎng)體系，以期通過組培苗與真菌共生獲得共生苗；郭順星等采用石斛小菇(Mycenadendrobii)、紫萁小菇(Mycenaosmundicola)、蘭小菇(Mycenaorchidicola)、開唇蘭小菇(Mycenaanoectochila)分別培養(yǎng)菌根真菌和金線蓮幼苗，再將菌根真菌與金線蓮幼苗共生栽培的技術(shù)，但效果并不理想?？梢姡壳敖鹁€蓮共生苗的培育技術(shù)還遠(yuǎn)未成熟，且目前尚未見有關(guān)金線蓮組培苗共生萌發(fā)的報道。D.推薦者情況及對作品的說明說明：1．由推薦者本人填寫；2．推薦者必須具有高級專業(yè)技術(shù)職稱，并是與申報作品相同或相關(guān)領(lǐng)域的專家學(xué)者或?qū)I(yè)技術(shù)人員（教研組集體推薦亦可）；3．推薦者填寫此部分，即視為同意推薦；4．推薦者所在單位簽章僅被視為對推薦者身份的確認(rèn)。推薦者情況姓名方祥性別男年齡38職稱副教授工作單位華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院通訊地址廣州天河五山路486號，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院郵政編碼510642單位電話020885280267住宅電薦者所在單位簽章（簽章）年月日請對申報者申報情況的真實性作出闡述申報者已做了大量工作，申報材料真實可信。請對作品的意義、技術(shù)水平、適用范圍及推廣前景作出您的評價菌根真菌是目前真菌學(xué)和植物生理學(xué)之交叉學(xué)科的研究熱點之一，在植物種苗的培育和引種移植方面具有重要意義。金線蓮是一種名貴中草藥，目前自然界已顰臨滅絕，如何保護(hù)和合理開發(fā)是擺在廣大研究者面前的一項重要課題。雖然組培技術(shù)基本成熟，但組培苗天生的缺陷使其難以越夏，如果組培苗與真菌共生形成菌根苗，其抗病能力則大大增強，不易受到病菌的危害，成活率大大提高。本研究技術(shù)成熟對于金線蓮的保護(hù)和開發(fā)均具有重要的理論意義和經(jīng)濟價值。其它說明金線蓮與菌根真菌共生萌發(fā)的營養(yǎng)及生態(tài)調(diào)控申報材料清單（2008.8.262009.3.3）項目進(jìn)展：一、金線蓮與菌根真菌共生培養(yǎng)體系的建立1、促進(jìn)形成共生的培養(yǎng)基篩選1.1第一批預(yù)試驗1.2第二批預(yù)試驗1.3第三批預(yù)試驗1.4正式實驗1.5正式實驗22、不同基質(zhì)上金線蓮與真菌的共生2.1移栽苗二、菌根真菌組織學(xué)觀察三、菌根真菌重分離與鑒定3.1絲核菌的分離3.2絲核菌培養(yǎng)性狀的觀察3.3絲核菌菌絲的觀察及其直徑的測量3.4絲核菌細(xì)胞核的染色3.5菌絲融合測定四、菌種的分子鑒定（正開展）現(xiàn)在已完成的四批預(yù)實驗中，除第一批未達(dá)到預(yù)期目的外，其余三批預(yù)實驗都能建立共生體系，并且形成共生類原球莖，進(jìn)而分化成共生苗。四批預(yù)實驗初步探討了不同因素對共生體系建立的影響，為正式實驗的進(jìn)行提供依據(jù)?，F(xiàn)已開展的正式實驗2從不同因素、水平上探討對金線蓮與菌根真菌共生培養(yǎng)體系的建立的影響因素。同時，將第三批預(yù)試驗的共生苗移栽，探討共生苗在外界環(huán)境中的生長狀況，為應(yīng)用于生產(chǎn)提供依據(jù)。我們也進(jìn)行了菌根的組織學(xué)觀察，探討了菌根的形成過程。菌根真菌重分離與鑒定階段，我們探討了與金線蓮形成共生的三種真菌的形態(tài)特性、菌落特征，初步判斷這三種真菌為同一菌屬?，F(xiàn)階段的菌種的分子鑒定，目的是為了鑒定三種真菌是否為同一種，以及尋找真菌誘導(dǎo)金線蓮特異表達(dá)的基因。一、金線蓮與菌根真菌共生培養(yǎng)體系的建立1、促進(jìn)形成共生的培養(yǎng)基篩選1.1第一批預(yù)試驗2008.8.26目的：觀察板栗葉對金線蓮與真菌共生是否有促進(jìn)作用方法：將苗分成尖、莖、頭、全株幾部分，分別接到帶菌的板栗葉子上，板栗葉預(yù)先用PDB侵泡過，菌先于苗5天接種。同時設(shè)對照，培養(yǎng)條件分黑暗和光照兩種。選板栗葉的原因：金線蓮野外生長最適宜環(huán)境是山澗常綠闊葉林樹林的枯枝落葉層中，并且根據(jù)文獻(xiàn)可知板栗葉中有某種物質(zhì)能促進(jìn)絲核菌的生長。說明：材料來自生科院，分嫩苗、中等苗、老苗。尖指最苗的最上端部分，莖是苗中間部分，頭指最苗下端，都帶12個節(jié)。表1.1.1培養(yǎng)條件：25攝氏度黑暗，提前5天接菌JSH1時間10天材料個數(shù)存活（全綠）半死（部分綠部分腐爛）死亡死亡率共生關(guān)系備注嫩苗尖180018100%否一些是腐爛大半，但幾乎是死亡，活不了。嫩苗莖5005100%否嫩苗全株604233.33%否中等尖5005100%否中等莖63300%否氣生根43100%否老苗尖302133.33%否總共476103165.96%時間22天材料個數(shù)存活（全綠）半死（部分綠部分腐爛）死亡死亡率共生關(guān)系嫩苗尖180018100%否嫩苗莖5005100%否嫩苗全株611466.67%否中等尖5005100%否中等莖611466.67%否氣生根411250%否老苗尖3003100.00%否總共47334187.23%表1.1.2培養(yǎng)條件：25攝氏度光照，提前5天接菌JSH1時間10天材料個數(shù)存活（全綠）半死（部分綠部分腐爛）死亡死亡率共生關(guān)系備注嫩苗尖1001990%否嫩苗莖7007100%否嫩苗全株503240%否中等莖1113763.64%否老苗尖502360%否老苗莖12021083.33%否氣生根10100%否總共511123874.51%時間22天材料個數(shù)存活（全綠）半死（部分綠部分腐爛）死亡死亡率共生關(guān)系嫩苗尖100010100.00%否嫩苗莖7007100.00%否嫩苗全株5005100.00%否中等莖110011100.00%否老苗尖5005100.00%否老苗莖120012100.00%否氣生根1001100.00%否總共510051100.00%表1.1.3培養(yǎng)條件：25攝氏度光照，不接菌時間10天材料個數(shù)存活（全綠）半死（部分綠部分腐爛）死亡死亡率嫩苗尖40400%嫩苗莖503240%嫩苗頭301266.67%中等莖650116.67%老苗尖44000%老苗莖98100%氣生根44000%總共35219514.29%時間22天材料個數(shù)存活（全綠）半死（部分綠部分腐爛）死亡死亡率嫩苗尖4004100.00%嫩苗莖5005100.00%嫩苗頭3003100.00%中等莖610583.33%老苗尖4004100.00%老苗莖950444.44%氣生根44000.00%總共351002571.43%結(jié)果：4天后部分組織出現(xiàn)腐爛，10天后，接有菌的嫩苗幾乎全部死亡，中老苗也出現(xiàn)大量死亡；對照大部分存活。22天后觀察，接菌的幾乎全部死亡；20℃黑暗條件下培養(yǎng)比25℃光照培養(yǎng)的稍好，但不接菌的相對生長良好，依然有幾個存活，總體苗與菌沒有形成共生。結(jié)論：板栗葉對金線蓮——真菌共生體系基本沒有多大的促進(jìn)作用，對絲核菌的生長有促進(jìn)作用。1.2第二批預(yù)試驗?zāi)康模罕容^在不加葡萄糖PDA（20%馬鈴薯+0.8%瓊脂）、1/2PDA（20%+1%葡萄糖+0.8%瓊脂）、PDA（20%+2%葡萄糖+0.8%瓊脂）中帶板栗葉和無板栗葉水的培養(yǎng)基中金線蓮與絲核菌的共生情況。方法：將菌JSH1與苗接到以馬鈴薯葡萄糖瓊脂為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基分為,全G（全葡萄糖）PDA、1/2G（1/2葡萄糖）PDA、無G（無葡萄糖）PDA，部分還添加10%板栗葉汁，接菌時間分提前5天接菌和同時接菌兩種，苗分為尖、莖、全株三種，培養(yǎng)條件為25攝氏度，光照培養(yǎng)。說明：下列表“+”表示是或有，“”表示否或無表1.2.1不同培養(yǎng)基中接菌金線蓮出現(xiàn)類原球莖的情況培養(yǎng)基瓶編號株樹同時接菌類原球莖最初出現(xiàn)類原球莖天數(shù)類原球莖個數(shù)(33或38天后)出現(xiàn)類原球莖株數(shù)平均類原球莖個數(shù)（個/株）備注全G板栗葉汁15+1953無板栗葉汁35+3022無板栗葉汁205++172041/2G,板栗葉汁莖54+1633莖+尖+全65+1954尖73+2311全83+2332莖94+00莖123+不祥不祥0污染不作記錄尖163+00無G板栗葉汁全+莖+尖145++19不祥不詳污染全+莖173+1921全+莖185+1832表1.2.2不同培養(yǎng)基中對照培養(yǎng)基瓶編號原球莖生長狀況備注全GCK板栗葉汁20良好污染CK無板栗葉汁40良好污染1/2G,板栗葉汁CK莖100良好CK尖110良好CK全150良好無G板栗葉汁CK莖+尖190良好結(jié)果：4天后，全葡萄糖的、1/2葡萄糖的、無葡萄糖的都有出現(xiàn)發(fā)黃腐爛情況，而且?guī)缀醵际乔o出現(xiàn)這種情況。13天后，全葡萄糖中有一瓶出現(xiàn)類原球莖。16天后，全葡萄糖、無葡萄糖、1/2葡萄糖各有一瓶出現(xiàn)類原球莖；20天后，總共有8瓶出現(xiàn)類原球莖。有類原球莖的多為莖部，也有在整株的節(jié)間生長，長有類原球莖的苗明顯比沒有的粗壯。在菌侵染初期，莖生長情況為表面呈發(fā)黃或停止生長狀態(tài)。1.3第三批預(yù)試驗2008.10.8目的：比較在DE、DE+1%板栗水、DE+5%板栗水培養(yǎng)基中，金線蓮與JSH1、JSH4、JSH5絲核菌的共生情況。方法：將苗（全株）與絲核菌同時接到以DE為基礎(chǔ)的三種培養(yǎng)基上，觀察其共生情況。菌種：JSH1、JSH4、JSH5；培養(yǎng)基：DE、DE+1%板栗葉汁、DE+5%板栗葉汁。同時接全株苗，并在25℃光照培養(yǎng)，并以無接菌的相應(yīng)處理為對照，每處理3重復(fù)。說明：材料來源生物研究所，苗總體比較弱，就其葉色可分兩種，一種偏粉紅、一種偏綠色，稍壯些。接種時隨機，接種前對底部稍切割下，去掉黑色部分，全部無根?！?+”表示粗壯非常好；“+”表示生長良好或稍瘦弱；“”表示苗已經(jīng)變黃，或上半節(jié)枯萎下面生長；“”表示完全死亡。下述株高、鮮重、葉片數(shù)均為平均值。表1.3.1不同培養(yǎng)基中接菌金線蓮培養(yǎng)基菌種株高(cm）鮮重（g）葉片數(shù)接種當(dāng)天(10.8)兩個月后(12.7)接種當(dāng)天(10.8)兩個月后(12.7)接種當(dāng)天(10.8)兩個月后(12.7)DEJSH13.0166674.9583330.126667未統(tǒng)計24.375JSH42.0583335.0985350.1166671.749754.208333JSH52.1916674.7166670.131.750254.541667CK2.4443.6330.1433332.5534.833333DE+1%板栗葉汁JSH11.8555565.5150.14666723.666667JSH41.2333333.780.081.3333.333333JSH51.4111115.780.1211111.8894CK1.5444443.550.1566671.442.888889DE+5%板栗葉汁JSH11.5222223.9430.1355561.5563.166667JSH41.2555563.1330.151.7782.5JSH51.2111113.450.0933331.443.5CK1.1777783.010.1044441.443.055556表1.3培養(yǎng)基菌種株高差葉片差營養(yǎng)根差氣生根只差原球莖差兩個月之差DEJSH11.9431.8330.1671.6670.667JSH43.0422.4320.0911.8180.5JSH52.5282.250.1671.5830.044CK1.1861.5610.8891.5560DE+1%板栗葉汁JSH13.6641.6670.51.3330.833JSH42.5472.00301.2221.556JSH54.3692.1101.6670.778CK2.0061.4490.3330.7780DE+5%板栗葉汁JSH12.4181.583培養(yǎng)基顏色過深看不清11.429JSH41.8740.8450.6670.667JSH52.2392.060.80.6CK1.8321.8931.2220Duncan法培養(yǎng)基平均株高(cm）差異顯著性0.01DE+1%板栗葉汁4.656ADE4.601BDE+5%板栗葉汁3.384C培養(yǎng)基平均葉片數(shù)差異顯著性0.01DE4.49ADE+1%板栗葉汁3.472BDE+5%板栗葉汁3.125C菌種平均株高(cm）差異顯著性0.01JSH14.805AJSH54.649BJSH44.003CCK3.398D菌種平均葉片數(shù)差異顯著性0.01JSH54.0139AJSH13.7361ABCK3.6852ABJSH43.3472B結(jié)論：供試培養(yǎng)基和供試菌種均對金線蓮影響明顯。不同菌種對金線蓮的影響差異明顯。接菌的金線蓮生長快，旺盛，均比對照株高。此外，板栗葉汁可能通過影響菌的生長來影響共生體系的建立。DE+5%板栗葉汁的培養(yǎng)基中，菌生長較旺盛，類原球菌出現(xiàn)時間均比DE、DE+1%板栗葉汁早，但存活率比其它兩者低，這可能與菌侵染強度有關(guān)。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，真菌的生長和侵染速度適度，就容易與金線蓮建立共生體系；過弱侵染速度緩慢，建立的共生時間長；過強侵染激烈，會增加金線蓮的死亡率。因而還需要進(jìn)一步的試驗以探明菌的最適合生長速度。1.4正式實驗方法：將苗去掉上端，莖分成上莖與下莖兩部分，接到不同培養(yǎng)基中，每瓶一株苗，即只有一個上莖與一個下莖。觀察幾個單因素對原球莖產(chǎn)生的影響，每個水平4瓶。除了考慮各因素外，其余都是（1/2PDA,25ml,中光,同時接菌，葡萄糖）。說明:"++"表示保持綠色；“+”表示綠中帶黃；“”表示黃中帶綠；“”表示死亡。原球莖只算能辨別清的，那些辨不清是否原球莖的白點不計算。表1.4.1各因素對金線蓮生長及共生的影響觀察時間12.8因素水平編號生長狀況死亡株數(shù)原球莖接種時間61/++202/03/++04+/031/702/+03/04/031/+102+/+03/+061++/+002++/+03+/+04+/+0菌種JSH11/++402/+03/04/0JSH21+/102++/++03/++04++/++0JSH41/602+/03/04+/0JSH51/702/03/+04/0接上表培養(yǎng)基量40ml1+/+402/03/+04/050ml1/502/03/04/0培養(yǎng)基DE1+/++002++/++1/03++/++0/14++/++1/0MS1/502+/+03/04+/0碳源蔗糖1/202+/03/+04+/0乳糖1/602/+03/04/0淀粉1/+602/03/04/0甘露醇1/+502/03/+04/0無糖不過濾1/702/+03/0無糖過濾1/502+/03/0接上表光照中1/602/03/04/0強1/502/03+/04/0弱1/802/03/04/0說明：現(xiàn)階段主要是進(jìn)行單因素實驗，以便探明各因素對金線蓮與真菌共生的影響。此次實驗死亡率太高，可能是由于菌種變異引起的。1.5正式實驗2方法：將苗去掉上端，莖分成上莖與下莖兩部分，接到不同培養(yǎng)基中，每瓶4個莖節(jié)，（大部分是兩個上莖兩個下莖）觀察幾個單因素對原球莖產(chǎn)生的影響，每個水平3瓶。除了考慮各因素外，其余條件都是：DE,30ml,中光,同時接菌，葡萄糖。表1.5因素水平平均原球莖數(shù)平均出芽率平均出葉芽率平均芽高菌種JSH10.7542.6666666670.733333JSH40.753.66672.3333333330.6JSH50.83333.33332.6666666670.433333培養(yǎng)基量及培養(yǎng)基40ml0.666731.3333333330.66666750ml0.41672.51.50.560ml0.58332.33331.3333333330.5666671/2PDA0.16672.666720.533333接種時間60.52.66670.6666666670.730.58332.333310.866667+30.666743.51.4+60.37532.51.1碳源蔗糖0.75310.566667葡萄糖1.253.66672.6666666670.766667乳糖0.22222.51.50.75甘露醇0.75331.5可溶性淀粉0.5210.833333光強強光1.16673.66672.3333333330.933333弱光0.666720.6666666670.666667苗品種0201（云南）0.08332.666720.4666670401（臺灣）0.752.666721.20701(雜交種）0.833343.3333333330.633333Duncan法比較不同因素對金線蓮生長狀態(tài)影響因素平均數(shù)差異顯著性0.01菌種2.5833A苗品種1.7194B接種時間1.6161B碳源1.5611B光強1.5125B培養(yǎng)基量及培養(yǎng)基1.2979B結(jié)論：不同菌種對金線蓮生長及共生體系的建立的影響具有統(tǒng)計學(xué)意義，對比其它5種因素差異顯著。但還需要繼續(xù)觀察，以得出更科學(xué)合理的結(jié)論。附：金線蓮組培苗與真菌的共生圖片左圖為金線蓮形成類原球莖，右圖為對照左圖為類原球莖分化出芽，右圖為類原球莖再增值左圖為類原球莖分化為苗2、不同基質(zhì)上金線蓮與真菌的共生2.1移栽苗目的：比較在不同基質(zhì)中金線蓮與JSH1、JSH4、JSH5絲核菌的共生情況。方法：先將已生根的組培苗種植在兩種基質(zhì)上，10天后拔出，挑選生長良好的苗稱鮮重后重新種回去，每盆兩株，編號。同時把染有絲核菌的板栗葉按照3~8g每盆（板栗葉有些濕潤有些干燥）放在培養(yǎng)基里，接觸到苗的根部，絲核菌已生長5天并產(chǎn)生了菌核，并設(shè)兩種對照。說明：對照CK1表示不接菌不放板栗葉子CK2表示不接菌但放同樣重量的板栗葉子?；|(zhì)1：泥炭：沙子：蛭石=4：1：2；基質(zhì)2:泥炭：椰松=3:2?！?+”表示粗壯非常好；“+”表示生長良好或稍瘦弱；“”表示苗已經(jīng)變黃，或上半節(jié)枯萎下面生長；“”表示完全死亡表2.1還沒接菌組培苗種植在兩種基質(zhì)上10天后的存活率接菌前10天后基質(zhì)株數(shù)存活半活死亡存活率備注140322680%總的狀態(tài)比基質(zhì)1好240341585%表2.2下表不同基質(zhì)不同菌種金線蓮生長共生情況基質(zhì)菌編號接種當(dāng)天2個月后生長狀況生長狀況總原球莖數(shù)總死亡率1JSH1A+/++++/++133.33%B+/+++/C+/+/JSH4A+/+/+4B+/+++/++C+/++/+JSH5A+/+/+3B+/+++/C+/+++/++CK1A+/+/0B+/+++/+C+/++/CK2A+/++/0B++/+/C+/+/++2JSH1A+/+++/++418.75%B+/+++/+C+/+++/++JSH4A+/+++/4B+/++/C+/++++/++JSH5A+/++/+2B+/++++/C+/+++/++CK1A+/+/++0B+/+/+C+/+++/++CK2A+/+++/++0B+/+++/+C+/+++/++結(jié)果：基質(zhì)1的存活率為66.67%，萌芽率為16.71%；基質(zhì)2的存活率為81.25%；從苗的生長情況看，基質(zhì)2生長要好許多，從萌芽率來說，基質(zhì)1要高一些。附：移栽苗圖片左圖為長有類原球莖的共生苗移栽，右圖為對照上圖為組培苗移栽到含有真菌的基質(zhì)中二、菌根真菌組織學(xué)觀察材料：制作徒手切片，采用第二批實驗的共生苗，分1節(jié)、2莖間、3原球莖下部、4原球莖上部四個部位，用美蘭、番紅染色。左圖為番紅染色下的菌絲結(jié)，右圖為對照左圖為美蘭染色下的菌絲，右圖為對照結(jié)果：近節(jié)、節(jié)和原球莖里均有菌絲或菌絲團，有部分菌絲團溶解，這與文獻(xiàn)共生情況符合，其他部位及對照沒有。結(jié)論：絲核菌可能是從節(jié)或切口外皮層細(xì)胞進(jìn)入皮層細(xì)胞，進(jìn)而與金線蓮形成共生。菌絲團溶解為植物提供營養(yǎng)，進(jìn)而促進(jìn)苗生長成健壯的植株。三、菌根真菌重分離與鑒定3.1絲核菌的分離材料：上述移栽苗金線蓮方法：沖凈泥土，用滅菌刀切取一小段含類原球莖金絲蓮莖節(jié)，把莖節(jié)在0.1%升汞浸泡30s~60s，95%酒精浸泡3~5s，無菌水沖洗3次后，切取莖節(jié)部分約5mm，放置在含100U/mL硫酸鏈霉素的PDA平板上，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌絲生長后，菌落直徑約3cm時，再從菌絲前沿切取5mm置于新的PDA平板中央培養(yǎng)。3.2絲核菌培養(yǎng)性狀的觀察方法：將待測菌株在上述PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)2d后，用打孔器在培養(yǎng)皿菌落邊緣處切取長寬各為4mm的菌絲塊，移入PDA平板中央，28℃下培養(yǎng)，3個重復(fù)，每隔24h觀察1次菌落的生長情況，記錄菌落直徑、顏色及產(chǎn)菌核時間，菌核顏色變化情況。表3.菌種時間菌落直徑直徑平均值菌落顏色產(chǎn)菌核時間JSH11天后3.9977785.298乳白色8天后2天后6.598889JSH41天后3.7266675.012乳白色8天后2天后6.297778JSH51天后3.8922225.249乳白色8天后2天后6.606667Duncan法菌種平均數(shù)差異顯著性0.05JSH45.298AJSH15.249AJSH55.012A3.3絲核菌菌絲的觀察及其直徑的測量方法：絲核菌在PDA平板上，28℃條件下，培養(yǎng)兩天后鏡檢觀察分枝角度、是否有隔膜，并測量菌絲直徑：用鑷子或解剖針挑一小塊菌絲，放在載玻片上，滴上乳酸石碳酸，在顯微鏡下測量菌絲直徑，每菌株隨機測量3處。表3.菌種時間菌絲直徑直徑平均值隔膜分枝角度JSH11天后2.0444442.144444有直角2天后2.244444JSH41天后2.1777782.505556有直角2天后2.833333JSH51天后2.0555562.105556有直角2天后2.155556Duncan法菌種平均數(shù)差異顯著性0.05JSH42.5056AJSH12.1444AJSH52.