DB4103T 192-2025羊肚菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.20CCSB394103IDB4103/T192—2025本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本文件由洛陽市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出并歸口。本文件起草單位：洛陽師范學(xué)院、洛陽市農(nóng)林科學(xué)院、嵩縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心、澗西區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局、洛陽五丈山農(nóng)業(yè)科技公司、洛陽飛振農(nóng)業(yè)科技有限公司。本文件主要起草人：韓建明、史明艷、吳孔陽、張延召、郭立、付鵬程、周曉君、王育娜、李金博、易力、范一霖、張向月、王帥兵、張健、謝劉振、劉大齊。DB4103/T192—20251羊肚菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了洛陽市羊肚菌菌種生產(chǎn)的設(shè)施設(shè)備、母種制作、原種和栽培種制作、檢測、菌種標識及儲藏、對照留樣檢測。本文件適用于羊肚菌母種、原種、栽培種生產(chǎn)技術(shù)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4806.7食品安全國家標準食品接觸用塑料材料及制品NY/T528食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程NY/T1284食用菌菌種中雜菌及害蟲的檢驗3術(shù)語與定義本文件沒有可界定的術(shù)語和定義。4設(shè)施設(shè)備4.1菌種生產(chǎn)應(yīng)選擇地勢高，通風(fēng)良好，空氣清新，水源近，排水通暢，交通便利的場所。菌種生產(chǎn)廠房應(yīng)有各自隔離的攤曬場、原材料庫、配料分裝庫。配套有配料室、攪拌室、裝袋（瓶）室、滅菌室、冷卻室、接種室、培養(yǎng)室（通風(fēng)好，有紗窗）、菌種檢測室及菌種冷藏庫等各環(huán)節(jié)的設(shè)施，應(yīng)符合NY/T4.2菌種生產(chǎn)需要粉碎機、電子秤、攪拌機、裝袋（瓶）機、高壓滅菌鍋或常壓滅菌鍋、超凈工作臺或接種箱、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)架、搖床、顯微鏡等設(shè)備，應(yīng)符合NY/T528規(guī)定。5母種制作5.1培養(yǎng)基推薦使用以下配方：5.2容器DB4103/T192—202525.3分裝培養(yǎng)基至分裝試管1/4～1/5處，用棉塞或硅膠塞封閉試管口，每5支試管為1把，用牛皮紙包扎，橡皮筋扎緊，棉塞向上放置。棉塞應(yīng)采用梳棉。5.4滅菌滅菌完成后自然降壓，待降溫至（65±5）℃時取出試管，在空氣清潔的室內(nèi)擺斜面，要求斜面長度不超過試管長度的2/3。5.5滅菌效果檢查冷卻后抽取3%～5%的試管，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48h后無微生物長出的為滅菌合格。5.6接種選擇經(jīng)過出菇試驗的優(yōu)良菌株進行接種。接種環(huán)境溫度要求18℃以下。在超凈工作臺或接種箱內(nèi)接種。接種前用紫外燈照射30min，之后用75%酒精進行表面消毒。接種過程嚴格執(zhí)行無菌操作，接種后及時貼好標簽并做好記錄。5.7培養(yǎng)溫度控制在16℃~18℃,避光培養(yǎng)。接種后第3d、第5d和長滿培養(yǎng)基后分別進行檢驗，挑出未活、污染和生長不良的不合格試管。5.8檢測培養(yǎng)好的母種應(yīng)經(jīng)過交配型基因檢測和出菇試驗，檢測不合格的不得使用。交配型基因檢測方法見附錄A，出菇試驗檢測見附錄B。5.9感官要求母種感官要求見附錄C。6原種和栽培種制作經(jīng)過檢測的母種進行生產(chǎn)性原種制作。6.1制作流程培養(yǎng)料配制→裝瓶/袋→滅菌→冷卻→接種→培養(yǎng)→成品。6.2培養(yǎng)料配方推薦使用以下配方：3DB4103/T192—20256.3培養(yǎng)料配制6.3.1泡發(fā)小麥水里加2%的生石灰，沒過小麥10cm,水溫在20℃左右泡發(fā)時間30h左右，保證小麥完全泡發(fā)飽滿，無白芯。泡后把石灰沖洗干凈。6.3.2玉米芯或棉籽殼發(fā)酵使用生石灰及麩皮發(fā)酵腐熟，發(fā)酵后若發(fā)臭或者有干芯的禁止使用。6.3.3培養(yǎng)料混合將泡發(fā)好的小麥+發(fā)酵后的玉米芯（棉籽殼與配方中石灰粉、石膏等其他原料攪拌均勻，控制含水量65%左右。6.4裝袋（瓶）6.4.1原種裝瓶采用850mL以下、瓶口直徑小于等于4cm、耐126℃高溫的近透明塑料瓶子或玻璃瓶。6.4.2栽培種裝袋（瓶）采用同原種要求相同的瓶子，也可采用折徑為（15～17）cm×（33～35）cm耐126℃高溫的聚丙烯塑料袋。6.4.3裝袋（瓶）要求裝袋（瓶）后要求培養(yǎng)料上表面距瓶（袋）口距離（50±5mm便于后續(xù)套套環(huán)、封口等操作，然后放入專用滅菌筐內(nèi)。每袋（瓶）裝培養(yǎng)基質(zhì)500g～600g。各類容器都應(yīng)使用棉塞或窩口海綿塞封口，也可用能滿足濾菌和透氣要求的無棉蓋體套環(huán)封口。以上聚丙烯塑料袋均符合GB4806.7要求。6.5滅菌采用高壓滅菌或常壓滅菌。原種和栽培種按每次滅菌數(shù)量隨機抽取1%作為樣品，挑取培養(yǎng)料顆粒經(jīng)無菌操作接種于置于PDA培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48h后無微生物長出的為滅菌合格。6.6接種接種環(huán)境溫度要求18℃以下?？刹捎贸瑑艄ぷ髋_、層流罩、接種箱接種。提前采用臭氧和紫外線雙重殺菌完成接種室的滅菌消殺工作，消殺時間不低于10h。接種時須關(guān)閉紫外燈，接種人員更換工作服、戴口罩，將預(yù)冷后的菌種送入接種室，用75%的酒精把原種及接種鉤等進行消毒。每支母種接種6瓶6.7培養(yǎng)接種完成后送至菌種培育室，培育室溫度設(shè)定16℃~18℃左右，培養(yǎng)20d～25d左右至菌絲長滿。培育室注意遮光，在外界溫度低于18℃時進行通風(fēng)。7檢測DB4103/T192—20254原種和栽培的檢測方法同5.8，感官要求見附錄C。雜菌檢測按NY/T1284規(guī)定的方法檢驗菌種的雜菌。8菌種標識及儲藏4℃,避光，適當(dāng)通風(fēng)，定期對空間進行殺菌處理。同時做好生產(chǎn)各環(huán)節(jié)詳細記錄。9對照留樣檢測各級菌種都應(yīng)留樣備查，按批隨機抽取樣品留存，抽樣量分別為該批培養(yǎng)量的1%，每批抽樣數(shù)量母種不少于1支、原種不少于5瓶、栽培種不少于10袋，保存于潔凈的1℃~4℃冷庫中。同批次栽培種還必須同時留樣出菇驗證。DB4103/T192—20255（資料性）交配型基因檢測（參考）交配型基因檢測步驟如下：a)用CTAB法提取待測菌種的菌株總DNA作為PCR擴增模板；b)以引物對MAT1-1L/MAT1-1R（MAT1-1L:5′-TTACCTTA-AATGCAAGTAGGTGTCATTC-3′)進行PCR擴增，獲得預(yù)期0.7kb的唯一條帶的菌株，說明含有MAT1-1′-GTATTATCACCAACCGTAGC-3′)進行PCR擴增，獲得預(yù)期0.4kb的唯一條帶的菌株，說明含有MAT1-2交配型基因；c)PCR擴增體系：2×PCRmix12.5μL，5μM的正反向引物各1μL，DNA模板20ng，ddH2O補足至25μL；e)若只檢測到MAT1-1交配型和MAT1-2交配型中的任一種交配型的菌株，說明出菇能力較差或不能出菇；若檢測到MAT1-1交配型和MAT1-2兩種交配型的菌株，說明具有出菇能力。DB4103/T192—20256（資料性）菌種出菇試驗將被檢母種先后制作成原種和栽培種，每個菌種栽培面積≥3m2，至少設(shè)置3個隨機小區(qū)重復(fù)，進行常規(guī)種植管理。記錄母種、原種和栽培長滿所需時間，出第一潮菇所需時間和產(chǎn)量，總產(chǎn)和平均產(chǎn)量，第一潮菇菇形、色澤、質(zhì)地，菌蓋和菌柄的長短等指標，統(tǒng)計檢驗結(jié)果。同時將該母種的出發(fā)菌株設(shè)為對照，做同樣處理。對比二者的檢驗結(jié)果，以時間計的檢驗項目中，被檢母種的任何一項時間校對照菌株推遲5天以上（含5天）者，為不合格；產(chǎn)量顯著低于對照菌株者，為不合格；菇體外觀形態(tài)與對照明顯不同或畸形者，為不合格。DB4103/T192—20257（資料性