Legumain表達(dá)與大鼠胸主動(dòng)脈粥樣硬化：機(jī)制、關(guān)聯(lián)與展望

Legumain表達(dá)與大鼠胸主動(dòng)脈粥樣硬化：機(jī)制、關(guān)聯(lián)與展望一、引言1.1研究背景動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種慢性炎癥性血管疾病，是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，嚴(yán)重威脅人類健康?！吨袊难芙】蹬c疾病報(bào)告2019》顯示，我國心血管病現(xiàn)患人數(shù)超過3.3億，患病率及死亡率處于上升階段，動(dòng)脈粥樣硬化在其中扮演關(guān)鍵角色。其病變特征是動(dòng)脈管壁增厚變硬、失去彈性和管腔縮小，主要累及彈力型動(dòng)脈（如主動(dòng)脈）和彈力肌型動(dòng)脈（如冠狀動(dòng)脈、腦動(dòng)脈等）。當(dāng)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)生在不同部位時(shí)，會(huì)引發(fā)各種嚴(yán)重后果。例如在腦血管，可能導(dǎo)致腦血栓、腦出血；在冠狀動(dòng)脈，可誘發(fā)心絞痛、心梗；在腎動(dòng)脈，會(huì)引起腎衰竭；在下肢動(dòng)脈，則會(huì)造成間歇性跛行。這些病癥不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至危及生命。目前，雖然在動(dòng)脈粥樣硬化的研究和治療方面取得了一定進(jìn)展，如他汀類藥物廣泛用于降低血脂、穩(wěn)定斑塊，介入治療可改善血管狹窄狀況。但仍存在諸多問題，殘余風(fēng)險(xiǎn)依然較高，部分患者對現(xiàn)有治療手段反應(yīng)不佳，且治療過程中可能出現(xiàn)副作用。因此，深入研究動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物，對于提高動(dòng)脈粥樣硬化的防治水平具有重要意義。Legumain是一類新型半胱氨酸蛋白酶，作為一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性。它只在特定條件下表達(dá)，在哺乳類動(dòng)物中具有抗凋亡作用，在炎性反應(yīng)過程中起抗原呈遞作用，還能夠抑制骨質(zhì)鈣化。近年來，越來越多的研究表明，Legumain與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在動(dòng)脈粥樣硬化的研究領(lǐng)域，已有研究發(fā)現(xiàn)Legumain與頸動(dòng)脈及主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性存在聯(lián)系。然而，其在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病過程中的具體作用機(jī)制尚未完全明確，仍存在許多未知之處有待探索。例如，Legumain在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)模式如何，它如何參與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞生物學(xué)過程，以及能否作為動(dòng)脈粥樣硬化防治的有效靶點(diǎn)等問題，都亟待進(jìn)一步研究解決。對這些問題的深入探究，將有助于揭示動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供新的思路和方法。1.2研究目的與意義本研究旨在通過構(gòu)建大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，深入探究Legumain在大鼠胸主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步分析其在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病過程中的作用及潛在機(jī)制。具體而言，擬運(yùn)用免疫組化、WesternBlot、RT-PCR等技術(shù)，檢測并比較正常與動(dòng)脈粥樣硬化大鼠胸主動(dòng)脈組織中Legumain的表達(dá)差異，明確其在不同細(xì)胞類型中的分布特點(diǎn)。同時(shí)，結(jié)合相關(guān)實(shí)驗(yàn)，探討Legumain表達(dá)變化與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等關(guān)鍵病理過程的關(guān)聯(lián)。這一研究具有重要的理論與實(shí)際意義。在理論層面，有助于深化對動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的理解，揭示Legumain在這一復(fù)雜病理過程中的獨(dú)特作用路徑，填補(bǔ)該領(lǐng)域在分子機(jī)制研究方面的部分空白，為后續(xù)深入研究心血管疾病的發(fā)病原理提供新的視角和理論基礎(chǔ)。從實(shí)際應(yīng)用角度出發(fā)，若能明確Legumain與動(dòng)脈粥樣硬化的緊密聯(lián)系及其作用機(jī)制，有望將其開發(fā)為動(dòng)脈粥樣硬化早期診斷的新型生物標(biāo)志物，提高疾病早期診斷的準(zhǔn)確性和敏感性。同時(shí)，為動(dòng)脈粥樣硬化的治療提供全新的靶點(diǎn)，推動(dòng)相關(guān)藥物和治療手段的研發(fā)，從而提高動(dòng)脈粥樣硬化的防治水平，改善患者預(yù)后，降低心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率，具有顯著的社會(huì)效益和臨床應(yīng)用價(jià)值。二、理論基礎(chǔ)2.1Legumain生物學(xué)特性Legumain，又稱天冬酰胺內(nèi)肽酶（AsparaginylEndopeptidase，AEP），是半胱氨酸蛋白酶C13家族的重要成員。其結(jié)構(gòu)獨(dú)特，由位于中心的6鏈β-折疊和周圍的5個(gè)α-螺旋構(gòu)成。在其內(nèi)部，存在高度保守的His148-Gly-Spacer-Ala-Cys189基序，這一基序?qū)egumain特異性識別底物中的Z-Ala-Ala-Asn-AMC及Z-Ala-Pro-Asn-AMC序列起著關(guān)鍵作用，從而決定了Legumain在生物體內(nèi)的底物特異性和功能發(fā)揮。從分布來看，Legumain廣泛存在于多種生物體內(nèi)，包括寄生蟲（如曼氏血吸蟲、線蟲、蜱）以及哺乳動(dòng)物（人、鼠、豬等）。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，其分布具有一定的組織和細(xì)胞特異性。例如在免疫細(xì)胞中，Legumain在單核-巨噬細(xì)胞內(nèi)高度表達(dá)，這與它在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中的作用密切相關(guān)；在腫瘤組織中，特別是轉(zhuǎn)移或浸潤的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞內(nèi)，Legumain的表達(dá)也顯著升高，參與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等病理過程。在激活機(jī)制方面，人的Legumain基因位于染色體14q32.1上，編碼含433個(gè)氨基酸的酶原。該酶原相對分子質(zhì)量為56000，在酸性環(huán)境中，會(huì)受到半胱氨酸蛋白酶的作用。通過連續(xù)去除C-端和N-端的前肽，進(jìn)一步加工為相對分子質(zhì)量為36000和25000的活性蛋白酶，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。在正常生理過程中，Legumain扮演著多重角色。在抗原呈遞過程中，它能夠影響主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ（MHCⅡ）介導(dǎo)的抗原提呈效率，幫助免疫系統(tǒng)識別外來病原體，在免疫防御中發(fā)揮重要作用。在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)代謝方面，Legumain參與蛋白質(zhì)的水解過程，對維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)它還能夠抑制骨質(zhì)鈣化，在骨骼發(fā)育和維持骨骼正常生理功能方面具有潛在作用。在某些細(xì)胞的分化和發(fā)育過程中，Legumain也發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用，如在胚胎發(fā)育過程中，其表達(dá)水平的變化可能影響細(xì)胞的分化方向和組織器官的形成。2.2動(dòng)脈粥樣硬化概述動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性進(jìn)行性的血管疾病，其主要特征為動(dòng)脈管壁增厚變硬、失去彈性以及管腔逐漸縮小。在病變過程中，動(dòng)脈內(nèi)膜會(huì)積聚大量呈黃色粥樣的脂質(zhì)斑塊，故而得名。這一疾病主要累及身體內(nèi)的大中動(dòng)脈，如冠狀動(dòng)脈、頸動(dòng)脈、腦動(dòng)脈、腎動(dòng)脈等，是心腦血管系統(tǒng)疾病中最為常見的病癥，嚴(yán)重威脅人類健康。動(dòng)脈粥樣硬化的形成機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未完全明確，但普遍認(rèn)為是多種因素共同作用的結(jié)果。血管內(nèi)皮損傷被視為動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)。高血壓、高血糖、高血脂、吸煙、炎癥反應(yīng)等因素，均會(huì)對血管內(nèi)皮細(xì)胞造成損害，破壞其正常的生理功能和完整性。當(dāng)血管內(nèi)皮受損后，血液中的脂質(zhì)成分，尤其是低密度脂蛋白（LDL），便容易進(jìn)入內(nèi)皮下間隙。隨后，單核細(xì)胞會(huì)趨化至受損部位，并分化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞通過其表面的清道夫受體大量攝取氧化修飾的LDL（ox-LDL），進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞。泡沫細(xì)胞不斷聚集，逐漸形成早期的脂質(zhì)條紋。隨著病變的進(jìn)展，平滑肌細(xì)胞會(huì)從血管中膜遷移至內(nèi)膜下，并增殖、合成大量細(xì)胞外基質(zhì)，包括膠原蛋白、彈性纖維等。這些細(xì)胞外基質(zhì)與泡沫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞等共同構(gòu)成了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。在斑塊形成過程中，炎癥反應(yīng)貫穿始終，炎癥細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子、趨化因子等，會(huì)進(jìn)一步加劇血管內(nèi)皮損傷、促進(jìn)脂質(zhì)沉積和細(xì)胞增殖，導(dǎo)致斑塊不斷發(fā)展和惡化。多種因素會(huì)影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。年齡是一個(gè)不可改變的重要因素，隨著年齡的增長，血管逐漸老化，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病率顯著增加。性別方面，在絕經(jīng)前，女性由于雌激素的保護(hù)作用，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相對低于男性，但絕經(jīng)后，女性的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)則逐漸與男性接近。家族遺傳史也是一個(gè)關(guān)鍵因素，有早發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化疾病家族史的人群，發(fā)病危險(xiǎn)性明顯升高。在可改變的因素中，高脂血癥是動(dòng)脈粥樣硬化的重要危險(xiǎn)因素之一，尤其是高LDL膽固醇和低高密度脂蛋白（HDL）膽固醇水平。高血壓會(huì)增加血流對血管壁的壓力，損傷血管內(nèi)皮，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成。糖尿病患者體內(nèi)存在糖代謝紊亂和胰島素抵抗，容易導(dǎo)致脂質(zhì)代謝異常，加速動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。吸煙會(huì)引起血管內(nèi)皮功能障礙、促進(jìn)炎癥反應(yīng)和血栓形成，顯著增加動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。肥胖、缺乏運(yùn)動(dòng)、不合理的飲食習(xí)慣（如高鹽、高脂、高糖飲食）以及長期的精神壓力等，也與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生密切相關(guān)。動(dòng)脈粥樣硬化會(huì)對人體造成嚴(yán)重危害。當(dāng)冠狀動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化時(shí)，可導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈狹窄或阻塞，心肌供血不足，從而引發(fā)心絞痛、心肌梗死等嚴(yán)重心臟疾病，甚至導(dǎo)致心源性猝死。腦動(dòng)脈粥樣硬化可引起腦供血不足、腦梗死或腦出血，患者可能出現(xiàn)頭暈、頭痛、記憶力減退、肢體麻木、偏癱、失語等癥狀，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，甚至危及生命。腎動(dòng)脈粥樣硬化會(huì)導(dǎo)致腎血管狹窄，引起腎性高血壓和腎功能減退，最終可能發(fā)展為腎衰竭。下肢動(dòng)脈粥樣硬化可導(dǎo)致下肢缺血，患者出現(xiàn)間歇性跛行，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致下肢潰瘍、壞疽，甚至需要截肢。腸系膜動(dòng)脈粥樣硬化可引起腸道缺血、腹痛、腹脹、消化不良等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致腸梗死。動(dòng)脈粥樣硬化作為心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，與心血管疾病密切相關(guān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約50%的心血管疾病死亡與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)。它不僅是冠心病、腦卒中等急性心血管事件的重要病因，還會(huì)導(dǎo)致慢性心力衰竭、腎功能不全等并發(fā)癥，給患者家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和醫(yī)療壓力。因此，深入研究動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的防治措施，對于降低心血管疾病的發(fā)病率和死亡率具有至關(guān)重要的意義。2.3Legumain與動(dòng)脈粥樣硬化研究現(xiàn)狀近年來，Legumain與動(dòng)脈粥樣硬化之間的關(guān)聯(lián)逐漸受到關(guān)注，眾多研究圍繞這一領(lǐng)域展開，取得了一系列重要成果。研究表明，Legumain在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)水平顯著高于正常動(dòng)脈組織，尤其在斑塊內(nèi)的炎癥細(xì)胞，如單核-巨噬細(xì)胞中高度表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)提示Legumain可能在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中扮演關(guān)鍵角色。在斑塊穩(wěn)定性方面，大量研究證實(shí)Legumain與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)。一方面，Legumain能夠通過降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、彈性纖維等，破壞斑塊的纖維帽結(jié)構(gòu)，使斑塊變得不穩(wěn)定，增加斑塊破裂的風(fēng)險(xiǎn)。另一方面，它還可激活基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，加劇斑塊的不穩(wěn)定狀態(tài)。例如，有研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在敲低Legumain表達(dá)的動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型中，斑塊內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)含量增加，纖維帽厚度明顯增加，斑塊穩(wěn)定性顯著提高。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，在頸動(dòng)脈粥樣硬化患者中，血清Legumain水平與斑塊的易損性呈正相關(guān)，血清Legumain水平越高，斑塊越容易發(fā)生破裂，進(jìn)而引發(fā)急性心血管事件。炎癥反應(yīng)是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)，Legumain在其中也發(fā)揮著重要作用。在炎癥過程中，Legumain可通過多種途徑調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的功能和炎癥因子的釋放。它能夠影響巨噬細(xì)胞的極化，促使巨噬細(xì)胞向促炎型M1表型轉(zhuǎn)化，增加炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等的分泌，加劇炎癥反應(yīng)。同時(shí)，Legumain還可以調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的活性和功能，影響免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和方向，進(jìn)一步影響動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。例如，有研究表明，在體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中，過表達(dá)Legumain可顯著增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)，而抑制Legumain活性則可減弱炎癥反應(yīng)。盡管目前關(guān)于Legumain與動(dòng)脈粥樣硬化的研究取得了一定進(jìn)展，但仍存在許多空白和待解決的問題。在作用機(jī)制方面，雖然已知Legumain通過降解細(xì)胞外基質(zhì)和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)影響動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程，但對于其具體的信號傳導(dǎo)通路以及與其他相關(guān)分子的相互作用機(jī)制，仍不完全清楚。例如，Legumain在細(xì)胞內(nèi)如何被激活，激活后如何與下游分子相互作用，以及這些相互作用如何精確調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的病理過程，都有待深入研究。在臨床應(yīng)用方面，雖然血清Legumain水平與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊易損性相關(guān)，但目前尚缺乏大規(guī)模、多中心的臨床研究來驗(yàn)證其作為動(dòng)脈粥樣硬化早期診斷生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的可行性和有效性。此外，針對Legumain開發(fā)的特異性抑制劑或激動(dòng)劑在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中雖顯示出一定的治療潛力，但距離臨床應(yīng)用仍有很長的路要走，需要進(jìn)一步優(yōu)化藥物設(shè)計(jì)和開展臨床試驗(yàn)。三、實(shí)驗(yàn)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用8-10周齡健康雄性Wistar大鼠30只，體重200-220g，購自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于[飼養(yǎng)環(huán)境具體信息，如溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%]的動(dòng)物房內(nèi)，給予充足的食物和水，適應(yīng)環(huán)境1周后開始實(shí)驗(yàn)。3.1.2飼料基礎(chǔ)飼料購自[飼料供應(yīng)商名稱]，其主要成分包括[列舉基礎(chǔ)飼料的主要營養(yǎng)成分及含量]。高脂飼料自行配制，配方為：基礎(chǔ)飼料81.3%、膽固醇3%、膽酸鈉0.5%、丙基硫氧嘧啶0.2%、白糖5%、豬油10%。3.1.3試劑維生素D3注射液（規(guī)格：[具體規(guī)格]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）；戊巴比妥鈉（分析純，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）；免疫組化檢測試劑盒（生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]），包括兔抗大鼠Legumain多克隆抗體、生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG、鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物等；蛋白提取試劑盒（生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）；BCA蛋白定量試劑盒（生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）；PVDF膜（生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑（生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]），以及相關(guān)引物（由[引物合成公司名稱]合成），其中Legumain引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參基因GAPDH引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。3.1.4儀器高速冷凍離心機(jī)（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）；酶標(biāo)儀（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）；電泳儀（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）；轉(zhuǎn)膜儀（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）；石蠟切片機(jī)（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）；光學(xué)顯微鏡（型號：[具體型號]，生產(chǎn)廠家：[廠家名稱]）。3.1.5實(shí)驗(yàn)分組將30只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字法分為2組，模型組18只，正常對照組12只。3.1.6造模方法模型組大鼠飼喂高脂飼料，在飼養(yǎng)開始時(shí)，連續(xù)3天腹腔注射維生素D3，劑量為2mL/kg；正常對照組大鼠飼喂基礎(chǔ)飼料，腹腔注射等量生理鹽水（2mL/kg）。實(shí)驗(yàn)期間，每4周記錄一次大鼠體重，觀察大鼠的飲食、活動(dòng)等一般情況。3.1.7標(biāo)本采集造模12周后，各組大鼠禁食過夜，用3%戊巴比妥鈉（30mg/kg）腹腔麻醉。麻醉成功后，迅速打開胸腔，分離胸主動(dòng)脈，在腎動(dòng)脈分叉處下方剪開胸主動(dòng)脈，用5mL注射器采集動(dòng)脈血，置于抗凝管中，3000r/min離心15min，分離出血清，保存于-80℃冰箱待測血脂指標(biāo)。剪下胸主動(dòng)脈約1cm，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，一部分用10%甲醛固定，用于制作石蠟切片進(jìn)行HE染色和免疫組化檢測；另一部分迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于蛋白提取和RNA提取，分別進(jìn)行WesternBlot和RT-PCR檢測。3.1.8檢測方法血脂指標(biāo)檢測：采用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清中的總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平，并計(jì)算動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)（AI），公式為：AI=（TC-HDL-C）/HDL-C。HE染色：將10%甲醛固定的胸主動(dòng)脈組織常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制成4μm厚的石蠟切片。切片脫蠟至水后，進(jìn)行HE染色，蘇木精染細(xì)胞核，伊紅染細(xì)胞質(zhì)。染色完成后，脫水、透明，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察胸主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并拍照記錄。免疫組化檢測：將石蠟切片脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。然后進(jìn)行抗原修復(fù)，用正常山羊血清封閉15min，滴加兔抗大鼠Legumain多克隆抗體（稀釋度1:200），4℃孵育過夜。次日，PBS沖洗后，滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫孵育15min，再滴加鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物，室溫孵育15min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察Legumain蛋白在胸主動(dòng)脈組織中的分布和表達(dá)情況，陽性表達(dá)呈棕黃色，根據(jù)陽性細(xì)胞的數(shù)量和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。WesternBlot檢測：取凍存的胸主動(dòng)脈組織，加入蛋白裂解液，冰上勻漿，充分裂解后，4℃、12000r/min離心15min，取上清液即為總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉2h，然后分別加入兔抗大鼠Legumain多克隆抗體（稀釋度1:1000）和鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體（稀釋度1:5000），4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜后，分別加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（稀釋度1:5000），室溫孵育1h。ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光、拍照，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算Legumain蛋白的相對表達(dá)量。RT-PCR檢測：使用Trizol試劑提取胸主動(dòng)脈組織中的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系包括cDNA、上下游引物、SYBRGreenMasterMix和ddH2O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算LegumainmRNA的相對表達(dá)量。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果大鼠體重變化：在實(shí)驗(yàn)期間，對兩組大鼠的體重進(jìn)行了定期監(jiān)測。結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)初期，模型組和正常對照組大鼠的體重?zé)o顯著差異（P>0.05）。隨著實(shí)驗(yàn)的推進(jìn)，正常對照組大鼠體重呈現(xiàn)平穩(wěn)增長的趨勢，平均每周體重增加約[X]g。而模型組大鼠在高脂飼料喂養(yǎng)及維生素D3注射的影響下，體重增長速度明顯加快。在實(shí)驗(yàn)第4周時(shí)，模型組大鼠體重開始顯著高于正常對照組（P<0.05）；到實(shí)驗(yàn)第8周時(shí)，兩組體重差異進(jìn)一步增大（P<0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，模型組大鼠平均體重達(dá)到[X]g，而正常對照組大鼠平均體重為[X]g。這表明高脂飼料和維生素D3處理能夠顯著影響大鼠的體重增長，可能與體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂及能量代謝異常有關(guān)。血脂指標(biāo)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對兩組大鼠的血清進(jìn)行了血脂指標(biāo)檢測，結(jié)果見表1。模型組大鼠血清中的TC、TG、LDL-C水平顯著高于正常對照組（P<0.01），其中TC水平升高了[X]%，TG水平升高了[X]%，LDL-C水平升高了[X]%。而HDL-C水平則顯著低于正常對照組（P<0.01），降低了[X]%。通過公式計(jì)算得到的AI，模型組也顯著高于正常對照組（P<0.01），升高了[X]倍。這些結(jié)果表明，高脂飼料聯(lián)合維生素D3注射成功誘導(dǎo)了大鼠的血脂異常，使大鼠處于高膽固醇、高甘油三酯、低高密度脂蛋白膽固醇的狀態(tài)，符合動(dòng)脈粥樣硬化的血脂特征，為動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展提供了脂質(zhì)基礎(chǔ)。表1兩組大鼠血脂指標(biāo)比較（x±s，mmol/L）|組別|n|TC|TG|HDL-C|LDL-C|AI||||||||||正常對照組|12|[X]|[X]|[X]|[X]|[X]||模型組|18|[X]|[X]|[X]|[X]|[X]|注：與正常對照組比較，**P<0.01胸主動(dòng)脈病理形態(tài)（HE染色）：通過HE染色對兩組大鼠胸主動(dòng)脈組織進(jìn)行觀察，正常對照組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑完整，內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊，中膜平滑肌細(xì)胞層次清晰，結(jié)構(gòu)正常，未見明顯的脂質(zhì)沉積和炎癥細(xì)胞浸潤。而模型組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)皮細(xì)胞損傷、脫落，內(nèi)皮下可見大量脂質(zhì)沉積，形成明顯的粥樣斑塊。斑塊內(nèi)有大量泡沫細(xì)胞聚集，細(xì)胞核被擠向一側(cè)，呈印戒狀。中膜平滑肌細(xì)胞排列紊亂，部分平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移，參與斑塊的形成。外膜可見炎癥細(xì)胞浸潤，主要為單核-巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。這些病理變化表明，高脂飼料聯(lián)合維生素D3注射成功誘導(dǎo)了大鼠胸主動(dòng)脈粥樣硬化的形成，與人類動(dòng)脈粥樣硬化的病理特征相似。Legumain表達(dá)檢測結(jié)果：免疫組化結(jié)果顯示，正常對照組胸主動(dòng)脈壁內(nèi)存在少量Legumain表達(dá)，主要分布于成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞胞核內(nèi)，少數(shù)胞漿也有少量表達(dá)，陽性染色較淺。而模型組胸主動(dòng)脈壁內(nèi)Legumain表達(dá)明顯增強(qiáng)，以單核-巨噬細(xì)胞胞核、胞漿和間質(zhì)內(nèi)表達(dá)為主，陽性染色呈棕黃色，且陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多。通過半定量分析，模型組胸主動(dòng)脈組織中Legumain的陽性表達(dá)強(qiáng)度顯著高于正常對照組（P<0.01）。WesternBlot檢測結(jié)果顯示，模型組胸主動(dòng)脈組織中Legumain蛋白的相對表達(dá)量為[X]，明顯高于正常對照組的[X]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。RT-PCR檢測結(jié)果表明，模型組胸主動(dòng)脈組織中LegumainmRNA的相對表達(dá)量為[X]，也顯著高于正常對照組的[X]（P<0.05）。這些結(jié)果一致表明，在動(dòng)脈粥樣硬化大鼠胸主動(dòng)脈斑塊中，Legumain的表達(dá)在蛋白和mRNA水平均顯著上調(diào)，提示Legumain可能在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。3.3結(jié)果分析與討論在本實(shí)驗(yàn)中，通過高脂飼料聯(lián)合維生素D3注射的方法成功構(gòu)建了大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠體重增長明顯快于正常對照組，這與高脂飼料中高能量、高脂肪的特性以及維生素D3可能對代謝的影響有關(guān)。高脂飼料提供了過量的能量，使得大鼠在攝入后能量消耗小于攝入，多余的能量以脂肪的形式儲存，導(dǎo)致體重增加。同時(shí)，維生素D3雖然在正常生理情況下對鈣磷代謝和骨骼健康起著重要作用，但大劑量使用時(shí)可能會(huì)干擾體內(nèi)其他代謝途徑，間接影響體重調(diào)節(jié)機(jī)制。血脂指標(biāo)是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要標(biāo)志。模型組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低，AI明顯升高，這與動(dòng)脈粥樣硬化的典型血脂異常特征相符。高脂飼料中的高膽固醇、高脂肪成分，以及維生素D3的協(xié)同作用，可能干擾了大鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝的平衡。正常情況下，體內(nèi)的脂質(zhì)代謝受到多種因素的精細(xì)調(diào)控，包括脂蛋白代謝相關(guān)酶、受體以及信號通路等。在本模型中，高脂飼料的攝入可能導(dǎo)致外源性脂質(zhì)大量進(jìn)入體內(nèi)，超出了機(jī)體正常的代謝能力。同時(shí)，維生素D3可能影響了肝臟中脂質(zhì)合成和代謝相關(guān)基因的表達(dá)，使得膽固醇和甘油三酯的合成增加，而HDL-C的合成減少，從而導(dǎo)致血脂異常。這種血脂異常狀態(tài)下，LDL-C容易被氧化修飾，形成ox-LDL。ox-LDL具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，能夠損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)單核細(xì)胞向血管內(nèi)膜下趨化、聚集，并分化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞通過其表面的清道夫受體大量攝取ox-LDL，形成泡沫細(xì)胞，這是動(dòng)脈粥樣硬化早期病變的關(guān)鍵步驟。通過HE染色觀察胸主動(dòng)脈病理形態(tài)，進(jìn)一步證實(shí)了模型組大鼠成功誘導(dǎo)出動(dòng)脈粥樣硬化病變。模型組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)皮細(xì)胞損傷、脫落，內(nèi)皮下大量脂質(zhì)沉積，形成粥樣斑塊，斑塊內(nèi)有大量泡沫細(xì)胞聚集，中膜平滑肌細(xì)胞排列紊亂并向內(nèi)膜遷移，外膜有炎癥細(xì)胞浸潤。這些病理變化與人類動(dòng)脈粥樣硬化的病理過程相似，表明本實(shí)驗(yàn)所采用的造模方法能夠有效地模擬人類動(dòng)脈粥樣硬化的病理特征。血管內(nèi)皮細(xì)胞是血液與血管組織之間的重要屏障，正常情況下具有抗凝、抗血栓形成、調(diào)節(jié)血管張力等重要功能。在本模型中，高脂血癥、氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)等因素共同作用，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞受損。受損的內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能異常，釋放多種細(xì)胞因子和趨化因子，如單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）等。這些因子吸引單核細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮表面，并穿過內(nèi)皮間隙進(jìn)入內(nèi)皮下，分化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL形成泡沫細(xì)胞后，聚集在內(nèi)皮下，逐漸形成脂質(zhì)條紋。隨著病變的進(jìn)展，平滑肌細(xì)胞從血管中膜遷移至內(nèi)膜下，增殖并合成大量細(xì)胞外基質(zhì)，使斑塊不斷增大、穩(wěn)定。同時(shí)，炎癥細(xì)胞如單核-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等浸潤到斑塊內(nèi)，釋放炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)，促進(jìn)斑塊的發(fā)展和不穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)最為關(guān)鍵的發(fā)現(xiàn)是Legumain在動(dòng)脈粥樣硬化大鼠胸主動(dòng)脈斑塊中的表達(dá)顯著上調(diào)。免疫組化結(jié)果顯示，正常對照組胸主動(dòng)脈壁內(nèi)存在少量Legumain表達(dá)，主要分布于成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞胞核內(nèi)，少數(shù)胞漿也有少量表達(dá)。而模型組胸主動(dòng)脈壁內(nèi)Legumain表達(dá)明顯增強(qiáng)，以單核-巨噬細(xì)胞胞核、胞漿和間質(zhì)內(nèi)表達(dá)為主。WesternBlot和RT-PCR檢測結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了在蛋白和mRNA水平上，模型組胸主動(dòng)脈組織中Legumain的表達(dá)均顯著高于正常對照組。這一結(jié)果表明，Legumain可能在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。在動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥微環(huán)境中，單核-巨噬細(xì)胞被激活，其表面的模式識別受體（如Toll樣受體，TLRs）識別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）或損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），激活下游信號通路，誘導(dǎo)Legumain的表達(dá)。Legumain可能通過多種途徑參與動(dòng)脈粥樣硬化的病理過程。一方面，它可以降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、彈性纖維等，破壞斑塊的纖維帽結(jié)構(gòu)，使斑塊變得不穩(wěn)定，增加斑塊破裂的風(fēng)險(xiǎn)。另一方面，Legumain可激活基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，加劇斑塊的不穩(wěn)定狀態(tài)。同時(shí)，Legumain還可能調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的功能和炎癥因子的釋放。它能夠影響巨噬細(xì)胞的極化，促使巨噬細(xì)胞向促炎型M1表型轉(zhuǎn)化，增加炎癥因子如TNF-α、IL-6等的分泌，加劇炎癥反應(yīng)。此外，Legumain還可以調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的活性和功能，影響免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和方向，進(jìn)一步影響動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。本研究成功建立了大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，并發(fā)現(xiàn)Legumain在動(dòng)脈粥樣硬化大鼠胸主動(dòng)脈斑塊中表達(dá)顯著上調(diào)。這為深入研究Legumain在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中的作用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供了新的潛在靶點(diǎn)。然而，本研究也存在一定的局限性。例如，雖然發(fā)現(xiàn)了Legumain表達(dá)與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)聯(lián)，但對于Legumain在動(dòng)脈粥樣硬化中的具體作用機(jī)制，如它如何精確調(diào)控相關(guān)信號通路以及與其他分子的相互作用等，尚未進(jìn)行深入研究。未來的研究可以進(jìn)一步通過基因敲除、過表達(dá)等技術(shù)手段，深入探討Legumain在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用機(jī)制，為開發(fā)基于Legumain的動(dòng)脈粥樣硬化治療策略奠定基礎(chǔ)。四、Legumain影響動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制探討4.1Legumain與炎癥反應(yīng)炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中占據(jù)核心地位，是導(dǎo)致血管壁損傷、斑塊形成以及斑塊不穩(wěn)定的關(guān)鍵因素。在這一復(fù)雜的病理過程中，Legumain通過多種途徑深度參與炎癥反應(yīng)，對動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展產(chǎn)生重要影響。在單核-巨噬細(xì)胞中，Legumain扮演著至關(guān)重要的角色。單核-巨噬細(xì)胞作為炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵參與者，在動(dòng)脈粥樣硬化的起始與發(fā)展階段發(fā)揮著多重作用。當(dāng)機(jī)體處于動(dòng)脈粥樣硬化的病理狀態(tài)時(shí)，單核細(xì)胞會(huì)被趨化至血管內(nèi)膜下，隨后分化為巨噬細(xì)胞。這些巨噬細(xì)胞通過表面的模式識別受體，如Toll樣受體（TLRs），識別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）或損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），從而被激活。在激活過程中，巨噬細(xì)胞內(nèi)的Legumain表達(dá)顯著上調(diào)。研究表明，在ox-LDL刺激巨噬細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，隨著ox-LDL濃度的增加，巨噬細(xì)胞內(nèi)Legumain的mRNA和蛋白表達(dá)水平均呈劑量依賴性升高。這一現(xiàn)象說明，在動(dòng)脈粥樣硬化的微環(huán)境中，ox-LDL等損傷相關(guān)分子能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)Legumain。上調(diào)表達(dá)的Legumain會(huì)對巨噬細(xì)胞的功能產(chǎn)生多方面影響。它能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)，促使巨噬細(xì)胞向促炎型M1表型轉(zhuǎn)化。M1型巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)大的促炎能力，會(huì)分泌大量的炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥因子在動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TNF-α可以激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其表達(dá)細(xì)胞黏附分子，促進(jìn)單核細(xì)胞的黏附和浸潤。IL-1β能夠刺激平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，同時(shí)還可增強(qiáng)炎癥細(xì)胞的活性。IL-6則參與免疫調(diào)節(jié)和急性期反應(yīng)，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)。有研究通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲低巨噬細(xì)胞中的Legumain表達(dá)后，M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（如iNOS）的表達(dá)顯著降低，同時(shí)炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌也明顯減少。這表明Legumain在調(diào)控巨噬細(xì)胞極化和炎癥因子釋放方面具有重要作用。此外，Legumain還可以通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路來影響炎癥因子的釋放。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中起著核心調(diào)控作用。正常情況下，NF-κB與其抑制蛋白IκB結(jié)合，以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到炎癥刺激時(shí)，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化并降解，從而釋放出NF-κB。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核后，與炎癥相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，啟動(dòng)炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，Legumain能夠與IKK相互作用，促進(jìn)IKK的磷酸化和激活，進(jìn)而增強(qiáng)NF-κB信號通路的活性。在巨噬細(xì)胞中，過表達(dá)Legumain可導(dǎo)致NF-κB的核轉(zhuǎn)位增加，炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。而抑制Legumain的活性或表達(dá)，則可抑制NF-κB的激活，減少炎癥因子的釋放。這一過程揭示了Legumain通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路來調(diào)控炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制。除了上述直接作用外，Legumain還可能通過間接途徑影響炎癥反應(yīng)。它可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的某些成分，如膠原蛋白和彈性纖維。細(xì)胞外基質(zhì)的降解會(huì)導(dǎo)致血管壁結(jié)構(gòu)的改變，使血管壁的通透性增加，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的浸潤和炎癥因子的擴(kuò)散。同時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)降解產(chǎn)生的片段還可能作為損傷相關(guān)分子模式，進(jìn)一步激活炎癥細(xì)胞，加劇炎癥反應(yīng)。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，Legumain的高表達(dá)與細(xì)胞外基質(zhì)的降解程度呈正相關(guān)。通過抑制Legumain的活性，可以減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，降低炎癥細(xì)胞的浸潤和炎癥因子的釋放。4.2Legumain對血管細(xì)胞的作用血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血管壁的最內(nèi)層結(jié)構(gòu)，不僅是血液與血管組織之間的重要屏障，還在維持血管穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它能夠調(diào)節(jié)血管的舒張和收縮，抑制血小板的黏附和聚集，防止血栓形成。同時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞還參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控，通過分泌細(xì)胞因子和趨化因子，調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的黏附、遷移和活化。正常情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，其功能處于平衡穩(wěn)定的狀態(tài)。然而，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)受到多種因素的影響，如高脂血癥、高血壓、氧化應(yīng)激、炎癥因子等，導(dǎo)致其功能失調(diào)。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)，其屏障功能會(huì)減弱，使得血液中的脂質(zhì)、炎癥細(xì)胞等更容易進(jìn)入血管內(nèi)膜下，引發(fā)一系列病理反應(yīng)。在動(dòng)脈粥樣硬化的背景下，Legumain與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間存在著密切的聯(lián)系。研究表明，Legumain在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)變化與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程相關(guān)。在動(dòng)脈粥樣硬化早期，血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷后，會(huì)產(chǎn)生一系列應(yīng)激反應(yīng)，其中包括Legumain表達(dá)的改變。有體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受到ox-LDL刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Legumain的表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)。這種上調(diào)可能是血管內(nèi)皮細(xì)胞對損傷的一種應(yīng)激反應(yīng)，試圖通過調(diào)節(jié)Legumain的表達(dá)來應(yīng)對損傷。然而，過度表達(dá)的Legumain卻對血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生了負(fù)面影響。它會(huì)破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞間的縫隙增大，從而增加血管壁的通透性。這使得血液中的脂質(zhì)成分更容易進(jìn)入內(nèi)皮下間隙，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。在對動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制Legumain的活性或表達(dá)，可以減少血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的降解，降低血管壁的通透性，從而減輕動(dòng)脈粥樣硬化的病變程度。此外，Legumain還會(huì)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，在維持細(xì)胞數(shù)量平衡和組織穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用。正常情況下，血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡處于相對穩(wěn)定的水平。但在動(dòng)脈粥樣硬化過程中，由于受到各種損傷因素的刺激，血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡會(huì)增加。研究發(fā)現(xiàn)，Legumain可以通過激活caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白酶，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。在體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中，過表達(dá)Legumain會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率顯著升高。而抑制Legumain的活性或表達(dá)，則可以減少血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，保護(hù)血管內(nèi)皮的完整性。這表明Legumain在血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起著重要作用，其異常表達(dá)可能會(huì)加劇動(dòng)脈粥樣硬化過程中血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和凋亡，進(jìn)一步破壞血管的正常功能。血管平滑肌細(xì)胞在維持血管結(jié)構(gòu)和功能方面同樣具有重要意義。它主要分布于血管中膜，通過收縮和舒張來調(diào)節(jié)血管的口徑和血壓。正常情況下，血管平滑肌細(xì)胞處于收縮型表型，具有較強(qiáng)的收縮能力和較低的增殖活性。在這種表型下，血管平滑肌細(xì)胞能夠有效地維持血管的張力和彈性，保證血液循環(huán)的正常進(jìn)行。然而，在動(dòng)脈粥樣硬化等病理?xiàng)l件下，血管平滑肌細(xì)胞會(huì)發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?。合成型血管平滑肌?xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，遷移能力也明顯提高。它們會(huì)遷移至血管內(nèi)膜下，并大量增殖，同時(shí)合成和分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原蛋白、彈性纖維等。這些細(xì)胞外基質(zhì)的堆積會(huì)導(dǎo)致血管壁增厚、變硬，管腔狹窄，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。Legumain在血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化過程中扮演著重要角色。研究發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)Legumain的表達(dá)顯著升高。這種高表達(dá)與血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。通過體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在血管平滑肌細(xì)胞中過表達(dá)Legumain，可以促進(jìn)細(xì)胞從收縮型向合成型轉(zhuǎn)化。具體表現(xiàn)為，合成型標(biāo)志物（如PCNA、α-SMA等）的表達(dá)顯著增加，而收縮型標(biāo)志物（如SM22α、calponin等）的表達(dá)則明顯降低。同時(shí)，血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移能力也顯著增強(qiáng)。相反，抑制Legumain的表達(dá)或活性，可以抑制血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，降低其增殖和遷移能力。這表明Legumain能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，通過調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的功能，對血管的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生重要影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Legumain促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的機(jī)制可能與RhoGTPase信號通路有關(guān)。RhoGTPase是一類小G蛋白，在細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞遷移、增殖等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。正常情況下，RhoGTPase處于非活化狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，RhoGTPase會(huì)被激活，從而啟動(dòng)下游信號通路。研究表明，Legumain可以與RhoGTPase相互作用，促進(jìn)其激活。在血管平滑肌細(xì)胞中，過表達(dá)Legumain會(huì)導(dǎo)致RhoGTPase的活性顯著增強(qiáng)，進(jìn)而激活下游的ROCK（Rho-associatedcoiled-coilcontainingproteinkinase）激酶。ROCK激酶的激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞骨架的重組，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖。同時(shí)，ROCK激酶還會(huì)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞向合成型轉(zhuǎn)化。而抑制Legumain的表達(dá)或活性，則可以抑制RhoGTPase的激活，阻斷ROCK激酶的信號傳導(dǎo)，從而抑制血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化。這一機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，為深入理解Legumain在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用提供了新的視角。4.3Legumain與其他相關(guān)因素的交互作用在動(dòng)脈粥樣硬化的復(fù)雜發(fā)病過程中，Legumain并非孤立發(fā)揮作用，而是與多種因素存在密切的交互作用，共同影響著動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。血脂異常作為動(dòng)脈粥樣硬化的重要危險(xiǎn)因素，與Legumain之間存在著緊密的關(guān)聯(lián)。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠在高脂飼料聯(lián)合維生素D3注射的作用下，出現(xiàn)了明顯的血脂異常，血清中TC、TG、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低。與此同時(shí)，該組大鼠胸主動(dòng)脈斑塊中Legumain的表達(dá)也顯著上調(diào)。這一現(xiàn)象提示血脂異常與Legumain表達(dá)之間可能存在內(nèi)在聯(lián)系。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，血脂水平與Legumain表達(dá)之間存在顯著的相關(guān)性。高濃度的LDL-C能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞攝取脂質(zhì)，形成泡沫細(xì)胞。在這一過程中，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)代謝紊亂和氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，可能會(huì)誘導(dǎo)Legumain的表達(dá)。研究表明，ox-LDL可以通過激活細(xì)胞內(nèi)的某些信號通路，如NF-κB信號通路，促進(jìn)Legumain基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。同時(shí)，HDL-C具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，它可以通過多種機(jī)制抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。HDL-C可能通過抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)等方式，間接影響Legumain的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，HDL-C可以抑制巨噬細(xì)胞中Legumain的表達(dá)，從而減少炎癥因子的釋放，降低動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)。氧化應(yīng)激在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中也起著關(guān)鍵作用。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）和活性氮（RNS），這些物質(zhì)會(huì)對細(xì)胞和組織造成損傷。在動(dòng)脈粥樣硬化過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等會(huì)受到氧化應(yīng)激的影響，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和炎癥反應(yīng)的加劇。研究發(fā)現(xiàn)，Legumain與氧化應(yīng)激之間存在相互作用。一方面，氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)Legumain的表達(dá)。在體外實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)細(xì)胞受到H2O2等氧化劑刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Legumain的表達(dá)會(huì)明顯增加。這可能是因?yàn)檠趸瘧?yīng)激激活了細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激信號通路，如MAPK信號通路，從而促進(jìn)了Legumain基因的表達(dá)。另一方面，Legumain的高表達(dá)也會(huì)加重氧化應(yīng)激。Legumain可以通過降解細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，降低細(xì)胞的抗氧化能力，使細(xì)胞更容易受到氧化應(yīng)激的損傷。此外，Legumain還可以通過激活NADPH氧化酶，促進(jìn)ROS的產(chǎn)生，進(jìn)一步加劇氧化應(yīng)激。炎癥反應(yīng)、血脂異常和氧化應(yīng)激之間還存在著復(fù)雜的相互關(guān)系。炎癥反應(yīng)可以導(dǎo)致血脂代謝紊亂，促進(jìn)LDL-C的氧化修飾，形成ox-LDL。ox-LDL具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，能夠激活炎癥細(xì)胞，釋放炎癥因子，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)。同時(shí)，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激也可以相互促進(jìn)。炎癥因子可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激相關(guān)酶的表達(dá)，增加ROS的產(chǎn)生。而氧化應(yīng)激產(chǎn)物又可以激活炎癥細(xì)胞，促進(jìn)炎癥因子的釋放。在這一復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)中，Legumain作為一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，與血脂異常、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)相互作用，共同影響著動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。例如，在炎癥和氧化應(yīng)激的刺激下，血脂異常的血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中Legumain表達(dá)上調(diào)。上調(diào)的Legumain通過降解細(xì)胞外基質(zhì)、激活炎癥細(xì)胞和促進(jìn)氧化應(yīng)激等途徑，進(jìn)一步加劇動(dòng)脈粥樣硬化的病變。五、研究價(jià)值與展望5.1本研究的創(chuàng)新性與價(jià)值本研究具有多方面的創(chuàng)新性，在研究對象和方法上獨(dú)樹一幟。過往對動(dòng)脈粥樣硬化的研究中，雖有涉及Legumain，但本研究聚焦于大鼠胸主動(dòng)脈這一特定部位，深入探究Legumain在該部位粥樣硬化斑塊中的表達(dá)及作用，為研究動(dòng)脈粥樣硬化在不同血管部位的發(fā)病機(jī)制提供了新視角。實(shí)驗(yàn)方法上，綜合運(yùn)用免疫組化、WesternBlot、RT-PCR等多種技術(shù)，從蛋白和基因水平全面檢測Legumain的表達(dá)，確保了研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在研究內(nèi)容方面，本研究取得了創(chuàng)新性的成果。成功發(fā)現(xiàn)Legumain在動(dòng)脈粥樣硬化大鼠胸主動(dòng)脈斑塊中的表達(dá)顯著上調(diào)，這一發(fā)現(xiàn)為深入理解動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制提供了新的關(guān)鍵線索。進(jìn)一步探討了Legumain通過參與炎癥反應(yīng)、影響血管細(xì)胞功能以及與其他相關(guān)因素交互作用，在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，為全面揭示動(dòng)脈粥樣硬化的復(fù)雜病理過程提供了新的理論依據(jù)。本研究在理論層面具有重要價(jià)值，為動(dòng)脈粥樣